Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l'analyse de l'ARN

Résumé

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Résumé

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Introduction

La prostate est un tissu hétérogène composée d'épithélium sécrétoire disposé dans acini glandulaires entouré par stroma fibromusculaire composée principalement de muscle lisse ^1. Le compartiment épithélial est composé de cinq différents types de cellules, mais organisés: cellules basales, les cellules sécrétoires, les cellules neuroendocrines, cellules amplificatrices de transit et les cellules souches ^2. Dans cancer de la prostate (CaP), qui provient des cellules épithéliales luminales, la croissance de l'adénocarcinome provoque une baisse progressive évidente du compartiment stromal ^3. Pour ces raisons, les échantillons de tissus auront des différences distinctes dans la proportion et le type de stroma des cellules épithéliales en fonction de l'étendue de la PCa. Ces différences peuvent conduire à des hypothèses biaisées des données d'expression génique acquis à partir de tissus entiers sans égard à la microdissection du type de cellule souhaité. Par conséquent, pour éliminer ce biais, il est essentiel de séparer les types de cellules avant l'extraction de l'ARN etanalyse de l'expression génique.

Macrodissection microdissection ou peuvent être utilisés pour séparer physiquement les régions epitheliales bien caractérisés du stroma entourant ^{4 -6.} Macrodissection est généralement fait avec une lame de rasoir sous un microscope de dissection et fonctionne bien pour séparer grande CaP nodules de stroma, mais ne sont pas capables d'éliminer l'épithélium bénin du stroma entourant (voir l'exemple de bénigne de la prostate histologie à la figure 1). Microdissection avec un laser (LCM) est nettement plus de travail que macrodissection, mais peut disséquer de façon très précise l'épithélium bénigne ^4.

Publications récentes de notre laboratoire ont montré que l'ARN peut être extrait avec succès par LCM soit de paraffine (FFPE) biopsies fixés au formol ou tissu congelé ^4,7-9. Les principaux défis dans l'extraction LCM-ARN sont 1) de disséquer avec précision les zones souhaitées du tissu, et 2) de préserver RL'intégrité NA ^4,10 au cours de la processus de LCM et l'isolement. ARN isolé à partir des populations de cellules pures peut être utilisé pour l'analyse de l'expression génique par plusieurs méthodes comprenant la transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) ^7,8, microarray ^11, et ^{12 à 14} -sequencing profond.

L'objectif de ce protocole est d'isoler l'ARN total de LCM prostate épithélium du tissu congelé pour analyse l'expression des gènes en aval.

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Protocole

Tous les tissus humains utilisés pour ces expériences ont été acquises via un protocole et / ou exemption Institutional Review Board a approuvé à l'Université de l'Illinois à Chicago.

1. L'article frais congelé prostate sur PEN-toboggan et sur Charged Glisser verre

1. Le jour avant ou quelques heures avant le sectionnement de l'échantillon, des outils propres (c.-à-pinceau, la pince, coplins, des lames, des diapositives PEN-encadrés (si pas déjà RNase), un marqueur de ETOH fort et d'un crayon) et l'intérieur d'un RT cryostat avec une solution RNase-décontaminer l'aide d'un flacon pulvérisateur et Lab-lingettes.
   1. Laisser la solution de RNase-décontamination reposer pendant 5 min avant essuyant, rincer à l'depcH ₂ 0 pour supprimer gauche sur la solution et un rinçage final avec 70% EtOH (préparé avec depcH ₂ 0) RNase-décontamination.
      Remarque: Il est essentiel de maintenir un espace de travail sans RNase. Tous coplins, outils, milieu de montage congelés, des lames et des diapositives utilisées doivent être utilisés uniquement pour la RNase travail libreet jamais utilisé dans un environnement libre standard non-RNase. Tous les instruments doivent être traités avec une solution de décontamination RNase avant chaque expérience.
2. Cryostat Refroidir à -24 ° C.
3. Placez les instruments nettoyés sans RNase suivants intérieur cryostat pour refroidir au moins 30 min avant la coupe: toboggan Coplin remplie avec 100% d'éthanol, les outils, les petites cassettes de tissus congelés et le mandrin de montage.
4. Récupérer le tissu de la prostate congelé de cryoconservation et le lieu en une mousse seau sec rempli de glace pour le transport. Placez le tissu dans cryostat à équilibrer cryostat à température pendant au moins 30 min.
   Remarque: les tissus de la prostate humaines pour laser capture microdissection peuvent être soit frais congelé ou fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Les contraintes de temps et de préparation des lames sont légèrement différentes entre les sources de tissus. Nous décrivons ici les étapes de coupes congelées.
5. Travailler avec un tissu à la fois, et gicler milieu de montage congelé dans le bottom de la cassette et monter rapidement le tissu de la prostate congelées dans le milieu de montage à l'aide des pinces congelés réfrigérés.
6. Placez la cassette avec le tissu sur refroidisseur en cryostat pendant 5 min à mettre en milieu de montage congelé.
7. Appliquer une petite quantité de milieu de montage congelé sur le mandrin et appuyez avec précaution sur le tissu monté côté bas en haut sur le support de montage congelé. Laisser reposer dans le cryostat pendant 5 min pour permettre au milieu de montage congelés se solidifier complètement.
8. Placez le mandrin dans le support et serrer.
9. Verrouiller la poignée en position verrouillée et placez une nouvelle lame sur le cryostat. Pour extrémités moléculaires en aval qui incluent une étape d'amplification (c.-à-qPCR), il est conseillé d'utiliser une nouvelle lame pour chaque patient afin de prévenir la contamination (ou déplacer la lame sur pour utiliser la zone de la lame pour l'échantillon suivant).
10. Déverrouillez la poignée et faire progresser attentivement le tissu à la main ou avec une pédale pour égaliser et exposer le tissu avec 50 μdes sections de m jusqu'à ce que l'exposition de tissu désiré est atteint.
11. Réglez cryostat à 5 pm, couper une ou deux sections et les placer sur lame de verre facturé pour hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration (voir étape 2).
12. Immédiatement placer la lame dans le froid éthanol à 100% pendant 2 min.
13. Retirer la lame de verre chargée de l'éthanol et le laisser sécher à la température ambiante avant de procéder à coloration H & E (étape 2).
14. Placez RT PEN-cadre diaporama sur un support de cadre.
15. Réglez cryostat à 10 sections um et placer sur les lames de trame RT PEN. Une à quatre sections peut être placé sur chaque coulisseau fonction de la taille des tissus.
16. Immédiatement plonger la lame dans le froid éthanol à 100% pendant 2 min.
17. Retirez les diapositives PEN-cadre de l'éthanol et de stocker la diapositive dans une boîte de diapositives dans une boîte de dessiccateur dans un -80 ° C au congélateur jusqu'au moment de LCM. Trois jours est la durée maximale de stockage pour la récupération de l'ARN optimale.
18. Passez à l'étape 2 pour SEULEMENT le verre chargée glissae. Passez à l'étape 3 pour PEN-cadre diapositive.

2. hématoxyline et l'éosine-Y (H & E) pour les taches histologique Mark-up

Note: Cette si pour le tissu sur la lame de verre armé, pas la diapositive PEN-cadre pour LCM.

1. Hydrater les sections sur la lame de verre chargée plongeant le glisser à travers l'éthanol classés comme suit: plonger la lame deux fois dans l'éthanol 100% pendant 3 min, deux fois en éthanol à 95% pendant 3 min, une fois dans éthanol à 70% pendant 3 minutes et deux fois distillée H _{2 O} pour 3 min.
   1. Préparer une solution d'alcool de l'acide: 99 ml éthanol à 70% + 1 ml de HCl 1% et une solution de bicarbonate de sodium à 0,1%: 0,1 g de bicarbonate de sodium dans 100 ml _de H 2 O distillée,
2. Plonger la lame dans hématoxyline Gill II (0,4%) pendant 5 min.
3. Lavez tout surplus tache dans la course constante prise H _{2 O} pendant 3 min.
4. Plonger la lame 10 fois dans l'alcool acide
5. Laver la lame dans le robinet coule H _{2 O} pendant 3 min.
6. Plonger la lamedans une solution de bicarbonate de sodium à 0,1% pour 30 à 60 secondes pour mettre la couleur pourpre au bleu.
7. Laver la lame dans le robinet coule H _{2 O} pendant 3 min.
8. Rincer la lame à 95% d'éthanol avec 10 trempettes.
9. Plonger la lame dans les temps Eosine-Y 2-3 pour un total de 15 sec.
10. Déshydrater le glisser à travers l'éthanol classés comme suit: plonger la lame deux fois dans l'éthanol 95%, deux fois dans l'éthanol 100%, et deux fois dans le xylène (assurez-vous que le tissu semble clair qui indique la déshydratation approfondie).
11. Montez la lame avec non aqueux dur milieu de montage et lamelle permanente.
12. Laissez la lame sèche pendant 30 min.
13. Numériser diapositives avec un scanner de diapositives ensemble et imprimer une grande image à haute résolution sur 8 "x 11".
14. Outline zones d'intérêt (généralement effectuées par un pathologiste certifié conseil) avec un marqueur. Ce balisage est le guide de la procédure de LCM.

3. Bleu de Toluidine Coloration des diapositives PEN-cadre

Remarque: Thest se fait le même jour que le LCM. Utilisez depcH _{2 O} de l'eau pour toutes les solutions. Terminez toutes les étapes de zone de libre-RNase. Tous coplins doivent être nettoyés avec une solution RNase-décontamination.

1. Le jour de LCM supprimer les diapositives PEN-cadre de -80 ° C congélateur et hydrate par diapositives plongeant doucement dans 90% EtOH pendant 2 min puis EtOH à 75% pendant 2 min.
   1. Préparer 0,5% de bleu de toluidine par dissolution dans l'eau moléculaire de qualité biologie puis filtrer à travers un filtre stériliser et stocker 0,2 um à TA. Cette solution peut être réutilisée pour un maximum de 6 mois. Remarque: Il est fortement conseillé de préparer la solution avant que la filtration peut prendre quelques heures.
2. Colorer le tissu de la prostate en plongeant doucement glisse dans 0,5% de bleu de toluidine pour 5-30 sec. Destain le tissu par lavage glisse 2 fois dans depcH _{2 O} pendant 15 secondes suivi par 75% EtOH pendant 30 secondes à 3 minutes. Remarque: tache et Destain temps peuvent être ajustés pour assurer une bonne coloration. La prostate tend à plus de tache.
3. Transfert diapositives PEN-cadre au conteneur sec RNAase-libre sur la glace.

4. laser capture microdissection (LCM)

1. Immédiatement avant LCM, toboggan sec sur une lame chaude à 42 ° C pendant 15 min. Sec seulement la diapositive qui seront traitées et stocker le reste sur la glace jusqu'à ce que prêt pour eux.
2. Tournez sur LCM et l'ordinateur dans cet ordre, la puissance du microscope, la clé de laser, le commutateur laser, puis l'ordinateur. Lancez le logiciel microdissection laser.
3. Utilisez le logiciel pour contrôler le microscope pour charger les diapositives et les tubes de prélèvement. Cliquez sur "porte-échantillon de déchargement", charger la lame avec les sections sur le support de lame de microscope avec le tissu vers le bas et insérez le support de diapositives dans la fente appropriée dans le microscope, puis cliquez sur "Continuer".
   1. Cliquez sur "tubes de collecte de déchargement", étiquette et charger tubes de 0,5 ml sur support de tube et l'insérer dans la fente appropriée dans l'instrument. Une seul foiscapuchons sont fixés, ajouter 35 pi de tampon de lyse pour les bouchons de collecte et d'essayer d'éviter les bulles. Puis cliquez sur "OK".
      Remarque: Si l'évaporation est un problème, diluer le tampon comme suit: tampon de lyse de 25 pi avec 10 ul depcH2O.
4. Dans le logiciel, sélectionnez la position où la lame a été placée dans le support de diapositives. Sélectionnez le capuchon de recouvrement pour récupérer l'échantillon de LCM.
5. Visualisez et concentrer le glisser à travers l'ordinateur à 10X. Utilisez le logiciel pour calibrer le laser en sélectionnant "Laser", puis "calibrer". Réglez la puissance, ouverture et la vitesse du laser, en sélectionnant "laser" puis "commande" pour permettre au faisceau laser pour couper la zone sélectionnée complètement et efficacement. Répétez jusqu'à ce que les ajustements des découpes au laser complètement à travers le tissu.
6. Utilisation du pathologiste majoration 8 "x 11" comme un guide, utilisez l'outil "dessiner la forme" de circonscrire les zones souhaitées de épithéLIUM dans la vue et éviter toute collecte stroma.
   Remarque: Les zones multiples peuvent être sélectionnées dans une seule vue, mais ne se déplacent pas à une autre vue sans la première coupe en cliquant sur la fonction "couper la forme".
   1. Si une zone ne soit pas complètement coupée par le laser utiliser l'outil "déplacer et couper" pour aller sur manuellement. Continuer déplacer l'objectif de nouveaux points de vue et répéter la découpe laser jusqu'à ce diaporama est complètement disséqué ou la quantité désirée de tissu a été collecté (typiquement 100 glandes bénignes produisent 150-500 ng d'ARN). (voir l'exemple de la figure 1A).
7. Retirez délicatement les tubes de la titulaire de la collecte et de fermer les bouchons, en étant conscient de la tampon de lyse et de tissus dans les bouchons. Centrifuger brièvement pendant 30 s pour recueillir le liquide et le tissu dans le fond du tube. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 30 min et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'isolement de l'ARN.

5. ARN isolement total avec un FilKit base-ter et de l'analyse de la qualité

1. Décongeler les tubes sur de la glace et pour apporter le volume de la solution à 100 ul.
2. Pré-mouiller le micro-filtre d'un kit d'isolement d'ARN en appliquant 30 ul ofLysis Solution au centre du filtre et laisser tremper whileperforming les deux prochaines étapes (au moins 5 min).
3. Ajouter 3 pi de solution LCM Additif (fourni dans le kit) au lysat et mélanger au vortex pendant 5 sec. Centrifuger pendant 30 s pour recueillir le liquide au fond du tube.
4. Centrifuger le filtre de pré-humidifié pour ~ 30 secondes à la vitesse supérieure pour enlever le liquide.
5. Ajouter 1,25 volumes (dans ce cas 129 pi) de 100% d'éthanol dans le mélange de lysat, doucement vortex ou d'une pipette de haut en bas. ** Cette méthode va récupérer les deux espèces, grandes et petites ARN.
6. Charger l'échantillon sur le micro-filtre préhumidifié, et centrifuger à 10 000 g pendant 1 min à se lier à l'ARN du filtre. Puis, lavez micro filtre avec 180 pi de "solution de lavage 1, R21; centrifuger à 10.000 xg pendant 1 minute.
   Note: De ce point sur toutes les centrifugations devrait être fait à 13.000 xg, ou la vitesse maximale.
7. Laver le filtre deux fois avec 180 pi de "Les solutions de lavage 2 et 3", respectivement comme indiqué par le protocole de la trousse. Centrifugeuse pendant 30 secondes, puis défaussez l'écoulement à travers, et tourner le filtre pendant 1 min pour éliminer le liquide résiduel et sécher le filtre.
8. Transfert filtre à un nouveau tube collecteur.
9. Solution chaude d'élution à -95 ° C (fourni avec le kit).
10. Appliquer 10 pi de solution d'élution préchauffé au centre du filtre, fermer le couvercle et les stocker pendant 5 min à température ambiante. Puis centrifuger pendant 1 min pour éluer l'ARN, et répétez cette étape une fois pour obtenir ~ 20 pi d'ARN.
11. Effectuer le traitement DNase I pendant 15 min à 37 ° C.
12. Quantifier l'ARN par spectrophotomètre avec l'absorbance à 260 nm. Le rapport de la densité optique aux longueurs d'onde de 260 nm et 280 nm est utilisée pour évaluer la pureté del'ARN (voir le tableau 1) ^15.

6. Gene Expression Analysis

Note: L'expression des gènes d'espèces d'ARN longs (comme ARNm et lncRNAs) est affiché à l'étape 6.1 et espèces d'ARN courts (comme microARN) est représenté dans l'étape 6.2. Différents kits sont disponibles pour la RT-qPCR et la quantité d'ARN nécessaire varie selon le kit (aussi peu que 10 ng). Analyse de séquençage de l'ARN est décrit dans le 6.3.

1. Transcrire inverse (RT) de l'ARN de l'ADNc de 5 ul de mélange 20 ng / pl d'ARN de l'échantillon 5 ul du mélange maître RT (RT-tampon, des dNTP, des amorces aléatoires, RT enzyme, un inhibiteur de RNase). Incuber le mélange réactionnel pendant 25 min à 25 ° C, puis 120 minutes à 37 ° C et 5 min à 85 ° C.
2. Diluer la réaction RT à 1:10 avec RNase eau libre et utiliser 2,5 pi par 10 pi de réaction qPCR avec des amorces ou des ensembles amorce / sonde pour les gènes d'intérêt.
   Note: Pour faciliter l'analyse de l'ARN partiellement dégradé Il est conseillé d'utiliser des amorces for amplicons courts (moins de 100 pb) ^16. (Tableau 2B)
   1. Pour l'analyse de l'expression de microARN exécuter la réaction de RT en mélangeant 5 pi de 2-10 ng / ul échantillon d'ARN avec 5 pi de mélange maître RT.
      Remarque: chaque technologie de détection de microARN disponible dans le commerce basé sur la PCR nécessite l'utilisation d'amorces spécifiques et exclusifs RT.
3. En variante ou en plus de la RT-PCR, en utilisant le séquençage de la prochaine génération (ARN-seq-ARN ou petit-seq) pour quantifier les différentes espèces d'ARN. Typiquement, en utilisant 500 ng d'ARN pour cette procédure (tableau 3) et réaliser le procédé comme indiqué par le fabricant de l'instrument et de détection.

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Résultats

Dans une étude précédente, nous avons démontré l'utilisation de LCM pour recueillir des tissus épithéliaux et stromales de comparer le profil d'expression par RT-PCR quantitative de l'ARNm et microARN de tissus de la prostate et FFPE congelés provenant du même patient ^4. LCM est chronophage, en particulier si grande quantité d'ARN doivent être collectées pour l'analyse de séquençage de nouvelle génération. Par conséquent, il est essentiel de garder à l'espace de trava...

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Discussion

Profil d'expression génique à partir de spécimens humains peut être difficile, non seulement pour la qualité ou la quantité de tissus disponibles, mais aussi pour les différentes entités histologiques présents dans un échantillon de tissu donné. Cela est particulièrement difficile dans la prostate dans laquelle tissus bénins sont en grande partie des tissus et des domaines du cancer stromales sont dépourvues de stroma. LCM facilite la séparation physique de la prostate stroma et épithélium de l'...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111