Quantification de l'architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Résumé

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Résumé

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Introduction

Virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) envahit le cerveau au cours de la phase aiguë de l'infection par le virus, et infecte productive deux microglie et les macrophages du cerveau résidents, menant à leur activation - et la libération des deux médiateurs inflammatoires dérivés de l'hôte et soluble VIH-1 virotoxins telles que Tat et gp120 (revue dans ^1,2). En conséquence, un état ​​chronique neuroinflammatoire devient établi dans le SNC, qui est pensé pour contribuer à la pathogenèse du VIH-1 troubles associés neurocognitifs (de la main) ^3-5.

La surexpression chronique de Tat du VIH-1 ou l'interleukine (IL) -17A dans le SNC de souris a été démontré que conduire à ^6,7 raréfaction microvasculaire. Cela soulève la possibilité que la neuro-inflammation chronique peut contribuer à la pathogenèse de la main par des effets sur le système vasculaire cérébral. Afin d'examiner plus avant cette question, nous avons développé des méthodes pour quantifier struc vasculaires cérébrauxtures.

Ce document décrit une méthode pour quantifier le nombre de nœuds de capillaires, des segments capillaires, la longueur moyenne du segment, la longueur totale du segment, diamètre moyen capillaire, et le volume total du capillaire en utilisant l'imagerie in vivo de réseaux capillaires à travers une fenêtre corticale du crâne mince (modifié à partir décrit précédemment ^8,9 protocoles), ainsi que l'imagerie ex vivo de coupes de cerveau, en utilisant la microscopie à deux photons. Cette approche combinée fournit une quantification globale des paramètres vasculaires cérébraux, depuis le mince crâne fenêtre corticale in vivo permet la préservation de l'environnement cérébrale, tandis imagerie ex vivo des réseaux de capillaires dans des tranches de cerveau permet la reconstruction de complet, en trois dimensions réseaux capillaires - qui peuvent ensuite être quantifiés en utilisant un logiciel disponible dans le commerce.

Protocole

L'Université de l'Université de Rochester Comité sur les ressources animales a approuvé toutes les procédures suivies dans le présent document.

1. Préparation pré-opératoire (et souris)

1. Préparer la zone chirurgicale avec tout l'équipement nécessaire. Stériliser tous les outils utilisés lors de la procédure à l'avance en utilisant 70% d'éthanol. Eventuellement, utiliser un stérilisateur de billes de verre ou un autoclave pour stériliser les outils.
2. Placer la souris dans une chambre d'induction reliée à l'isoflurane un vaporisateur isoflurane. Réglez les niveaux isoflurane à 4% à un taux de 1 L / min.
   Remarque: pour les expériences rapportées ici, les souris avec un doxycycline (DOX) inductible transgène VIH-1 Tat entraînée par la protéine fibrillaire gliale spécifique des astrocytes (GFAP) promoteur (Tat du VIH-Tg souris) ¹⁰ ont été utilisés pour examiner l'effet du VIH -1 sur la structure de la neuro-inflammation vasculaire cérébral induit, comme décrit précédemment ^7,10.
3. Faites doucement basculer la chambre de l'induction d'observer la souris &Réflexe de redressement de; # 39. Une fois le réflexe de redressement a été supprimée, définissez le niveau de l'isoflurane à 2% et de rediriger le flux d'air de la chambre de l'induction au cône de nez sur le banc chirurgicale.
4. Déplacer rapidement la souris de la chambre de l'induction à la plage de chauffage de l'eau infusée. Continuer à appliquer l'isoflurane (1,5-2%) à travers le cône de nez. Réglez l'anesthésie fonction de la tolérance individuelle de la souris évalué par la fréquence respiratoire (RR) suivi.
   Remarque: La dépression peut perturber RR de paramètres physiologiques de gaz, modifiant le débit sanguin cérébral et l'évaluation de diamètre du vaisseau. Tenter de garder RR entre 55-65 respirations par minute. La fréquence cardiaque (HR) peut également être utilisé évaluer profondeur de l'anesthésie; garder RH entre 300-450 battements par minute pour éviter les changements physiologiques au diamètre du vaisseau. Typiquement, l'anesthésie sera suffisant entre 1,5-2,0% d'isoflurane à 1 L / min pour une souris donnée.
5. Effectuer une pincée de pointe pour vérifier davantage la profondeur de l'anesthésie. Si la souris ne répond pas, commrence les procédures chirurgicales.

