Cultures Génération fibroblastes primaires de souris oreilles et la queue tissus

Résumé

Nous décrivons une procédure expérimentale simple et rapide pour générer des fibroblastes primaires des oreilles et de la queue de souris. Le procédé ne nécessite pas de formation spécifique des animaux et peut être utilisé pour la production de cultures de fibroblastes des oreilles stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.

Résumé

Les cellules primaires sont directement dérivées de tissus et sont pensés pour être plus représentatif de l'état physiologique des cellules in vivo que des lignées cellulaires établies. Cependant, des cultures de cellules primaires ont habituellement une durée de vie limitée et doivent être fréquemment rétablie. Les fibroblastes sont une source facilement accessible de cellules primaires. Ici, nous discutons d'une procédure expérimentale simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. Le protocole peut être utilisé pour établir des cultures de fibroblastes primaires de l'oreille stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours. Lorsque le protocole est soigneusement suivie, les contaminations sont peu susceptibles de se produire malgré l'utilisation de tissus non stérile stocké pendant le temps prolongé dans certains cas. Fibroblastes prolifèrent rapidement dans la culture et peut être étendu à un nombre important avant de subir sénescence réplicative.

Introduction

Les cellules primaires sont obtenues à partir de tissu cultivé et vivant dans des conditions in vitro. Il est généralement admis que les cellules primaires ressemblent davantage à l'état physiologique et le fond génétique du tissu dont ils sont issus de lignées cellulaires tumorales immortalisées ou ^1. Pour cette raison, les cellules primaires représentent un modèle utile pour étudier les questions biologique ^2,3. Cependant, à la différence des lignées cellulaires établies qui poussent indéfiniment, cellules primaires éventuellement subir la sénescence dans la culture et doivent être fréquemment rétabli.

Les cellules primaires couramment utilisés comprennent les fibroblastes, les cellules epitheliales, les cellules endotheliales, les cellules T, les cellules B, les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) et des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (BMDC). Les fibroblastes sont souvent utilisés comme modèle de culture cellulaire primaire. Ils offrent des avantages clés par rapport aux autres cellules primaires. Les cultures de cellules sont faciles à établir, facilement maintenu et ne nécessitent aucune purification des cellules avant la culture. Ils ont la prolifération initiale rapide et aucune exigence pour les protocoles de moyennes ou d'activation spécialisées. Les fibroblastes peuvent être efficacement transfectées en utilisant des protocoles physiques ^4,5 biologiques, chimiques, et. Il est possible de stocker les oreilles pour un maximum de 10 jours à la température ambiante avant d'établir des cultures de cellules. Cultures de fibroblastes sont propices à la visualisation des processus cytoplasmiques et adapté à la reprogrammation en cellules souches pluripotentes induites (iPS) ^6.

Les fibroblastes sont des cellules importantes du tissu conjonctif qui sécrètent des protéines de la matrice extracellulaire de collagène et ^7. Ils fournissent le cadre structurel dans de nombreux tissus ^{8 et} jouent un rôle essentiel dans la cicatrisation et la réparation tissulaire ^9,10.

Ici, nous décrivons un (<4 h) protocole simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes de les oreilles et la queue de souris ^11. Le protocole nécessite un minimum de sourisl'expérience de récolter les tissus (contrairement à d'autres protocoles ^12,13) ​​et peut être utilisé pour établir des cultures de oreilles stockées dans un milieu à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.

Protocole

Les souris ont été hébergés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes en conformité avec les directives institutionnelles jusqu'à l'euthanasie (Le institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices à l'Université nationale de Singapour et le Comité consultatif national de laboratoire de recherche animale (NACLAR) Lignes directrices).

1. Souris

1. Commandez un clic de l'arrière-plan génétique approprié. Ce protocole est basé sur un tissu dérivé d'une souris C57BL / 6.

2. Préparation de milieu complet

1. Préparer un milieu complet en ajoutant les composants suivants à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640: 10% de sérum de veau foetal (FCS), 50 uM de 2-mercaptoéthanol, 100 uM de l'asparagine, de la glutamine 2 mM, une solution de pénicilline-streptomycine 1%.

3. Préparation des solutions enzymatiques

1. Préparer la solution de collagénase D dans un tube à fond conique de 15 ml.
   1. Peser 10 mg de collagénase D. Dissolve collagénase D dans 4 ml de milieu complet.
2. Préparer la solution pronase dans un tube de 1,7 ml à centrifuger.
   1. Peser 10 mg de pronase.
   2. Ajouter 5 ul de tampon Tris 1 M (pH 8,0). Ajouter 1 pi d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).
   3. Compléter avec 494 pi d'eau stérile.
   4. Incuber la solution de pronase à 37 ° C dans un bain-marie pendant 30 min.

4. Préparation de la collagénase D-Mix pronase (≤2 Tails)

Remarque: Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire stérile.

1. Ajouter 250 ul de solution de pronase à 4 ml de solution de collagénase D.
2. Faire passer le mélange de collagénase D-pronase à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans un tube de 15 ml fond conique stérile.

