Salinity dépendant Essai de toxicité de l'argent nanocolloïdes Utilisation de Medaka Eggs

Résumé

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Résumé

La salinité est une caractéristique importante de l'environnement aquatique. Pour les organismes aquatiques, il définit les habitats d'eau douce, d'eau saumâtre et l'eau de mer. Des tests de toxicité des produits chimiques et l'évaluation de leurs risques écologiques pour les organismes aquatiques sont fréquemment réalisées en eau douce, mais la toxicité des produits chimiques pour les organismes aquatiques dépend du pH, la température et la salinité. , Il n'y a pas de méthode, mais pour tester la dépendance à l'égard de la salinité de la toxicité pour les organismes aquatiques. Ici, nous avons utilisé medaka (Oryzias latipes) parce qu'ils peuvent adapter à l' eau douce, eau saumâtre et l' eau de mer. Différentes concentrations de milieu de l'embryon d'élevage (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x et 30x) ont été utilisées pour tester la toxicité des particules nanocolloïdales argent (SNCS) à Medaka oeufs (1x ERM et 30x ERM ont des pressions osmotiques équivalent à l'eau douce et l'eau de mer, respectivement). Dans des plaques à six puits en plastique de 15 œufs de medaka en trois exemplaires ont été exposés à DCN à 10 mg / L ^&# 8722; 1 à différentes concentrations du MCE à un pH de 7 et à 25 ° C dans l'obscurité.

Nous avons utilisé un microscope à dissection et un micromètre pour mesurer la fréquence cardiaque par un diamètre de 15 sec et les yeux le jour 6 et pleine longueur du corps des larves le jour (section 4) l'éclosion. Les embryons ont été observés jusqu'à l'éclosion ou le jour 14; nous avons ensuite compté le taux d'éclosion chaque jour pendant 14 jours (section 4). Pour voir l'accumulation d'argent dans les embryons, nous avons utilisé plasma à couplage inductif spectrométrie de masse pour mesurer la concentration d'argent de solutions de test (section 5) et les embryons dechorionated (section 6) .La toxicité du SNCS à des embryons de medaka évidemment augmenté avec l'augmentation de la salinité. Cette nouvelle méthode nous permet de tester la toxicité des produits chimiques dans différentes salinités.

Introduction

Depuis la création de l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) des lignes directrices d'essai pour les produits chimiques de test en 1979, 38 lignes directrices d'essai ont été publiés dans la section 2 des lignes directrices, des effets sur les systèmes biologiques ^1. Tous les organismes aquatiques testés ont été des habitats d'eau douce, à savoir les plantes d'eau douce; algues; invertébrés tels que les daphnies et chironomes; et des poissons tels que le médaka, le poisson zèbre et la truite arc. Par rapport à des environnements d'eau salée, les environnements d'eau douce sont plus directement touchés par les activités économiques et industrielles humaines. Par conséquent, les environnements d'eau douce ont été priorisés pour les tests, car ils sont plus à risque de pollution.

Dans les zones côtières, y compris les estuaires, les salinités varient entre les conditions de l' eau et l' eau de mer saumâtre, et ces zones sont souvent polluées par l' activité industrielle ^2. Les zones côtières et les zones humides associées sont caractérisées par hla biodiversité écologique aute et la productivité. Les écosystèmes côtiers doivent donc être protégées contre la pollution chimique. Cependant, il a été limité la recherche écotoxicologique dans les habitats d'eau et d'eau de mer saumâtre.

Sakaizumi ³ a étudié les interactions entre les toxiques de mercure de méthyle et de salinité dans les œufs de medaka japonais et a constaté que l' augmentation de la pression osmotique de la solution d'essai a amélioré la toxicité du mercure de méthyle. . Sumitani et al ⁴ utilisé des oeufs de medaka pour étudier la toxicité des lixiviats de décharge; ils ont constaté que l'équivalence osmotique du lixiviat aux oeufs était la clé pour induire des anomalies lors de l'embryogenèse. En outre, Kashiwada ⁵ rapporté que les nanoparticules en plastique (39,4 nm de diamètre) facilement pénétrés par le chorion medaka d'oeuf dans des conditions saumâtres (15x embryon d' élevage moyen (ERM)).

Un modèle de petits poissons typique, les médaka (Oryzias latipes de ) a été utilisé en biologie fondamentale et écotoxicologie ^6. Medaka japonais peuvent vivre dans des conditions allant de l' eau douce à l' eau de mer en raison de leurs cellules de chlorure hautement développés ^7. Ils sont donc susceptibles d'être utiles pour tester dans des conditions avec une large gamme de salinités.