2. Préparation de la fenêtre crânienne Thin-crâne

1. Appliquer le gel de larmes artificielles pour les yeux de souris. Supprimer complètement les cheveux du cuir chevelu de la souris à l'aide de ciseaux ou un rasoir électrique.
2. Stériliser le cuir chevelu en appliquant une solution de povidone-iode; laisser sécher. Puis, sous un microscope optique, enlever la peau du cuir chevelu de la souris, exposant complètement les os pariétaux, os frontaux caudales, et le marquage Bregma.
3. Appliquer une petite quantité d'une solution à 10% de chlorure ferrique au crâne afin de sécher les membranes pour un retrait facile. Retirer les membranes séchées avec les N ° 5/45 pince en grattant doucement le crâne.
4. Appliquez une fine couche de colle autour de la fenêtre plaque de tête. Appuyez doucement sur la plaque frontale contre le crâne de la souris, en gardant la zone d'intérêt dans le centre de la fenêtre. Appliquer une goutte de ciment dentaire à la plaque de tête pour polymériser la colle.
5. Appliquer une couche mincede la colle le long du bord de la fenêtre de plaque de tête pour créer un réservoir pour contenir dans lequel la solution saline. Une fois que la colle est sèche, visser la plaque de tête dans le harnais de plaque frontale de la souris.
   Remarque: le faisceau de plaque de tête de la souris utilisée dans le présent procédé est une structure avec une base métallique et deux colonnes métalliques. Sur chaque colonne il ya un printemps et un écrou papillon. La plaque de tête est placé sur le dessus du printemps, et l'écrou de l'aile est serré jusqu'à ce que la tête est de niveau et ne bouge pas.
6. Retirer la colle de la fenêtre plaque de tête à l'aide d'un foret fixé à une perceuse MicroTorque fixé à 6000 rpm. Arrêtez toutes les 10-15 secondes pour éviter la surchauffe du crâne de souris qui peut entraîner des dommages structurels aux navires.
   1. En utilisant une nouvelle mèche, placez le MicroTorque forage 1,5 mm latéralement de la ligne médiane (un tiers du diamètre de la fenêtre de plaque de tête). Commencez à amincir le crâne autour de cet endroit à 4000 rpm. Déplacez la perceuse doucement sur le crâne avec aucune pression directe vers le bas.
   2. Cessez drilling toutes les 10-15 secondes pour éviter la surchauffe du crâne de la souris. Pendant ce temps, enlever la poussière accumulée du crâne utilisant une cartouche d'air comprimé.
   3. Utilisation gouttes de solution saline à la température ambiante pour refroidir crâne 5-10 sec. Retirez délicatement tout le liquide avec un tissu doux pour continuer crâne amincissement.
7. Pour l'amincissement finale du crâne, placer un petit volume de solution saline dans le réservoir plaque de tête et légèrement balayer une microlame dentaires sur la zone d'intérêt jusqu'à ce que les petits navires sont clairement visibles.

3. Suivi de paramètres physiologiques

1. Une fois que le crâne est complètement diluée, détachez la souris de son support et placez-le sur son dos. Collez doucement les deux pattes arrière pour exposer clairement les cuisses médiales.
2. Enlever les poils sur les deux cuisses médiales avec des ciseaux ou un rasoir électrique. Désinfecter le site chirurgical en couvrant les cuisses avec povidone-iode.
3. Pincer la peau sur la cuisse médiale juste au-dessus de la veine fémoraleet en utilisant l'artère # 5 forceps. Tirez doucement sur la peau vers le haut et utiliser des ciseaux pour couper et enlever la peau.
   Remarque: la cuisse gauche est réservé en cas de complications chirurgicales (anomalies vasculaires, des vaisseaux rompus).
4. Appliquer environ 3-5 gouttes de solution saline à 0,9% site chirurgical. Cela permet une plus grande agrandissement des navires, ainsi que du maintien du site hydratée et prévenir le séchage des navires. Séparer la veine fémorale de l'artère en disséquant sans ambages dans le faisceau neurovasculaire fémorale à l'aide de deux # 5/45 forceps.
5. Placez deux, trois morceaux de cm de suture chirurgicale sous l'artère fémorale environ 1 cm. Tordez le fil de suture dans le sens horaire supérieure pour créer un garrot vasculaire qui aidera à prévenir la perte excessive de sang pendant un cathétérisme.
6. Faire une petite incision dans l'artère fémorale à l'aide des ciseaux à ressort. Placer le cathéter dans l'artère à travers l'incision et l'avance jusqu'à ce que le cathéter est en toute sécurité, à l'intérieur de l'artère.
7. détordre la suture supérieure (garrot) pour évaluer l'étanchéité et la pose du cathéter approprié. Fixer le cathéter dans l'artère fémorale en reliant deux noeuds autour du cathéter dans le vaisseau à l'aide des sutures.
8. Injecter 10 ul d'héparine (100 Ul / ml) à travers le cathéter pour empêcher la coagulation du sang. Ensuite, fermez chirurgicalement la cuisse droite en cousant la peau avec une suture 4-0 dans un modèle interrompu simple.
9. Injecter 50 ul d'uréthane (1,2 mg / g) par voie intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit. Répéter Cinq minutes plus tard d'une autre injection de 50 ul pour le quadrant inférieur gauche, pour un total de 100 ul d'uréthane intraperitoneale. Réduire lentement la niveaux isoflurane à environ 0,25%, tandis que revérifier concomitamment la souris pour la profondeur de l'anesthésie.
   Remarque: Gardez l'aiguille superficielle dans la cavité péritonéale le long de la paroi abdominale postérieure de sorte qu'il ne perfore pas l'intestin. Ceci peut être réalisé en pinçant le rectus abdominale muscles loin de viscères et ensuite injecter.
10. En utilisant un tube capillaire, recueillir un échantillon de 40 ul de sang artériel à partir du cathéter. Fixer le cathéter à transducteur de pression sanguine équipé d'un robinet d'arrêt à quatre voies rempli de solution saline et d'héparine seringue remplie.
11. Tape le transducteur de pression sanguine à l'appareil chirurgical à empêcher le retrait accidentel du cathéter. Commencer la surveillance de la pression artérielle moyenne.
12. Insérer le tube capillaire rempli de sang dans un orifice d'entrée de l'analyseur de gaz du sang. Une fois que tout le sang a été extrait, enlever le tube capillaire à partir de l'orifice d'entrée. Les niveaux de gaz sanguins _{2 O} 2 et CO apparaîtront sur ​​un document imprimé de l'analyseur des gaz du sang.

4. L'injection du colorant fluorescent

1. Pincer la peau sur la cuisse gauche médial utilisant le # 5 forceps. Tirez doucement sur la peau vers le haut et utiliser des ciseaux pour couper et enlever la peau. Préparer dextran conjugué rouge émettant colorant rhodamine(70 kDa) (10 mg / kg dissous dans du sérum physiologique).
2. Situer l'fémorale vein.Using une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G attachée, dessiner une solution préalablement préparée d'un colorant fluorescent approprié pour l'imagerie à la ligne 130 pi de la seringue. Retirez toutes les bulles d'air en tirant le colorant complètement dans la seringue et feuilletant fermement la paroi de la seringue.
   1. Pliez le aiguille de 30 G à un angle d'environ 30 degrés en le pressant contre une surface dure côté biseau vers le haut. Remplir l'aiguille avec le colorant et jeter tout excès de liquide, en laissant un échantillon de 100 ul.
3. Injecter l'échantillon de 100 ul de colorant lentement dans la veine fémorale. Après avoir retiré l'aiguille, appliquer stable, doucement pression sur le site d'injection pour arrêter le saignement. Laisser le colorant de circuler pendant 5 minutes.
   Remarque: alternativement, la veine fémorale droite peut être utilisé à la place de l'injection de colorant fluorescent pour prévenir la perte de sang à travers la création d'un autre site chirurgical. En outre, si leanimal est incontrôlable saignait du site chirurgical, ce peut être une indication que trop héparine a été donné pour rincer le cathéter. Si il n'y a pas de coagulation dans les 10-15 min et la souris saigne encore, envisager le redémarrage de l'expérience avec une nouvelle souris.
4. Fermez la cuisse gauche en cousant la peau avec une suture 4-0, puis retournez soigneusement la souris sur son estomac, et le placer dans le faisceau de plaque frontale de la souris.

