Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

Résumé

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Résumé

Le thymus, l'organe primaire pour la génération de cellules T aß et épine dorsale du système immunitaire adaptative chez les vertébrés, a longtemps été considérée comme la seule source de cellules αβT. Pourtant, involution thymique commence tôt dans la vie conduisant à une sortie considérablement réduit de cellules αβT naïfs dans la périphérie. Néanmoins, même les centenaires peuvent construire l'immunité contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Des recherches récentes suggèrent le développement des cellules αβT extrathymique, mais notre compréhension des voies qui peuvent compenser la perte de la fonction thymique sont encore rudimentaire. cellules γδ T sont des lymphocytes innées qui constituent le principal sous-ensemble de cellules T dans les tissus. Nous avons récemment attribué une fonction exceptionnelle jusqu'ici incompris à un sous-ensemble de cellules T de γδ en montrant que l'entité rare de CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ cellules T peuvent transdifférencier dans les cellules αβT dans des conditions inflammatoires. Ici, nous pournir le protocole pour l'isolement de cette ancêtre du sang périphérique et sa culture subséquente. Vδ1 cellules sont positivement enrichis à partir de PBMC de donneurs humains en bonne santé en utilisant des billes magnétiques, suivie d'une deuxième étape dans laquelle nous ciblons la fraction rares ^des cellules CD4 + avec une technique de marquage magnétique plus loin. La force magnétique de la deuxième étiquetage dépasse celui de la première étiquette magnétique, et permet ainsi l'isolement positif efficace, quantitative et spécifique de la population d'intérêt. On introduit ensuite l'état de la technique et de la culture requise pour le clonage et efficacement l'expansion des cellules et pour l'identification des clones générés par analyse FACS. Ainsi, nous fournissons un protocole détaillé pour la purification, de la culture et de l'expansion ex vivo ^de cellules CD4 + Vδ1 ⁺ yô Les cellules T. Cette connaissance est une condition préalable pour des études qui se rapportent à cette αβT progenitor`s de biologie cellulaire et pour ceux qui visent à IDEntifier les déclencheurs moléculaires qui sont impliqués dans son transdifférenciation.

Introduction

Chez les vertébrés, l'immunité adaptative qui est structuré dans le cellulaire et une partie de l'immunité humorale joue un rôle majeur dans la défense contre les pathogènes. La reconnaissance d'une large gamme d'antigènes est médiée par hyperpolymorphic T et B des récepteurs de cellules (TCR / BCR), qui en ce qui concerne les cellules T sont supposés être produite principalement dans le thymus ^1. Celui-ci, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), dérivées de moelle osseuse, le thymus semences et de différencier le long étapes bien définies finalement donné lieu à toutes les lignées de cellules T. Thymus progéniteurs ensemencement sont CD4 ^- et CD8 ^- et constituent donc la immature, double négatif (DN) fraction de thymocytes. Thymus signaux dérivés induisent alors leur engagement lignée et de la différenciation en soit des cellules T aß ou yô. L'expression de TCR-y et TCR-ô gènes de chaîne fonctionnellement réarrangés en DN2 / 3 thymocytes conduit à y δTCR complexes, qui entraînent une de prolifération cellulaireD promouvoir la différenciation en cellules γ de ^2,3 AT. En revanche, le réarrangement d'une chaîne TCR-β fonctionnel, qui peut coupler avec preTα de construire un preTCR pT, induit la réduction au silence de la transcription de la chaîne TCR-γ dans les thymocytes DN3 et leur transition dans les thymocytes ^CD4 + CD8 ^{+ double-positifs} 4 . A ce stade, la recombinaison de la chaîne TCR-α se produit, la suppression du locus TCR-δ qui se niche dans le locus TCR-α, abrogeant ainsi la production d'un γδTCR dans ces cellules irrévocablement ^5-9. ΑβTCRs réarrangés sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à se lier auto-MHC faiblement (sélection positive), qui ne peut dépasser un certain seuil pour éviter l'auto-immunité (sélection négative). Selon leur capacité de liaison I ou II du CMH de classe, les cellules αβT sélectionnés développer en cellules simple positif ^CD4 + ou ^T CD8 +, qui sortent du thymus lymphocytes T naïfs que.

Cependant, l'involution du thymus commence tôt dans la vie conduisant à exponentiellement réduit la production de cellules T naïves qui est presque éteinte post-adolescence ^10. Néanmoins, la taille du pool de cellules T reste constante tout au long de la vie, qui peut être expliqué en partie seulement par une prolifération homéostatique post-thymique des lymphocytes T et la prolifération de long vécu mémoire immunologique ^11. Par conséquent, le développement de cellules T extrathymique doit se produire. Des recherches récentes ont gagné activité importante qui a caractérisé progéniteurs des cellules αβT, qui au-extrathymique sites à donné lieu à aß fonctionnelle des cellules T ^12-17. Pourtant, les connaissances détaillées sur extrathymique précurseurs de cellules que αβT indépendant d'un thymus se différencier en cellules αβT est aussi fragmentaire que le fond que nous avons sur la route qu'ils prennent de ce fait.

Nous avons récemment identifié la petite entité T-cellule de Vδ1 ⁺ cellules CD4 ⁺ γδT comme une cellule prognitor αβT extrathymique ^18, qui, lorsqu'il est isolé à partir du sang périphérique de donneurs humains en bonne santé peut transdifférencier dans les cellules αβT dans un environnement inflammatoire doux. Il est intéressant et contraire à la prolifération homéostatique des lymphocytes T post-thymiques, transdifférenciation des Vδ1 ^cellules CD4 + génère de nouveaux récepteurs de cellules T, élargissant ainsi la diversité du répertoire, de sorte que potentiellement de nouveaux antigènes peuvent être reconnus et peut protéger l'hôte contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Cela ajoute à la plasticité des cellules T et ajoute une nouvelle voie jusqu'ici incompris pour le développement de cellules T extrathymique.

L'isolement quantitative à partir de sources lymphocytaires, la génération de clones unicellulaires et leur expansion efficace sont essentiels pour l'objectif d'identifier les marqueurs et des molécules qui déclenchent cette cellule αβT precursor`s développement extrathymique.

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Protocole

Déclaration Ethic: Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Déclaration d'Helsinki et ont été approuvés par le Comité d'éthique clinique à l'Université de Tübingen (38 projets / 2009B02 et 470 / 2013B02).

1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

1. Prendre 50-100 ml d'un volontaire en bonne santé par ponction veineuse en utilisant une seringue de 50 ml contenant 1000 UI d'héparine et sulfate diluer le sang 1: 2 avec du PBS (pH = 7,2).
2. Superposer avec précaution 35 ml de sang: la solution PBS de 15 ml de solution de séparation de sang tels que Biocoll (d = 1,077 g / ml) dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger pendant 15 min à 800 g à RT.
   REMARQUE: frein ne doit pas être utilisé.
3. Recueillir les cellules de la couche lymphocytaire avec une pipette et laver les cellules deux fois dans au moins 50 ml de PBS (centrifugation pendant 12 min; à 400 xg). Eliminer le surnageant après centrifugation avec une pipette.
4. Lyse par mise en suspension des erythrocytes restants et IncubCLASSEMENT la fraction lymphocytaire avec 1-5 ml d'une solution tampon hypotonique à 2-4 min.
   REMARQUE: La durée de l'exposition et de tampon de lyse du volume dépend du tampon de lyse utilisé et de la quantité de globules rouges restant dans la fraction des lymphocytes.
5. Diluer les cellules avec du PBS (01:10) et centrifuger à 250 g pendant 12 min et ensuite remettre en suspension et laver le culot de cellules une fois dans 10 ml de PBS à 300 xg pendant 12 min.
6. Resuspendre les lymphocytes dans du PBS et compter les cellules dans une chambre de comptage Neubauer en utilisant une solution de bleu trypan.
   NOTE: Habituellement,> 1 x 10 ⁸ lymphocytes sont reçus à partir de 100 ml fraîchement prélevé le sang périphérique.

2. Isolement des cellules T Vδ1

1. Prenez <1 x 10 ⁶ lymphocytes isolés pour une première FACS déterminer la fréquence des cellules T CD4 Vδ1.
   REMARQUE: La taille de la population de cette entité T-cellule peut varier considérablement entre les individus et selon leur état immunologique. Typicallié, environ 1% des cellules T sont Vδ1 ⁺ et environ 1-5% de Vδ1 cellules ^CD4 + sont ^+.
   1. Diluer les cellules avec 1 ml de tampon FACS, qui se compose de PBS contenant 2% de FCS et 5 mM d'EDTA. Centrifuger à 660 g pendant 2 min et décanter le surnageant. Le volume de reflux du tampon FACS environ 100 ul est suffisante pour la coloration ultérieure. Brièvement vortex et on incube les cellules avec 5 ul de réactif de blocage de Fc pendant 5 min à température ambiante pour augmenter la spécificité de la coloration FACS.
   2. Ajouter des anticorps monoclonaux humains directement aux cellules sans enlever le réactif de blocage de Fc. Assurez-vous de colorer les cellules avec des anticorps contre Vδ1 (01h50), CD3 (01h50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) et TCRaß (1:25). Préparer le contrôle isotypique avec les isotypes d'immunoglobulines correspondantes. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
   3. Laver les cellules dans 1 ml de tampon FACS (centrifuger 2 min; à 660 xg), décanter le Supernatant et procéder à l'acquisition par FACS dans le volume de tampon restant.
2. Pastiller les cellules (qui ne sont pas utilisées dans l'analyse FACS) par centrifugation pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C. Retirez le surnageant et remettre la cellule pelletin 60 pi MACS-tampon par 1 x 10 ⁷ cellules. Ajouter 20 ul de réactif de Fc-blocage par 1 x 10 ⁷ cellules et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
3. Ajouter 10 ul d'anticorps anti-humain Vδ1 conjugué au FITC pour 1 x 10 ⁷ cellules directement aux cellules. Incuber pendant 12 min à 4 ° C dans l'obscurité.
4. Laver les cellules en utilisant 14 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C). Rejeter le surnageant complètement et remettre les cellules dans 80 ul MACS tampon par 1x10 ⁷ cellules.
5. Prendre 1-2 x 10 ⁵ cellules et les diluer dans du tampon FACS 100 ul pour la vérification de l'étiquetage par analyse FACS. Pas d'autres additifs sont nécessaires pour cette étape. Assurez-vous qu'il ya un suffidifférence de sante dans la luminosité pour Vδ1 ^- et les cellules Vδ1 ^+. Si cela est pas le cas, répétez les étapes 2.3) et 2.4).
6. Ajouter 20 ul microbilles anti-FITC par 1 x 10 ⁷ cellules pour les cellules restantes, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes dans l'obscurité à 4 ° C. Par la suite, laver les cellules à l'aide d'au moins 10 ml de tampon MACS (centrifugeuse pendant 12 min, à 300 g; 8 ° C).
7. Au cours de la centrifugation, équilibrer la colonne magnétique pré-refroidi placé dans un aimant avec un tampon MACS 500 ul.
8. Reprendre les cellules dans 500 pi MACS-tampon (pour le nombre de cellules supérieure à 1 x 10 ^8, intensifier ce volume en conséquence) et appliquer soigneusement les cellules sur la colonne. Recueillir l'écoulement contenant le Vδ1 ^- cellules.
9. Laver la colonne trois fois avec 500 ul MACS-tampon et de recueillir à nouveau l'écoulement dans le même tube. Notez que le réservoir doit être vide avant d'appliquer le tampon sur la colonne.
10. Retirer la colonne du dispositif magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml. Rincer rapidement la colonne avec 1 ml de tampon MACS en poussant fermement le piston dans la colonne. Recueillir l'éluat dans un tube.
    NOTE: Pour obtenir une pureté de> 98%, il est généralement nécessaire de répéter les étapes 2.7 à 2.9) avec une seconde colonne.
11. Vérifier la pureté des cellules par analyse FACS ¹⁸ avec le même panneau anticorps comme avant (voir 2.1.2) et de compter les cellules.

3. Isolement de cellules T ⁺ Vδ1CD4

1. Reprendre 25 ul de billes CD4 avec un vortex pendant> 30 sec. Laver les billes (le montant minimum tel que représenté par le fabricant) dans 1 ml de tampon MACS dans un tube de 1,5 ml de réaction en plaçant le tube dans un aimant pendant 1 min. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette à petite échelle (200 ul) et remettre en suspension les billes dans le volume initial de tampon MACS-.
2. Pelletiser Vδ1 ⁺ cellules (centrifugeuse pour 12 min; à 300 g) et aspirer le surnageant et remettre tous les Vδ1 ⁺ cellules dans 500 ul MACS-tampon et ajoutez-les au tube contenant les billes. Mélanger vigoureusement et incuber pendant 20 min à 4 ° C avec basculement constant (par exemple, dans un dispositif de rotation).
3. Placer le tube contenant les cellules dans un aimant pendant 2 min. Assurez-vous qu'il n'y a pas des restes dans le couvercle.
   NOTE: les cellules ^CD4 + ont lié les sera des billes magnétiques et attacher sur le côté du tube tournée vers l'aimant.
4. Ouvrez avec précaution le couvercle tout en gardant le tube à l'intérieur du dispositif magnétique et recueillir le surnageant qui contient le CD4 ^- Vδ1 cellules ⁺ aide d'une pipette à petite échelle. Placez CD4 ^{+ -} Vδ1 cellules dans un tube séparé et placer ce tube dans l'aimant à nouveau pour éviter restant éventuellement cellules CD4 ou des perles de la population.
   1. Laver le CD4 ^- cellules dans 5 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g) unnd remettre en suspension à une concentration de 1 x 10 ⁵ cellules par 100 pi de médias. CD4 ^- cellules peuvent être facilement cultivées dans les conditions indiquées ci-dessous (4,2).
5. Placer le tube avec les objectifs ^de cellules CD4 + à l'extérieur du champ magnétique, remettre les cellules dans 500 pi MACS-tampon et les remettre dans le dispositif magnétique. Répétez les étapes 3,3-3,5 deux fois pour obtenir une plus grande pureté. Retirer le surnageant par pipetage
6. Resuspendre les ^cellules CD4 + dans 100 ul de milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine) et ajouter 10 ul d'une solution de détachement en forme de bourrelet. Incuber à température ambiante pendant 45 min avec inclinaison constante (par exemple, dans un dispositif de rotation).
7. Placer les cellules dans un aimant pendant 1 min. Recueillir soigneusement le surnageant contenant des cellules CD4 ^{+ +} Vδ1 libre-talon aide d'une pipette à petite échelle.
8. En dehors de l'aimant, remettre en suspension les perles avec 100 pi milieux de culture et de répétitionétapes 3.6 et 3.7 à deux reprises pour obtenir des numéros de cellulaires plus élevées de cellules ^CD4 +.
9. Pastiller les cellules (centrifuger à 300 g, 12 min) et jeter le surnageant par pipetage complètement. Reprendre les cellules dans les médias, préchauffées fraîches et les compter. Examiner la pureté des Vδ1 ^{+ CD4} + par analyse FACS représentées dans les étapes 2.1.1-2.1.3.

4. unicellulaire clonage par dilution limitée

1. Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant d'un donneur allogénique comme représenté sur 1/1 à 1/6.
2. Irradier 2,5 x 10 ⁷ PBMC allogéniques avec 80 Gy en 25 ml de milieu de culture en utilisant γ-rayonnement.
3. Ajouter IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) et PHA (2 pg / ml) aux cellules nourricières irradiées et les distribuer dans des plaques à 96 puits en forme de U, 5 x 10 ⁴ chargeur cellules dans 50 ul par puits.
4. Diluer les cellules ^CD4 + ⁺ Vδ1 à une concentration de 0,3 cellules par 50 ul. Pipette 50 ul de la solution de cellules dans chaque puits et les cellules hébergeant les cytokines irradiés.
   REMARQUE: Ainsi, les cytokines sont dilués à la concentration finale de 100 U / ml d'IL-2, 10 ng / ml d'IL-7 et 1 ug / ml de PHA. Incuber les plaques à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO ₂ atmosphère humidifiée.
   1. Eventuellement, de cultiver restant purifié Vδ1 ^{+ cellules} CD4 + que la culture en vrac dans les mêmes conditions de culture que les clones.
5. Fournir les cellules tous les 3-4 jours avec des cytokines et des milieux frais. Pour cela, l'échange de la moitié de la moyenne dans les puits avec 50 pi de milieu frais par pipetage. Ajouter concentration deux fois plus de cytokines pour tous les supplémentation. Ajouter 5x10 ⁴ cellules nourricières irradiées par puits toutes les autres manches de l'alimentation.
6. En utilisant un microscope, observer premiers clones deviennent visibles au bout de 3-4 semaines, car ils métabolisent et donc changer la couleur des colonies de milieu de culture et forme.
   NOTE: Pour la fourrureTher culture, remettre en suspension les clones bien et les transférer pour séparer des plaques à 96 puits. Analyser les cellules par FACS comme indiqué dans 2.1.1-2.1.3. Clones maintenu dans ces conditions peuvent éventuellement changer leur TCR de Vδ1 à αβTCR. Le point de temps pour cette transdifférenciation varie de clone pour cloner.

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Résultats

La figure 1 illustre les différentes étapes et les résultats de l'isolement de cellules T Vδ1 partir de sang périphérique. La figure 1A montre une distribution typique de Vδ1 cellules CD3 ⁺ dans les lymphocytes ^+, ainsi que la co-expression du récepteur de la population Vδ1 ^+. Dans ce donneur, la fréquence des cellules Vδ1 ⁺ (rouge) est de 2,3% du nombre total de lymphocytes CD4 et l'expression (vert) de Vδ1 ⁺ ly...

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Discussion

Pour étudier le phénotype, la biologie et la fonction d'une entité de cellules rares (T), à savoir les cellules Vδ1 ^{+ T} CD4 +, nous avons utilisé deux marqueurs: Vδ1 et CD4 pour son isolement cellulaire magnétique positive. Vδ1 est un récepteur orphelin, alors que CD4 est exprimé sur les lymphocytes T auxiliaires, à un niveau inférieur sur les monocytes et les cellules dendritiques, et à un niveau très faible sur les cellules progénitrices hématopoïétiques.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D