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Protocole

Les medaka japonais utilisés dans cette étude ont été traités avec humanité conformément aux directives institutionnelles de l'Université Toyo, en tenant compte de la réduction de la détresse et de l'inconfort.

1. Argent nanocolloïdes (SNC)

1. Achetez SNC purifiées (20 mg / L ^-1, 99,99% de pureté, particule signifie un diamètre d' environ 28,4 ± 8,5 nm en suspension dans l' eau distillée).
2. Valider la pureté et la concentration de l'argent par couplage inductif spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS) analyse selon le manuel d'exploitation ^8. Le procédé de prétraitement pour ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.

2. Préparation de SNC Solutions (mélanges de colloïdes d' argent et Ag ⁺⁾ avec différentes salinités

1. Préparer 60 × ERM consistant en 60 g de NaCl, 1,8 g de KCl, 2,4 g de CaCl ₂ .2H ₂ O, 9,78 g de MgSO ₄ · 7H ₂ O dans 1 L de ULTeau Rapure; ajuster le pH à 7,0 avec 1,25% de NaHCO ₃ dans de l' eau ultrapure.
2. Agiter la solution de GRE à 25 ° C pendant la nuit.
3. Mélanger avec SNC ERM diluée. Préparer 40 ml de chaque solution mixte SNC-ERM. La concentration finale est de 10 mg / L ^-1 de SNC dans différentes concentrations de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x ou 30x).
4. Ajuster le pH de la solution mixte SNC-ERM à 7,0 avec 0,625% NaHCO ₃ dans l' eau ultrapure. l' ajustement du pH est très important dans la préparation de la solution de SNC, car la libération Ag ⁺ est facilitée par des conditions acides ^9.
5. Utiliser AgNO ₃ en tant que composé de référence pour le SNC.
   1. Mélanger AgNO ₃ avec ERM dilué. Préparer 40 ml de AgNO ₃ -ERM solution mélangée à une concentration AgNO ₃ de 15,7 mg / L ^-1 (10 mg / L ^-1 argent) dans différentes concentrations de ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x ou 30x) .
      Remarque: Pour examiner la toxicité de l' argent colloïdal, AgNO ₃solution, ce qui est une source d'argent soluble, est utilisé comme composé de référence pour DCN, qui sont un mélange de colloïdes d'argent et d'argent soluble.

3. Medaka Culture et récolte des oeufs

1. Obtenir le medaka (latipes O.) (souche rouge-orange) (60 mâles et 60 femelles).
2. medaka Culture en tant que groupes (20 mâles et 20 femelles comme un groupe) dans 1x ERM dans 3 L réservoirs en utilisant un système de culture d'écoulement medaka.
   1. Culture dans les conditions suivantes:
      plage de pH du milieu de culture: 6/2 à 6/5
      lumière: cycle d'obscurité: 16: 8 h
      température du milieu de culture: 24 ± 0,5 ° C
      la pression osmotique du milieu de culture: 257 mOsm
3. Parasites medaka sur Artemia salina nauplii à 10h00 (une fois par jour) et de nourrir un régime alimentaire de poisson sec artificielle à 09:00, 11:00, 13:00, 15:00 et 17:00 (cinq fois par jour).
   1. Obtenir A. nauplii salina.
   2. Préparation 5 L d'une solution saline à 3,0% dans un bêcher de plastique.
   3. Ajouter 30 g d'oeufs d'artémias à la solution de sel dans le récipient.
   4. Incuber les oeufs à 25 ° C pendant 48 heures avec barbotage (4 L / min ^-1) à l' aide d' une pompe d'aération.
   5. Après 48 h, arrêter le bouillonnement.
   6. Laisser reposer la solution pendant 5 à 10 min pour séparer le A. hachurée salina nauplii (partie inférieure de la solution) à partir des œufs non éclos et des œufs (partie supérieure de la solution).
   7. Enlever la couche supérieure de la solution par décantation.
   8. Filtrez la partie inférieure de la solution à travers un tamis avec des ouvertures de 283 um, et de recueillir les nauplii qui passent à travers sur un filet avec des ouvertures de 198 um.
   9. Nourrir le nauplii aux medaka dans les 6 heures.
4. Après les medaka femelles ont donné naissance, enlever les grappes d'oeufs externes doucement le corps des femelles ou ramasser les oeufs du fond de l'aquarium en utilisant un smtout net (taille nette de 5 cm x 5 cm, taille du trou de 0,2 mm x 0,2 mm).
5. Rincer la grappe d'oeufs avec l'eau du robinet qui coule pendant 5 sec.
6. Ajouter tous les groupes d'œufs rincés à 30x solution de GRE.
7. Retirer les grappes de la solution après 1 min et placer les grappes d'oeufs entre des serviettes en papier sec et rouler doucement.
8. Mettre les oeufs de nouveau dans le MCE 30x.
9. Sélectionnez les œufs fécondés sous un microscope à dissection.
10. Lieu choisi 810 oeufs dans 1x ERM dans six puits des plaques en plastique à l'aide d'une pince.
11. Incuber les œufs à 25 ± 0,1 ° C dans un incubateur jusqu'à ce stade de développement 21. (stades de développement des embryons de medaka ont été définis à partir du travail de Iwamatsu ^10.)
12. Choisissez des œufs incubés au stade de développement 21 sous un microscope à dissection.
13. Rincer les œufs sélectionnés avec 1x ERM.
14. Soumettre les œufs rincés à des expériences d'exposition (section 4).