5. In Vivo Imaging deux photons

1. Déplacez l'appareil chirurgical pour le microscope à deux photons, en veillant à maintenir les niveaux d'anesthésie continues. Placer une petite quantité de solution saline à 0,9% dans le réservoir de plaque de tête et le bas de l'objectif de microscope de sorte qu'il entre en contact avec la solution saline. Localisez la zone d'intérêt en utilisant l'objectif de fond clair de visualisation
2. Réglez l'excitation laser à deux photons à une longueur d'onde appropriée pour le colorant fluorescent. Commencez imagerie à deux photons utilisant le 25x objectif.
   Notez que dans ces expériences, nous avons utilisé un dextrane conjugué à un rouge émettant rhodamine colorant qui était excité à une longueur d'onde de 780 nm. Un filtre passe-bande 607/36 d'émission pour détecter la fluorescence du colorant, et un filtre passe-bande 480/20 d'émission a été utilisé pour détecter artériel autofluorescence
3. Localiser un capillaire lit sur l'écran d'affichage, et magnifier ce domaine en utilisant le zoom optique 2. images Acquérir des capillaires en utilisant le logiciel d'imagerie à deux photons.
4. Après l'imagerie est terminée, sacrifier la souris par dislocation cervicale suivie par décapitation.

6. imagerie ex vivo à deux photons

1. En utilisant les ciseaux fins supplémentaires, faire une incision dans le cuir chevelu à partir des os interpariétales aux os frontaux de la souris. Fixer la peau sur les côtés du crâne avec l'index et le pouce.
2. Placez les ciseaux fins supplémentaires sous l'os interpariétal médial et couper le crâne le long de la suture sagittale. Arrêter de couper le crâne d'environ 3 mm après avoir marqué le bregma.
   Note: Appliquer une pression à la hausse lors de la coupe du crâne pour éviter la coupe du cerveau.
3. En utilisant les # 5 forceps, séparer le crâne du cerveau et retirez soigneusement tous les méninges de la surface du cerveau. Méninges restants peuvent accidentellement lacérer le cerveau; un soin extrême doit être pris pour éviter cela. Faites glisser délicatement les # 5 pince sous le cerveau avançant lentement vers l'avant jusqu'à ce que le cerveau est libre de crâne.
   Remarque: cette pression vers le bas doit être utilisé pour éviter de perforer le cerveau.
4. Placer le cerveau dans un outil de coupe spécifique pour le cerveau des souris. Laver le cerveau en appliquant des gouttes de liquide céphalo-rachidien artificiel sur le cerveau.
5. Retirer une section coronale 2 mm du cerveau de bregma 0 à -2 bregma. Placer la section coronale sur une lame de verre concave contenant du liquide céphalorachidien artificiel avec le bregma 0 (plus d'une partie de la section crânienne) vers le haut. Couvrir délicatement le sl du cerveauglace avec une lamelle de verre.
   Remarque: Evitez d'appuyer sur le verre une fois placés sur la partie du cerveau que cela peut déformer l'architecture vasculaire.
6. Placer les lames dans la platine du microscope et de placer une petite quantité de solution saline 0,9% sur la lamelle. Abaisser l'objectif du microscope jusqu'à ce qu'il entre en contact avec la solution saline. Repérez la ligne médiane du cerveau en utilisant l'objectif de fond clair.
7. Commencez imagerie à deux photons et de localiser la ligne médiane à nouveau en utilisant l'objectif 25x. Atteindre cet objectif en recherche de la fissure longitudinale à la surface corticale de la section coronale. Placez le bord droit de l'écran d'imagerie sur la ligne médiane et de déplacer l'écran de visualisation plus latéralement trois trames complètes (environ 1,5 mm de la ligne médiane).
   A noter que dans ces expériences, les paramètres d'imagerie sont identiques à ceux mentionnés dans la note à l'étape 5.2.
8. Localisez la profondeur à laquelle les capillaires sont à peine visibles sur l'écran d'affichage. Abaissez le plan de mise au point d'un montant supplémentaire de 20um afin de déterminer le sommet de la pile-z.
9. Réglez l'épaisseur de l'image à 1 pm. Abaisser l'écran d'affichage pour 100 um et ajuster la puissance du laser tout au long de sorte que moins de 1% des pixels sont sursaturé.
   Note: les images z-stack sont compilées à partir d'une série de 100 images 500x500x1 consécutive um. Plus le z-stack les plus précis les calculs de post-traitement seront. En général, tenter de recueillir un z-pile de 100 pm ou plus.
10. Appuyez sur l'icône de répétition XY puis sur l'icône de XY adjacente. Une fois que le z-pile est terminée, appuyez sur l'icône de la série Fait et enregistrez le fichier.

