Modélisation des étapes précoces de cancer de l'ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Résumé

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Résumé

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introduction

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy¹. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall².

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers^3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)⁷. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion⁸. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion⁸. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis^9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)^11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface^17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication^13,14,21-24, or both²⁵ (reviewed by us ²⁶). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone²⁵. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation⁸.

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Protocole

Tous les protocoles de recherche décrits ont été examinés par l'Université de Chicago Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé a été obtenu à partir de chaque patient avant la chirurgie et l'étude a été approuvé par l'Université de Chicago CISR. Une sécurité biologique type armoire 2 et des gants devraient être utilisés lors de la manipulation des tissus humains pour la protection et de réduire le risque de contamination des cellules.

1. Isolement et culture de cellules stromales primaires non transformés

1. Collection de tissus humains et de préparation.
   1. Obtenir des échantillons de omentum humain, 2 cm ^3, enlevé au cours d'une intervention chirurgicale abdominale, et immerger le tissu immédiatement en RT-solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (figure 2A). Un morceau de épiploon 3 cm x 2 cm donne généralement 1 million de cellules primaires humaines mésothéliales (HPMC) et 200.000 fibroblastes humains primaires ou des fibroblastes normaux omentales (NOF).
   2. Isoler la PBS le tissu a été immergé dans de 0,5 g pendant 3min dès que possible après la collecte (<2 h dans du PBS) et transférer le tissu à frais 20 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml. Coupez le tissu en 5mm ^{3 pièces} en hachant avec scalpels dans un diamètre de 15 cm, boîte de culture stérile (figure 2B).
2. Isolement de cellules mésothéliales humaines primaires ⁸
   1. Pour isoler HPMC, transférer le tissu haché dans 50 ml tubes coniques et attendre 1 min pour les morceaux solides de flotter vers le haut (figure 2C & D). HPMC et les globules rouges (RBC) sont présents dans le liquide sur le fond. Utiliser une pipette pour éliminer le liquide de la partie inférieure du tube et dans un nouveau tube conique. Spin le liquide vers le bas à 0,5 g pendant 3 min et aspirer le surnageant du culot HPMC / RBC.
      1. Répétez le processus à trois reprises: ajouter 20 ml de PBS au tissu hachée, laisser le tissu se lever, enlever le liquide du fond avec une pipette et dans le tube HPMC / RBC, spin-down, et retirer lesurnageant. Après que tous les tours sont terminés et le surnageant est aspiré, le culot contiendra HPMC et RBC.
   2. Plaque de toutes les cellules de la pastille dans un ² flacon de 75 cm dans 15 ml de milieu de croissance complet (DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 1% de vitamines MEM [93 mg / L], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]).
   3. Effectuer un lavage PBS secondaire pour isoler HPMC supplémentaires.
      1. Pour le secondaire PBS laver, secouez le tissu solide restant à 200 rpm, 37 ° C pendant 10 min dans 20 ml de PBS, puis attendre 1 min pour que le tissu flottent à la surface. Retirer le liquide depuis le fond du tube dans un nouveau tube, centrifuger à 0,5 g pendant 3 min, et aspirer le surnageant.
      2. Plate toute la HPMC / RBC de la PBS secondaire laver dans un 75 cm ² ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance.
   4. Pour isoler toute remaining HPMC, secouez le tissu haché à 200 rpm, 37 ° degrés C pendant 10 min dans 20 ml d'un 1: 1 0,25% mM EDTA trypsine 25: solution de PBS en volume. Laisser le tissu à la hausse, de recueillir le liquide au fond du tube dans un nouveau tube de 50 ml, tourner vers le bas et à 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirer le surnageant et de la plaque toute la HPMC / RBC dans un 75 cm ² ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance.
   5. Culture des cellules étalées à 37 ° C et _5% de CO2 dans un environnement humidifié. Flux cellules étalées en ajoutant 15 ml de milieu de croissance complète les jours 3 et 5 sans enlever les médias dépensé. HPMC peut être cultivé pendant 5-7 jours avant de se séparer.
      1. Utilisez faible passage HPMC (jusqu'à passage 2) dans toutes les expériences de minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d'origine. Utiliser un microscope à champ large de préférence avec un objectif 20x avec différentiel plastique capacités de contraste d'interférence ou objectif 4-20x avec contraste de phase capabilities (filtres de phase de contraste sur microscope) pour prendre toutes les images de cellules, et un objectif 10x () dans le champ lumineux d'analyser immunohistochimique 3,3'-diaminobenzidine (DAB) coloration.
   6. Vérifiez que le HPMC sont cubiques et expriment la cytokératine 8 et vimentine en effectuant immunohistochimie ⁸ (figure 3A, C, E).
3. NOF isolement ⁸
   1. Préparer 10 ml d'un stock de III solution de type collagénase (10x) en combinant un mélange 1: 1 de 100x Pen-Strep: 1 1.500 unités activité / ml de collagénase de type III: activité 714 unités / ml de hyaluronidase dans du PBS.
   2. Agiter le tissu haché épiploon qui reste après HPMC isolement à 200 rpm, 37 ° C pendant 6 heures dans 10 ml de la III solution de type 10x collagénase dilué dans un milieu sans sérum (DMEM avec 1% MEM vitamines [93 mg / l], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]). Tissu digéré examinera opaque et peut avoir quelques débris fibreux (figure 2E).
   3. Centrifuger les cellules NOF de solution contenant en suspension à 0,5 x g pendant 3 minutes à température ambiante, aspirer le surnageant et le culot de plaque dans une fiole 75 de ² cm dans 13 ml de milieu de croissance complet.
   4. Retirer les anciens médias et les remplacer par 15 ml de milieu de croissance complet frais après 24 h. NOF peut être cultivé pendant 1-3 jours avant de se séparer. Remarque prolifération de la NOF cessera lorsque les cellules atteignent la confluence.
   5. Vérifiez que les fibroblastes humains primaires sont des cellules plates, allongées et expriment la vimentine mais ne cytokératine 8 en effectuant immunohistochimie ⁸ (figure 3B, D, F). Utilisez faible passage NOF pour les expériences (idéalement avant le passage 3) pour minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d'origine. Utiliser un microscope à champ large avec un objectif 20x avec des capacités DIC en plastique de prendre toutes les images de phase de cellules,et un objectif 10x dans le champ lumineux d'analyser coloration immunohistochimique de DAB.

2. Placage la Culture organotypique ⁸

1. NOF de sortie du flacon de culture de 75 cm par rinçage avec 10 ml de PBS suivis par 3 ml de trypsine à 0,25% / EDTA 25 mM à pas plus de 5 min. Neutraliser la trypsine avec au moins 3 fois le volume de milieu de croissance complet.
2. Transfert cellules trypsinisées dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à 0,5 gx 3 min. Retirer le surnageant et amener les cellules de retour dans 5 ml de milieu de croissance. Utiliser un compteur de cellules pour compter les cellules récupérées à partir du flacon de culture.
3. Diluer cellules dans le volume approprié de milieu de croissance complet à l'assiette 2,000-4,000 NOF par 100 pi sur une plaque noire, fond transparent, 96 puits. Ajouter 0,5 ug / 100 ul de collagène de queue de rat I du mélange de cellules avant l'étalement. Cellules laisser reposer à 37 ° C dans 5% de CO ₂ dans un environnement humide pendant au moins 4 heures, ou jusqu'à ce que les cellulesà adhérer à la surface de la plaque.
4. HPMC de sortie du flacon de culture en utilisant les mêmes procédés décrits dans les étapes 2.1 et 2.2. Diluer les cellules de la quantité appropriée de milieu de croissance complet à l'assiette 10.000-20.000 HPMC par 50 pi au-dessus du NOF déjà plaqué avec du collagène I dans des plaques à 96 puits. Laissez les cellules sont assis à 37 ° C dans 5% de CO ₂ dans un environnement humide pendant au moins 18 heures avant le début des expériences.
5. Culture protéine verte fluorescente (GFP) exprimant les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 dans les médias de croissance. Les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 sont marquées par fluorescence par l'expression d'un vecteur lentiviral exprimant copépode CGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Les cellules cancéreuses de l'ovaire HeyA8 devrait être de 80 à 90% de confluence le jour de l'utilisation (en phase de croissance logarithmique). Libérer les cellules de la plaque de la culture et de compter en utilisant les mêmes méthodes décrites dans les étapes 2.1-2.2 pour des cellules primaires.
6. Laisser les cellules cancéreuses d'ovaire de récupérer dans un milieu de croissance complet pendant 15-20 min à 37 ° C dans untube conique avec le couvercle lâche scellé.

3. Essai d'adhésion ⁸

1. Après la récupération, sédimenter les cellules de cancer de l'ovaire en faisant tourner pendant 3 min à 0,5 XG, puis éliminer le surnageant et diluer les cellules dans le volume approprié de milieu sans sérum pour obtenir une concentration de 50.000 cellules / 100 pi.
2. Inverser les plaques à 96 puits avec les cultures organotypiques / NOF HPMC pour enlever milieu usé, et ajouter 100 pi de la suspension de cellules de cancer en milieu sans sérum à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans _5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 30 min pour 4 heures.
3. Inversez la plaque de 96 puits pour enlever les médias et les cellules non-adhérentes. Utilisez une pipette multicanaux à faible puissance à pipette soigneusement et doucement 100 pi de PBS dans chaque puits, et inverser à nouveau la plaque. Répétez la PBS laver une fois de plus.
4. Inversez pour enlever PBS et ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% à chaque puits. Laisser la plaque reposer pendant 20 min pour fixer les cellules. Après 20 minutes, retourner la plaque et ajouter 100 ul de PBS.
5. Notez que la fluorescence totale de puits peut être rapporté ou le nombre de cellules peut être quantifiée. Pour la quantification, première plaque une courbe standard en double exemplaire, en utilisant des cellules HeyA8 à une concentration de 1 millions de cellules / ml.
   1. Faire de la courbe standard par filage soit 1 million de cellules, de retirer le média, et en leur permettant de siéger dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min.
   2. Cellules Spin ramènerai et dans 1 ml de PBS (cellules de recomptage confirment 1 million / ml de concentration). Plate 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, et 0 cellules dans chaque puits en double, et d'ajouter PBS pour un volume total final de 50 ul dans chaque puits.
6. Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente (excitation = 488 nm, émission = 528 nm), mise à l'échelle haute puits (50.000 sur la courbe standard). Utilisez la courbe standard pour calculer le nombre de cellules de cancer de l'ovaire ont adhéré à la organotypic culture dans chaque puits (figure 4A-C).

4. Essai de prolifération ¹⁰

1. Après que les cellules de cancer de l'ovaire récupérer (voir les étapes 2.5 et 2.6 ci-dessus), d'une pastille les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 0,5 x g et ensuite dilué les cellules dans le volume approprié de 1% de FBS médias (DMEM avec 1% de FBS, 1% de MEM vitamines [93 mg / L], 1% MEM non essentiels acides aminés [81,4 mg / l], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine]) pour obtenir une concentration de 4000 cellules / 150 ul.
2. Inversez la plaque de 96 puits avec les HPMC / cultures organotypiques NOF pour enlever milieu usé, et ajouter 150 pi de la suspension de cellules de cancer de 1% de FBS à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans _5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 72 heures.
3. Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente une fois par jour (excitation = 488 nm, émission = 528 nm) pour évaluer la prolifération rapportdes cellules. Continuer l'essai pendant 96 heures, en changeant les médias à 48 h (figure 5A-C). Soyez prudent de ne pas perturber la culture lors du changement de média (inversant la plaque est préférable).

5. Invasion Assay ⁸

1. Avant la culture 3D de placage, ajouter 7,5 ug de collagène de queue de rat I dans 200 ul de PBS dans une plaque de culture de 24 insert de puits (8 um de taille de pore). Laissez la plaque d'incubation O / N, puis retirez soigneusement la PBS avec une pipette immédiatement avant l'ensemencement de la culture organotypique HPMC / NOF sur les inserts revêtus de collagène (étape 2, ci-dessus).
2. Préparer les cellules de cancer ovarien comme à l'étape 3.1. Pour plaquer les cellules cancéreuses de l'ovaire sur les cultures organotypiques sur les inserts, utiliser avec précaution une pipette pour enlever l'excès des médias à partir du haut des inserts. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules de cancer ovarien dans du milieu sans sérum à chaque puits.
3. Ajouter 750 ul de milieu de pleine croissance dans le bien en dessous de l'insert pour induire des cellules cancéreuses dansinvasion dans les cultures organotypiques. Incuber la plaque à 37 ° C dans _5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 24 heures.
   Nota: Les cellules de cancer ovarien qui envahissent la culture organotypique traversera l'insert et rester sur le côté inférieur de l'insert.
4. Après 24 h, saisir l'insert avec des pinces et brièvement rincer dans un bécher de PBS, puis déplacer l'insert dans un puits vide. Frotter la partie supérieure de chaque insert avec deux côtés d'un coton-tige pour un total de 1 min. Placer rapidement l'insert dans une plaque contenant 750 pi 4% de paraformaldehyde dans chaque puits. Permettre à chaque insert de siéger dans paraformaldéhyde pendant 10 minutes avant de transférer les inserts dans les puits remplis de 750 pi de PBS.
5. Afficher les cellules envahies (collées et fixées sur le fond du inserts) avec un microscope à grossissement 2,5x. Lorsque l'ensemble du bien est dans le champ de vision, ajuster l'agrandissement de 10x et de prendre 5 photos, l'un près du centre et 1 dans chaque quadrant du puits, en évitantprendre des images qui sont trop près des bords. Suivez la même pour chaque puits.
6. Utilisez le programme du fabricant à compter le nombre de cellules dans chaque image pour obtenir un nombre moyen de cellules envahies par champ dans chaque puits (figure 6A-C) en fonction de leur protocole.

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Résultats

La culture organotypique a été assemblé en mélangeant d'abord des fibroblastes humains primaires avec collagène de type I et recouvrant cette culture avec 5 fois le nombre de cellules mésothéliales. La culture a été incubée pendant au moins 18 heures avant que les cellules cancéreuses de l'ovaire ont été ajoutés pour étudier l'adhérence, l'invasion ou la prolifération. Chaque essai a été répété avec de multiples (n = 3-5) cultures 3D obtenues à partir de différents patients et de ...

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Discussion

Un modèle organotypique du microenvironnement péritonéale a été créé pour évaluer la fonction (s) individuelle et collective à la fois des composants cellulaires et innées du microenvironnement dans la diffusion de cancer de l'ovaire. Les protocoles spécifiques pour le placage et la personnalisation de la culture organotypique 3D pour étudier l'ovaire adhérence des cellules cancéreuses, la prolifération et l'invasion sont fournis. Cellules humaines omentales mésothéliales et des fibroblastes...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS	Fisher Scientific	SH3001304
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640
15 cm culture dishes	BD Biosciences	353025
Glass flask	?	?
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine	Corning	10-013-CV
MEM Vitamins	Corning	25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids	Corning	25-025-CI
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Shaker	Thermo-Fisher	MaxQ 4450
Centrifuge	Eppendorf	5702
Incubator	Thermo-Fisher	Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)	Corning	25-053-CI
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
T-75 Flasks	BD Biosciences	353136
T-175 Flasks	BD Biosciences	353112
Pipet tips	Rainin	P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips	Corning	Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter	Invitrogen	Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10313
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)	BD Biosciences	354236
96 well plate, clear bottom, black	BD Biosciences	353219
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet	Eppendorf	Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
Plate reader	Molecular Devices	Minimax
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)	BD Biosciences	353097
Cotton swabs	Q-tips	cotton swabs
Microscope	Zeiss	Axiovert 200m
Cell Profiler	public domain
24 well plate	BD Biosciences	353047
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609	EMD Millipore	MAB1976
Beta 1	Oncosynergy	OS2966
Alpha 5 [CD49e]	ID Pharmingen	555615
Beta 4 [CD104]	EMD Millipore	MAB 2058