4. Essais de toxicité du SNC ou AgNO ₃ À différents salinités ERM

1. Rincer les œufs de medaka (étape 21) trois fois avec une solution de test [de SNC (10 mg / L ^-1) ou AgNO ₃ (15,7 mg / L ^-1 10 mg / L ^-1 argent) à chaque concentration du MCE (1x, 5x , 10x, 15x, 20x ou 30x) à pH 7]. En tant que témoins, utiliser des oeufs à 1 × 30 × ERM à pH 7.
2. Ajouter 15 œufs rincés à 5 ml de chaque solution d'essai dans six puits des plaques en plastique. (Effectuez les expériences d'exposition trois fois pour SNC ou de test AgNO ₃ toxicité en utilisant chaque solution d'essai.)
3. Envelopper les plaques dans du papier d'aluminium.
4. Incuber les plaques enroulées à 25 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'éclosion ou pendant 14 jours.
5. Observer les oeufs exposés toutes les 24 h pour les changements biologiques et les oeufs morts (figures 1 et 2).
6. Echanger les solutions d'essai toutes les 24 heures.
7. Effectuer des observations de la manière suivante.
   1. Le jour 6 de l'exposition, on compte le rythme cardiaque (par 15 sec) oembryons f de medaka sous un microscope à dissection en utilisant un chronomètre (Figure 3a).
   2. Au jour 6 de l' exposition, de mesurer la taille des yeux (diamètre) d'embryons de medaka sous un microscope à dissection à l'aide d' un micromètre (figure 3b).
   3. Le jour d' incubation, mesurer les longueurs du corps entier de larves sous un microscope à dissection en utilisant un micromètre (Figure 3c).
   4. Comptez le nombre total d'œufs qui éclosent exposés au cours des 14 jours (Figure 3d).

5. Isolation de Silver Soluble de SNC Solution, et analyse Argent

1. Isolât d'argent soluble à partir de chaque solution SNC (un mélange de colloïdes d'argent et d'argent soluble) par filtration à travers un filtre à membrane 3 kDa à 14.000 x g et 4 ° C pendant 10 min. Utilisez un filtre 3 kDa de la membrane pour isoler l' argent soluble du SNCS, parce que le diamètre moyen rapporté de SNC agrégées 1x ERM est de 67,8 nm ¹¹ and celle de Ag ⁺ est de 0,162 nm ^12; la membrane 3 kDa ne comprend pas de particules ayant des diamètres de 2 nm ou plus ^13.
2. Mesurer la concentration d'argent dans 50 pi de solution filtrée (= la concentration d'argent soluble) par ICP-MS analyse (Figure 3e) selon le manuel d' exploitation ICP-MS ^8. Le procédé de prétraitement pour l'ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.

6. Mesure de Silver Bioaccumulation dans Medaka Embryons

1. Exposer les œufs de medaka (étape 21) à SNC ou AgNO ₃ comme décrit dans la section 4.
2. Au jour 6 de l' exposition, enlever chorion de l'œuf ( par exemple, dechorion) à l'aide d'une enzyme médaka d' incubation suivant le protocole décrit dans le livre médaka ^14.
3. Mesurer la concentration en argent des oeufs dechorioned par analyse ICP-MS selon l'ICP-MS manuel de fonctionnement ⁸ (Figure 3f). le prétraitementméthode pour le ICP-MS analyses est décrit à l'article 7.

7. Mesure de la concentration d'argent par ICP-MS Analysis

1. Ajouter des échantillons [50 ul de solution d'argent (pour la validation de la concentration en argent, section 1); trois embryons dechorionated (section 5); ou 50 pi de solution filtrée (section 5)] à un Teflon bêcher de 50 ml.
2. Ajouter 2,0 ml de ultrapure acide nitrique à l'bêcher de 50 ml.
3. Chauffer le mélange sur une plaque chaude à 110 ° C jusqu'à ce que juste avant qu'il ne se dessèche (environ 3 heures).
4. Pour dissoudre la matière organique complètement, ajouter 2,0 ml de ultrapure acide nitrique et 0,5 ml de peroxyde d'hydrogène dans le bécher.
5. Chauffer le mélange à nouveau sur la plaque chaude jusqu'à ce que juste avant qu'elle ne sèche (environ 3 heures).
6. On dissout le résidu dans 4 ml d'une solution ultra-pure d'acide nitrique à 1,0%.
7. Transférer 4 ml d'une solution dans un tube de centrifugeuse.
8. Répéter 07/06 au 07/07 à deux reprises (un total de trois fois). Le volume final est de 12,0ml.
9. Mesurer la concentration d'argent de l'échantillon (dissous dans 1,0% ultrapure acide nitrique) en utilisant l' analyse ICP-MS selon le manuel d'exploitation ^8.
   1. Utiliser une interne et une solution de référence externe (Voir liste des matières) pour quantifier la concentration d'argent. La solution étalon interne et externe est accrédité par l'American Association for Laboratory Accreditation (A2LA). Les limites de détection de l' argent étaient 0,0018 ng / ml ^-1 (solution) et 0,016 ng mg poids ^-1 (corps de l' embryon).

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Résultats

L'effet de la salinité sur la toxicité SNC était très évident: l'induction de la déformation ou la mort était dépendant de la salinité (figures 1 et 2). Nous avons mesuré les biomarqueurs phénotypiques (fréquence cardiaque, la taille des yeux, pleine longueur du corps, et de taux d' éclosion) dans SNC (10 mg / L ^-1) embryons -exposed. Ces marqueurs phénotypiques ont révélé la salinité dépendant SNC toxicité.

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Discussion

Medaka est un poisson d'eau douce qui est très tolérant à l'eau de mer; il est pas bien connu que l'habitat naturel d' origine de ce poisson était d' eau salée au large de la côte japonaise ^6. Par conséquent, les poissons de medaka ont bien développé des cellules de chlorure ^7. Cette propriété unique offre aux scientifiques une nouvelle façon de tester la toxicité des produits chimiques dans l'environnement en fonction de la salinité (eau douce à l'eau de ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nanocolloids	Utopia Silver Supplements
NaCl	Nacalai Tesque, Inc.	31319-45	For making ERM
KCl	Nacalai Tesque, Inc.	28513-85	For making ERM
CaCl2·2H2O	Nacalai Tesque, Inc.	06730-15	For making ERM
MgSO4·7H2O	Nacalai Tesque, Inc.	21002-85	For making ERM
NaHCO3	Nacalai Tesque, Inc.	31212-25	For making ERM
AgNO3	Nacalai Tesque, Inc.	31018-72
pH meter	HORIBA, Ltd.	F-51S
Balance	Mettler-Toledo International Inc.	MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strain	National Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing system	Meito Suien Co.	MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggs	Japan pet design Co. Ltd	4975677033759
aeration pump	Japan pet design Co. Ltd	non-noise w300
Otohime larval β-1	Marubeni Nissin Feed Co. Ltd	Otohime larval β-1	Artificial dry fish diet
dissecting microscope	Leica microsystems	M165FC
micrometer	Fujikogaku, Ltd.	10450023
incubator	Nksystem	TG-180-5LB
shaker	ELMI Ltd.	Aizkraukles 21-136
6-well plastic plates	Greiner CELLSTAR	M8562-100EA
aluminum foil	AS ONE Co.	6-713-02
stopwatch	DRETEC Co. Ltd.	SW-111YE
3 kDa membrane filter	EMD Millipore Corporation	0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beaker	AS ONE Co.	33431097
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-538	For internal standard
Custom claritas standard	SPEXertificate	ZSTC-622	For external standard
ultrapure nitric acid	Kanto Chemical Co.	28163-5B
hydrogen peroxide	Kanto Chemical Co.	18084-1B	for atomic absorption spectrometry
ICP-MS	Thermo Scientific	Thermo Scientific X Series 2
hot plate	Tiger Co.	CRC-A300