7. Traitement des données

1. Ouvrez une image dans vivo capillaire dans le logiciel ImageJ. Définir manuellement le pixel ratio de distance basée sur des valeurs obtenues à partir du logiciel à deux photons.
   1. Sélectionnez le * droit * icône dans le menu Outils. Tracez une ligne allant d'un mur capillaire à l'oppoparoi des capillaires du site, et d'enregistrer la longueur fournie par ImageJ.
      Notez qu'il peut être nécessaire de faire un zoom dans l'image afin de visualiser clairement les bords des parois des capillaires.
   2. Répétez l'étape 7.1.1 à différents endroits le long du capillaire, ainsi que de multiples capillaires dans l'image.
2. Ouvrez le fichier z-pile dans le logiciel d'analyse tels que Amira. Sélectionnez l'icône Filament éditeur de la barre d'outils sous-application
   1. Réglez l'épaisseur de spectateur à environ 20. Déplacer le spectateur soit en haut ou en bas de la z-stack.
   2. Sélectionnez l'icône Trace et déplacer le curseur sur l'image chargée. La place noeuds sur les capillaires aux endroits décrits dans la figure 2C; segments apparaissent automatiquement entre les noeuds voisins. Trace capillaires à travers l'ensemble du z-stack.
      Remarque: il sera nécessaire de placer des noeuds entre les points d'extrémité et des points de branchement afin de tracer les capillaires Throughout le z-stack.
   3. Pour supprimer ces nœuds, cliquez sur l'icône Retirer intermédiaire.
      Note: Ceci peut créer des segments en boucle erronées qui doivent être enlevés manuellement en sélectionnant la boucle en utilisant l'icône Single Select, puis en sélectionnant l'icône Supprimer la sélection. Si boucles continuent à apparaître dans la même zone pendant le dépistage, il est probable que les nœuds ont été placés sur différents capillaires.
   4. Une fois le tracé est terminée, sélectionnez l'icône Graphique infos pour ouvrir une feuille de calcul contenant les paramètres vasculaires extraites automatiquement. Le nombre de nœuds et segments sont disponibles sur l'écran principal de la vue.

Résultats

La fenêtre corticale mince crâne permet in vivo à deux photons imagerie de capillaires corticaux (Figure 1). Un endroit approprié à l'image montre de nombreux capillaires distinctes (figure 1A). Dans le même champ de vision, il n'y a pas de paroi cellulaire artériel autofluorescence, et il peut y avoir d'autres signaux fluorescents, tels que la fluorescence induites par le collagène, génération de second harmonique ^11<...

Discussion

La méthode décrite ici peut être appliquée à analyser les structures microvasculaires cérébrales dans une large gamme de modèles / paramètres expérimentaux. Pour la réussite de cette méthode, trois étapes critiques doivent être maîtrisées. Tout d'abord, la fenêtre mince crâne ne doit pas endommager le crâne ou du cerveau sous-jacent. Il est facile de percer le crâne lors de l'amincissement, ou provoquer une fuite vasculaire induite par la chaleur. Cela peut interférer avec la formation d'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging