Un air sec Chromosome Dropping rapide Méthode de préparation adéquate pour les poissons dans les usines

Résumé

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Résumé

Préparation des étalements de chromosomes est une condition préalable à l'exécution réussie de hybridation in situ en fluorescence (FISH). Préparation des chromosomes de la plante spreads de haute qualité est difficile en raison de la paroi cellulaire rigide. L'un des procédés approuvés pour la préparation des chromosomes de la plante est une préparation dite chute, également connu en tant que goutte d'étalement ou d'une technique de séchage par air. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation rapide du chromosome mitotique propage approprié pour la détection du poisson de sondes d'ADN copie unique et haute. Cette méthode est une variante améliorée de la méthode de la goutte sécher à l'air réalisée sous une humidité relative de 50% -55%. Ce protocole comprend un nombre réduit d'étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. Avantages évidents de cette approche sont bien étalées, chromosomes métaphasiques endommagées et de nombreux siégeant en tant que condition préalable idéale pour l'analyse FISH succès. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu chrome de haute qualitéOSOME spreads et les résultats de FISH reproductibles pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.

Introduction

Hybridation fluorescente in situ (FISH) est un outil efficace pour la cartographie physique des séquences à copie unique et élevés au niveau chromosomique. La condition préalable est la préparation du chromosome spreads de haute qualité. Il n'y a pas chromosome protocole général de préparation qui serait également approprié pour des cellules animales et végétales. Préparation des chromosomes de plantes est particulièrement difficile en raison de la paroi cellulaire rigide et divers de consistance à l'intérieur du cytoplasme des espèces différentes. L'un des procédés avantageux pour la préparation des chromosomes de la plante est une technique dite chute aussi connu comme technique d'étalement de goutte-et séchage à l'air technique ^1,2. Cette méthode a été introduite en 1958 par Rothfels et Siminovitch pour in vitro des cellules de mammifères cultivées ^3. Plus tard, Martin et al. ⁴ et Kato et al. ⁵ adapté cette méthode pour les plantes.

Plus récemment, une méthode nommée 'SteamDrop &N ° 39; a été développé qui utilise de la vapeur d'eau pour la préparation de chromosomes ⁶ ne se chevauchent pas. Bien que, l'influence positive de l'humidité élevée a été observée plus tôt ^7, 'SteamDrop' délivre un flux contrôlé de chromosomes préparations de haute qualité ^6. Le traitement à la vapeur provoque l'étirement des chromosomes probablement liées à des modifications des protéines chromosomiques. La qualité des spreads résultant de métaphase est très élevé, bien que retenue du nombre suffisant de métaphase complète propage pour des expériences de FISH ultérieures exige une expertise technique.

Nous présentons ici un protocole pour la préparation des chromosomes de céréales mitotiques appropriés pour la détection du poisson de sondes simples et copies élevé ^5,8. Cette méthode est une variante perfectionnée du procédé de coulée sécher à l'air décrite par Kato ⁹ réalisé sous une humidité relative de 50% à 55% (Figure 1). Ce protocole comprend un nombre réduitdes étapes de lavage rendant son application facile, efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, nous avons obtenu des étalements de chromosomes de haute qualité et les résultats de poisson pour Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum et Secale céréale.

Protocole

1. Préparation Chromosome

1. La germination des graines et la fixation des extrémités des racines
   1. Germer les graines d'orge 10-20 sur deux couches de papier filtre humide dans une boîte de Petri dans des conditions sombres pendant 2 jours à 22-24 ° C. Couper les racines vigoureuses avec la longueur de 1-2 cm de la graine en utilisant une lame de rasoir.
   2. Préparez de l'eau glacée en plaçant une bouteille en verre de 500 ml contenant de l'eau froide du robinet dans l'eau glacée écrasé. Aérer l'eau glacée et plongez pointes des racines pendant 20 heures pour augmenter la fréquence des cellules en métaphase.
   3. Transfert des racines de l'eau à 50 ml d'éthanol: acide acétique (3: 1) pour les fixer fixateur à température ambiante pendant 2 jours. Racines de magasins dans un éthanol fraîchement préparé: acide acétique (3: 1) fixateur à 4 ° C jusqu'à utiliser jusqu'à un an.
2. Traitement de lavage et l'enzyme
   1. Laver les 10-20 racines avec 30 ml d'eau du robinet glacée pendant 5 min à deux reprises en utilisant un bêcher de 50 ml en verre. Utilisez microscope binoculaire. Transfert racines un par un dans30 ml 0,01 M de tampon citrate (0,01 M d'acide citrique 0,01 M + citrate de sodium, pH 4,8) en utilisant des pinces et laver en secouant le récipient en verre pendant 5 minutes deux fois. Placez les racines sur du papier filtre pour éliminer le liquide complètement et de coupure tissu non méristématique indésirable en utilisant une lame de rasoir.
   2. Incuber jusqu'à 20 pointes des racines dans le mélange de l'enzyme de 1 ml à 37 ° C pendant environ 50 min pour adoucir le tissu végétal (tableau 1) dans un verre de montre. Enzyme mélange contient 0,7% de cellulase R10, 0,7% de cellulase, une pectolyase% et 1% cytohelicase dilué dans du tampon 0,01 M de citrate. Conserver le mélange d'enzymes à -20 ° C et réutilisé jusqu'à cinq fois.
   3. Retirer l'enzyme par pipetage et laver les pointes des racines sur la glace avec 5 ml 0,01 M de tampon citrate à deux reprises pour remplacer l'enzyme résiduelle.
3. Racine macération
   1. Laver les pointes des racines avec 1 ml éthanol à 96% deux fois soigneusement dans le même verre de montre. Remplacer éthanol avec fraîchement préparé fixateur (75% d'acide acétique: 25% d'éthanol). Utilisez 10-15fixateur pi par extrémité de la racine.
   2. Transfert des conseils profondes conjointement avec le fixateur dans un tube de 2 ml et se désintègrent méristèmes de racine avec une aiguille ou une pince de dissection. Appuyez sur le tube 20 fois pour remettre en suspension les cellules pour obtenir une suspension cellulaire. Conservez la suspension de cellules à -20 ° C jusqu'à deux mois.
4. Goutte de la suspension cellulaire
   1. Placez 2-3 couches de mouchoir en papier imbibé d'eau sur une plaque chauffante à 50 ° C. Immerger les lames microscopiques dans l'eau du robinet glacé dans le réfrigérateur pendant 30 min. Et le lieu glisse sur le dessus du tissu de papier humide.
   2. Pipette 7-10 ul de suspension cellulaire et déposez-le à partir d'une distance de 20 cm sur la lame refroidi placé sur la plaque chaude. Pipette 10 ul de mélange acide acétique-éthanol sur la même place que la suspension de cellules sur la lame et maintenir la lame sur la plaque chaude pour supplémentaire de 2 min. Placer la lame sur la plaque chauffante, sans le tissu humide et laisser sécher pendant 1 min.
5. Contrôle de la qualité et de boîte de glissières
   1. Vérifiez diapositives à l'aide d'un microscope à contraste de phase pour contrôler la qualité de la propagation de chromosome. Utilisez des lames soit le même jour ou dans un magasin par immersion dans 96% d'éthanol dans une jarre de Coplin à -20 ° C.
6. Le prétraitement des diapositives avant FISH; toutes les étapes sont réalisées à température ambiante
   1. Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant 50 ml de 2x SSC (20x SSC contient 3 M de NaCl et 300 mM de citrate trisodique) pendant 5 min. En utilisant des pinces, des diapositives de transfert d'une jarre de Coplin contenant 50 ml d'acide acétique à 45% pour les 3-10 min.
   2. Transfert glisse à une jarre de Coplin contenant 50 ml de 2x SSC pendant 10 min. Diapositives de transfert à une jarre de Coplin contenant 50 ml de formaldéhyde à 4% (en 2x SSC) et plonger diapositives pour 10 min de fixer chromosomes.
   3. Retirer le formaldéhyde en rinçant les diapositives 3 fois pendant 4 min chacune, dans une jarre de Coplin contenant 50 ml 2x SSC. Déshydrater les lames dans une jarre de Coplin pendant 2 minutes dans la série de 70%, 90% et 100% d'éthanol, et coulisse respectivement à la verticale secsposition.

2. hybridation fluorescente in situ (FISH)

1. Pour chaque lame, préparer une solution d'hybridation de 20 ul au total en utilisant 10 ul de formamide désionisé, 5 pi de tampon 4 x d'hybridation (tampon de 200 ul contenant 80 ul de 20 x SSC, 8 pi de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 1,6 pi de 0,5 M EDTA, 11,2 pi 10 ug / ul sperme de saumon et de l'eau libre de DNase 99,2 pi), 3 pi de la sonde et 2 ld'eau exempte de DNase.
2. Ajouter 20 ul de solution d'hybridation par lame et le couvercle avec une lamelle de 24 x 32 mm et d'arrêter la lamelle avec du ciment de caoutchouc. Dénaturer diapositives avec des sondes simultanément à 80 ° C pendant 2 min sur une plaque chauffante.
3. Transfert lames dans une chambre humide et incuber diapositives à 37 ° CO / N évitant la lumière. Retirer lamelles en rinçant les lames dans une jarre de Coplin avec 2x SSC. Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant 55-60 ° C SSC 2x et incuber pendant 20 min.
4. Placer les lames à 2x SSC dans une jarre de Coplin pendant 2 min à température ambiante. Déshydrater les lames dans une jarre de Coplin pendant 2 minutes dans la série de 70%, 90% et 100% d'éthanol, respectivement.
5. Air-sécher les diapositives et de contraste avec 1 pg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) dans antifade milieu de montage, éviter la lumière intense.

3. Analyse microscopique et stockage

1. Analyser les lames en utilisant un microscope à épifluorescence. La sélection de filtre dépend du fluorochrome utilisé pour le marquage de la sonde. Si nécessaire, conserver les lames à 4 ° C dans des conditions sombres jusqu'à un an.

Résultats

Lames microscopiques avec les écarts de métaphase de mitose ont été préparés par la méthode rapide de l'air sec chute chromosome préparation décrit ci-dessus (Suppl. Figure 1). Analyse FISH a été réalisée en utilisant les deux, des séquences répétitives et une seule copie. Les images ont été obtenues par un microscope à épifluorescence avec un ensemble de filtres permettant d'excitation des fluorophores et correspondant captés par la caméra CCD monochrome une haute sensibil...

Discussion

L'expérience de préparation du chromosome a été réalisée en utilisant jeunes racines de céréales appartenant à la famille des graminées (Poaceae). Toutes les espèces analysées ont 14 chromosomes métaphasiques relativement longue de la mitose (11-15 um) dans l'ensemble du génome diploïde et appartiennent à des espèces grand génome (05.01 à 07.09 GBP).

Longueur des racines germées était pas plus de 2 cm pour obtenir un maximum de tissu méristématique. La synchron...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hot Plate	MEDAX GmbH	12603
Cellulase R10	Duchefa	C8001
Cellulase	CalBioChem	219466
Pectolyase	Sigma	P3026
Cytohelicase	Sigma	C8274
Texas Red-12-dUTP	Invitrogen	C3176	direct fluorochrome
Fluor488-5-dUTP	Invitrogen	C11397	direct fluorochrome
Fluorecsence microscope	Olympus BX61	BX61
CCD camera	Orca ER, Hamamatsu	C10600
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	fluorecsent dye