5. Extraction des fibroblastes de l'oreille et la queue tissus

1. Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles appropriées.
2. Placez autoclave instruments chirurgicaux (ciseaux et des pinces) dans la hotte de culture cellulaire.
3. Ajouter 10 ml du milieu complet en deux boîtes de culture cellulaire de 10 cm chacune.
4. Couper les oreilles (~ 1 cm de rayon) et de 5 cm de queue (à partir de la pointe de la queue) d'une souris avec des ciseaux et incuber pendant 5 min dans 40 ml 70% d'éthanol dans un tube de 50 ml à fond conique stérile.
5. Oreilles séchées à l'air et la queue en les plaçant dans une boîte de 10 cm de culture de cellules ouvertes dans la hotte pendant 5 min. Une fois séchées, le transfert oreille et la queue des morceaux à deux boîtes de culture étiquetés "oreilles" et "queue" contenant 10 ml de milieu complet tel que décrit dans l'étape 5.3.
6. Enlever les poils des oreilles et la queue avec des ciseaux.
7. Couper oreilles et la queue en morceaux plus petits de 3 mm de diamètre à l'aide de ciseaux.
8. Transférer les tissus coupés dans 1,8 ml des flacons de CryoTube étiquetés "oreilles" et "queue" et ajouter la solution D-pronase collagénase suffisante pour le volume pour atteindre la marque de 1,8 ml sur le flacon.
9. Placer les flacons CryoTube horizontalement sur un agitateur et agiter les échantillons à 200 tours par minute pendant 90 min à 37 ° C.
10. Après 90 minutes d'incubation, retirer les flacons de CryoTube du shaker et placer les flacons dans la hotte.
11. Ajouter 10 ml de milieu complet en deux boîtes de 10 cm de culture cellulaire, étiquetés "oreilles" et "queue" chacun, et de mettre une passoire 70 um cellulaire dans chaque plat.
12. Placer les tissus de l'oreille et de la queue digérés dans le tamis 70 um de la cellule dans les plats préparés en conséquence marqués à l'étape 5.11 et broyer les tissus de force au moyen d'un piston de seringue 10 ml de> 5 min. Agiter le tamis cellulaire occasionnellement dans le moyen de se laver les cellules de la crépine de la cellule.
13. Introduire à la pipette la suspension de cellules de chaque plat dans des tubes de 15 ml de fond deux coniques étiquetés "oreilles" et "queue". Laver la capsule et la crépine avec supplémentaire de 10 ml de milieu complet et ajouter le support pour les tubes de 15 ml appropriées fond conique.
14. Isoler la cellulesuspension pendant 7 minutes à 580 xg et ~ 4 ° C en utilisant une centrifugeuse réfrigérée cellulaire.
15. Retirer le surnageant, ajouter 10 ml de milieu complet pour le culot cellulaire dans les 15 ml du tube de fond conique et remettre en suspension les cellules.
16. Répétez l'étape 5.14 et 5.15.

6. La culture de la cellule Mélange

1. Retirer le surnageant. Assurez-vous que le culot cellulaire reste intacte.
2. Re-suspendre les cellules dans 10 ml de milieu complet et ajouter le mélange respectif pour deux boîtes de culture cellulaire de 10 cm étiquetés "oreilles" et "queue".
3. Ajouter 10 ul solution d'amphotéricine B (solution stock: 250 pg / ml) à la culture.
4. Incuber les cellules à 37 ° C dans une humidifié à 5% de CO ₂ incubateur.
5. Le troisième jour, remplacer le milieu par un milieu complet frais contenant 10 ml 10 pi de l'amphotéricine B pour enlever les débris (figures 1 et 2).

7. Sous-culture de fibroblastes

1. When culture atteint environ 70% de confluence (3-4 jours de la culture) éliminer le milieu et laver les cellules avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée 5 ml stérile (PBS).
2. Retirer le PBS et ajouter 2 ml de solution stérile 1x trypsine-EDTA pour les cellules.
3. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C dans une humidifié à 5% de CO ₂ incubateur.
4. Après 5 min, tapotez doucement la boîte de culture et ajoutez 6 ml de milieu complet pour les cellules.
5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à fond conique de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 450 x g et ~ 4 ° C en utilisant une centrifugeuse réfrigérée cellulaire.
6. Retirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot de cellules dans 5 ml de milieu complet.
7. Germe 2 x 10 ⁵ cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié CO ₂ à 5% pendant 3-4 jours avant de répéter les étapes 7.1 à 7.6.

8. Préparation des oreilles pour l'expédition

Remarque: Effectuez til étapes ultérieures dans une hotte de culture cellulaire stérile.

1. Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles appropriées.
2. Placez ciseaux et des pinces autoclave dans la hotte de culture cellulaire.
3. Ajouter 50 ml de milieu complet dans un tube à fond conique de 50 ml.
4. Couper les oreilles (~ 1 cm de rayon) d'une souris avec des ciseaux.
5. Transférer les oreilles dans le tube à fond conique de 50 ml (tel que préparé à l'étape 3) en utilisant une pince.
6. Scellez le tube inférieur conique de 50 ml avec du parafilm avant d'expédier à température ambiante dans une case appropriée.

Résultats

Extraction à partir des résultats des fibroblastes de tissu dans une quantité importante de débris de tissu (Figure 1). Contrairement aux débris tissulaires, les fibroblastes adhèrent à des surfaces en plastique de culture de tissus entre 1 et 3 jours de culture. Le milieu de cultures de fibroblastes peut être modifié en toute sécurité le jour 3 de la culture, ce qui devrait réduire de manière significative les niveaux de débris présents dans la culture (Figure 2). Les fi...

Discussion

Ici nous fournissons une procédure expérimentale simple, peu coûteux et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. L'extraction doit se traduire par des fibroblastes de division adhérentes et rapidement dans les 3 jours après l'isolement du tissu. Une limitation importante de cellules primaires est la sénescence, un arrêt de la croissance permanente ^15. En utilisant le protocole, les cultures de fibroblastes peuvent être passées de 5 à...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG