Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d'un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

Résumé

Nous décrivons un ensemble de protocoles qui fournissent ensemble un hydrogel bioink de tissus imitant avec lesquels des constructions fonctionnelles et viables 3-D tissus peuvent être bioprinted pour une utilisation dans des applications in vitro de dépistage.

Résumé

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.

Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues.

Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Introduction

Au cours des dernières années, une variété de technologies sont devenues disponibles qui répond au besoin de sources alternatives d'organes et de tissus fonctionnels en cherchant à fabriquer, ou biofabricate, eux. Bioprinting a émergé comme l'un des plus prometteurs de ces technologies. Bioprinting peut être considéré comme une forme de robotique additif fabrication de pièces biologiques, qui peut être utilisé pour construire ou modèle viable structures d' organes similaires ou tissus comme en 3 dimensions. ¹ Dans la plupart des cas, bioprinting emploie 3 dimensions (3 -D) de dispositif d'impression qui est dirigée par un ordinateur pour déposer des cellules et des biomatériaux dans des positions précises, récapitulant ainsi anatomiquement imitant les architectures physiologiques. ² Ces dispositifs impriment un "bioink", qui peut prendre la forme d'agrégats de cellules, cellules encapsulées dans des hydrogels ou des fluides visqueux ou des microsupports de cellules ensemencées, ainsi que des polymères exempts de cellules qui fournissent une structure mécanique ou d'agir comme pla acellulaireceholders. ^3,4 Après le processus de bioprinting, la structure résultante peut être mûri dans des structures de tissus ou d' organes fonctionnels, et utilisés pour son application finale prévue. ^5,6 A ce jour, une application totalement fonctionnelle organe humain de taille complète n'a pas été imprimé, mais il reste le principal objectif à long terme de bioprinting recherche et développement. ² Toutefois, à petite échelle constructions de tissu "organoïdes" sont actuellement mises en œuvre dans un certain nombre d'applications, y compris la modélisation de la pathologie, le développement de médicaments, et le dépistage de la toxicologie.

L'un des principaux obstacles que les chercheurs ont rencontrées dans l'application de la technologie de bioprinting est que très peu de matériaux ont été développés dans le but explicite de bioprinting. Pour réussir efficacement à bioprinting, un biomatériau doit répondre à 4 exigences de base. Le biomatériau doit avoir 1) les propriétés mécaniques appropriées pour permettre le dépôt (que ce soit l'extrusion à travers une buse sous forme de gel ou d'un inkjet comme une gouttelette), 2) la capacité de tenir sa forme en tant que composante d'une structure 3-D après le dépôt, 3) la capacité de contrôle de l'utilisateur des 2 caractéristiques antérieures, et 4) une cellule environnement amical et solidaire du tout phases de la procédure de bioprinting. ⁷ Historiquement, bioprinting travail a souvent essayé d'employer biomatériaux traditionnelles existantes dans les dispositifs de bioprinting sans tenir compte de leur compatibilité, au lieu de concevoir un biomatériau pour avoir les propriétés nécessaires pour bioprinting et les applications post-impression ultérieures.

Une variété de bioinks ont été développés récemment pour améliorer l'interface avec le matériel de dépôt et la fabrication. systèmes d'hydrogel standard posent des problèmes importants car ils existent généralement soit comme précurseur des solutions fluides avec des propriétés mécaniques insuffisantes, ou hydrogels polymérisés que si imprimés peuvent obstruer les buses ou deviennent rompu sur le processus d'extrusion. Notre équipe, ainsi que others, ont exploré diverses formulations d' hydrogel pour résoudre ces problèmes bioprinting, y compris l' impression sphéroïde cellulaire dans des substrats d'hydrogel, ^5,8 cellulaire et hydrogel filament extrusion de tubes microcapillaires, ^9-11 extrudables acide hyaluronique (HA) -Gold hydrogels de nanoparticules ayant des propriétés dynamiques de réticulation , ¹² contrôle temporel de la rigidité d'hydrogel en utilisant photopolymérisable méthacrylatée HA et de la gélatine, ¹³ réticulation à base de fibrinogène-thrombine, ^14,15 échange ionique gels d'alginate-collagène, ¹⁶ et récemment polymérisation rapide de la lumière ultraviolette (UV) réticulation -initiated, ¹⁷

Ces exemples démontrent la faisabilité des matériaux générant qui peuvent par bioprinted efficacement. Cependant, en plus de l'intégration avec le matériel, afin de générer avec succès des constructions viables et fonctionnelles des tissus en 3-D, les biomatériaux doivent contenir les indices biochimiques et mécaniques qui aident à maintenir cellulairela viabilité et la fonction. Ces facteurs supplémentaires, profils biochimiques et mécaniques, peuvent avoir une influence significative sur la fonction réussie des constructions de tissu bioprinted.

Les deux cellules et la matrice extracellulaire native (ECM) sont chargés de présenter une large gamme de molécules de signalisation telles que des facteurs de croissance et d'autres cytokines à d'autres cellules. La combinaison de ces signaux varie d' un tissu à l'autre , mais il peut être extrêmement puissant et influent dans la régulation du comportement cellulaire et tissulaire. ¹⁸ En utilisant des composants ECM spécifiques de tissus provenant de différents organes et la mise en oeuvre comme un hydrogel ou dans le cadre d'un hydrogel a été explorée avec succès. ^19-21 Cette approche, qui est constituée d'un tissu donné décellularisation, la pulvérisation, et le dissoudre, peut être utilisé pour produire des signaux biochimiques spécifiques aux tissus de tous les tissus et peuvent être incorporés dans les trois dimensions des constructions d'hydrogel. ²²

De plus,il est largement documenté que les tissus dans le corps occupent une large gamme de raideurs. ²³ Par conséquent, la possibilité de régler les propriétés mécaniques des biomatériaux, tels que le module d' élasticité E 'ou module élastique de cisaillement G' est un outil utile dans l' ingénierie tissulaire . Comme décrit ci-dessus, le contrôle des propriétés mécaniques bioink permet biofabrication à base extrusion utilisant un gel mou, qui peut alors en outre manipulé par réticulation secondaire à un stade ultérieur, à quels niveaux de module élastique peuvent être atteints qui correspondent à celle du type d'organe cible. Par exemple, les biomatériaux peuvent être personnalisés pour correspondre à une rigidité de 5-10 kPa comme un foie natif, ²³ ou correspondre à une rigidité de 10-15 kPa comme tissu cardiaque native, ^24,25 en théorie augmenter la capacité de ces organites à fonctionner d'une manière similaire à celle de leurs homologues natifs de tissus. L'influence de la rigidité de l'environnement sur le phénotype cellulaire a été explored au cours des dernières années, en particulier en ce qui concerne les cellules souches. Engler et al. , Ont démontré que le substrat élasticité assistée dans la conduite des cellules souches mésenchymateuses (MSC) vers lignages avec l' élasticité des tissus correspondant à celle du substrat. ²⁵ Ce concept a été étudiée plus à la différenciation en muscle, la fonction cardiaque, phénotype hépatique, souche hématopoïétique prolifération cellulaire et le maintien du potentiel thérapeutique des cellules souches. ^24,26-29 Etre capable de régler un hydrogel à différents modules d' élasticité est une caractéristique importante d'un biomatériau qui sera utilisé pour biofabricate constructions de tissu. ³⁰

Nous décrivons ici un protocole qui représente une approche polyvalente utilisée dans notre laboratoire pour formuler un système d'hydrogel qui peut être extrusion bioprinted et adapté à 1) contiennent le profil biochimique d'un type de tissu particulier et 2) mimer le module d'élasticité de ce type tissulaire . En répondant à ces exigences, nous visons à pournir un matériau qui peut récapituler les caractéristiques physico - chimiques et biologiques in vivo des tissus. ³¹ Le système composite d'hydrogel modulaire décrit ici tire profit d'une approche multi-réticulation pour donner bioinks extrudables et permet une réticulation secondaire pour stabiliser et augmente la rigidité de la les produits finis pour correspondre à une variété de types de tissus. personnalisation Biochemical est remplie en utilisant des composants ECM spécifiques de tissus. En guise de démonstration, nous employons une variété de ce système d'hydrogel spécifique du foie à BioPrint foie fonctionnelle des constructions organoïdes. Le protocole décrit utilise un dispositif de bioprinting 3-D personnalisé. En général, ce protocole peut être adapté à la plupart des imprimantes à base extrusion, les paramètres d'impression spécifiques varient considérablement pour chaque type d'appareil et nécessitent des tests par l'utilisateur.

Protocole

1. hydrogels Bioink Formulations et préparation

1. Afin de fournir des profils biochimiques spécifiques aux tissus, la préparation spécifique d' un tissu d'ECM des solutions de digestion comme décrit précédemment pour le foie. ²⁰
   Remarque: En général, cette digestion ECM comprendra 40% du volume de bioink d'hydrogel final qui est utilisé. Plusieurs centaines de millilitres de solution ECM digest peuvent être préparés, aliquotés et congelés à -80 ° C pour une utilisation future.
2. Avant l'hydrogel formulation, on dissout un photo-initiateur, la 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyéthoxy) -2-méthylpropiophénone, dans l'eau à 0,1% p / v.
   Note: Les volumes de la gamme 50-100 ml peuvent être préparés à l'avance et stocké à l'abri de la lumière à 4 ° C pendant plusieurs mois.
3. Pour former bioinks hydrogel, d'abord dissoudre les composants matériels de base de l'acide hyaluronique (HA) kits d'hydrogel dans la solution eau-photoinitiateur.
   1. Dissoudre la gélatine thiolé HA et thiolée séparément dans de l'eau-psolution hotoinitiator (étape 1.2) pour faire 2% p / v solutions.
   2. Dissoudre le diacrylate de polyethylene glycol (PEGDA), l'agent de réticulation dans les kits d'hydrogel dans une solution d'eau-photoamorceur (étape 1.2) pour fabriquer une solution à 8% p / v.
   3. Dissoudre le polyéthylène glycol (PEG) alcyne 8-Bras (10 kDa MW) dans une solution d'eau photoinitiateur (étape 1.2) pour faire une solution à 8% p / v.
4. En général, former des hydrogels en utilisant le schéma suivant, bien que la personnalisation supplémentaire est possible.
   1. Combinez 4 parties 2% thiolé HA, 4 parties de 2% gélatine thiolé, 1 partie réticulant 1, 1 partie réticulant 2 avec 8 parties de solution d'ECM de tissus et 2 parties milieux de culture des hépatocytes (HCM) (ou 10 parties d'eau en tant que non-tissu générique un hydrogel spécifique de).
      Note: HA supplémentaires non modifié ou de la gélatine peuvent être ajoutés pour rendre le extruder de bioink plus en douceur. Ceci est décrit ci-dessous.
5. Vortex le mélange obtenu sur la haute (vitesse 10 sur 10) pendant 10 secondes pour mélanger avant utilisation.
6. Utilisation d'un hydrogel bioink
   1. Pour l'extrusion ou les essais de bioprinting, transférer le mélange dans une cartouche de seringue ou de l'imprimante et laissez-le réticule spontanément pendant 30 min (étape 1 réticulation) à 37 ° C.
   2. Pour les mesures rhéologiques, et transférer le mélange dans une boîte de Petri de 35 mm et lui permettre de se réticuler pendant 30 minutes.
      Remarque: Le mélange commence immédiatement à se réticuler par formation d'une liaison thiol-acrylate et commencera à augmenter la viscosité. Le mélange doit être transféré dans une seringue, une cartouche d'impression, ou d'un emplacement cible à l'intérieur de 10 minutes pour éviter le colmatage d'une pipette ou d'une seringue pendant le transfert.
   3. Lors de la réticulation secondaire (stade 2) est souhaitée, irradier le stade 1 de gels réticulés avec de la lumière ultraviolette (365 nm, 18 W / cm ²⁾ pour initier une réaction de polymérisation de thiol-alcyne.
      Remarque: La durée de l'irradiation dépend de la surface spécifique du matériau. En général, un centimètre carré de matériau ne nécessite que 1-2 secondes d'exposition aux UV à cette puissance UV.

2. Compatibilité imprimante Test

1. Avant les essais d'intégration avec des dispositifs de bioprinting, les caractéristiques d'extrusion d'essai sur le banc de laboratoire avec des tests d'extrusion simples en utilisant des seringues standard et petites pointes d'aiguille de calibre 20-30 (écartement).
   1. Poussez le bioink à travers une seringue standard pour obtenir des filaments extrudés en douceur d'hydrogel avec peu ou pas de bosses. Extrusion de lignes ou de motifs simples est suffisante pour déterminer le succès.
2. Pour l'intégration de bioprinter, charger bioink préparations en les pipetage dans des cartouches d'imprimante, et permettre à 30 min pour le bioink à subir spontanée étape 1 réticulation dans la cartouche.
   Note: Le volume de bioink dépend de l'application spécifique et doit être déterminée par l'utilisateur. Les cartouches d'imprimante peuvent ressembler ou être des seringues qui sont compatibles avec le dispositif de bioprinter.
3. Évaluer la compatibilité d'extrusionpour bioprinting en imprimant un motif simple en utilisant le bioink. Par exemple, imprimer un motif 7 x 7 mm composé de lignes parallèles. Appliquer une pression (par exemple 20 kPa , pression pneumatique) , tandis que la tête d' impression se déplace dans le plan XY à une vitesse approximative de 300 mm / min.
   Remarque: Les diamètres des buses des têtes d'impression de différentes tailles peuvent être utilisées, mais avec des ouvertures coniques, des buses d'un diamètre de 400 à 500 um sont optimales pour l'impression sphéroïdes dans la plage allant de 250 à 350 pm.
   1. Si les matériaux extrudés sont bosselés ou irrégulière, voir l'étape 2.4, ou de réduire la quantité de PEGDA pour ramollir le matériau réticulé étape 1. formulations bioink adéquatement préparées extruder en douceur, ce qui permet un dépôt précis dans des modèles ou des architectures souhaitées.
      Note: Les procédures de bioprinting utilisation décrit un dispositif de bioprinting 3-D conçu sur mesure en interne spécifiquement pour les tissus construire l' impression ³² En tant que tels, les paramètres d'impression spécifiques varient considérablement pour chaque type d'appareil et nécessitent testin.g par l'utilisateur.
4. Pour améliorer les propriétés d'extrusion, de compléter et de la gélatine non modifiée HA aux bioinks (1,5 mg / ml et 30 mg / ml, respectivement).

3. Validation par Bioprinting avec primaire du foie Constructs

1. Préparer 3-D sphéroïdes de foie de cellules primaires par pendaison méthodes de dépôt en tant que composant cellulaire ³³
   Remarque: Bioprinting peut être effectuée sans sphéroïdes, mais au contraire avec les cellules individuelles en suspension dans l'hydrogel bioinks aussi bien. Spheroids sont employés ici pour accélérer les interactions cellule-cellule et construire fonctionnalité. Le nombre de sphéroïdes ou des cellules utilisées dépend de l'application spécifique et doit être déterminée par l'utilisateur. Ces étapes doivent être effectuées dans des conditions stériles, en utilisant des fournitures stériles.
   1. Préparer HCM en ajoutant le contenu décongelés du kit de composants de complément HCM aux médias hépatocytes basale (HBM) et le filtrage stérile.
      1. Décongeler les composantes de suppléments nontil liquide.
      2. Ajouter les composants du complément (acide ascorbique, 0,5 ml, sérum-albumine bovine [acide gras libre], 10 ml, gentamicine sulfate / amphotéricine B, 0,5 ml, hydrocortisone 21-hémisuccinate, 0,5 ml, insuline, 0,5 ml, facteur de croissance épidermique humain recombinant , 0,5 ml, transférer 0,5 ml) à 500 ml HBM.
      3. Filtre stérile à travers un filtre de 0,45 um um ou 0,22 en utilisant une unité de filtration sur flacon ou un filtre à embout de la seringue.
   2. Déterminer la densité de cellules d'hépatocytes primaires humains, les cellules de Kupffer et les cellules étoilées par comptage sur un hémocytomètre après chaque type cellulaire a été décongelée selon les instructions du fabricant.
   3. Combiner les hépatocytes primaires humains, les cellules de Kupffer et les cellules étoilées dans un rapport 80:10:10 par le nombre de cellules dans un milieu HCM qui a été chauffé à 37 ° C dans un tube conique.
      Remarque: Le volume des médias à utiliser dépend du nombre total de cellules spécifiques à l'application et devrait être déterminé par ee utilisateur.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 520 xg à 20 ° C.
   5. Aspirer le surnageant, en laissant le culot cellulaire.
   6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu HCM pour obtenir une suspension de cellules contenant 1.000 cellules par 40 ul support. Le volume total est fonction du nombre de sphéroïdes sont produites.
   7. Transférer la suspension cellulaire à des plaques de chute format de suspension à 96 puits. Ajouter un total d'environ 1000 cellules à chaque puits dans HCM et maintenir à 37 ° C, dans 5% de CO ₂ pendant 3 jours au cours de laquelle sphéroïdes multicellulaires forment.
   8. Collecter sphéroïdes de foie de la plaque de goutte suspendue à l'aide d'une pipette. Transférer dans un tube de 15 ml conique stérile.
2. sphéroïdes hépatiques Bioprint dans spécifique du foie hydrogel bioink
   1. Préparer une formulation contenant du foie ECM hydrogel bioink comme décrit dans l'étape 1, en utilisant 8% et 8% PEGDA 8-bras PEG alcyne comme réticulants. Utilisez cette combinaison pour sa capacité à resulting dans un hydrogel à proximité du module d'élasticité de cisaillement dans les tissus du foie natif.
   2. Laissez les sphéroïdes se déposent au fond du tube conique dans laquelle ils ont été placés à l'étape 3.1.7. Cela varie en fonction de la taille et de la densité sphéroïde, mais se produit généralement dans les 1-2 min. Retirez tous les médias par soigneusement aspiration ou avec une pipette.
   3. Transférer le volume désiré de solution fraîchement préparée hydrogel bioink dans le tube conique contenant les sphéroïdes. En général, un volume approprié est de 10% à 25% supérieur au volume de la construction en 3-D à imprimer. Pipetter prudemment haut et bas pour remettre en suspension les sphéroïdes dans la solution hydrogel bioink. Transférer une cartouche de bioprinter à l'aide d'une pipette ou d'une pipette sérologique.
   4. A l'intérieur de la cartouche de bioprinter, laisser la solution à subir la première phase de réticulation (réaction de l'acrylate de thiol) pendant 30 min.
      Remarque: En fonction de la taille sphéroïde, la cartouche peut avoir besoin d'être lentement tourné ou peut-être besoin d'être mélangé avec le contenuune spatule stérile pour maintenir les sphéroïdes distribuées dans toute la bioink au cours de l'étape 1 réticulation. Ceci est moins d'une nécessité pour bioinks préparés avec des cellules en suspension au lieu de sphéroïdes.
      Note: Suite à l'étape 1 réticulation, les utilisateurs ont une fenêtre d'exploitation de plusieurs heures. Toutefois, il est recommandé d'effectuer rapidement le processus de bioprinting pour améliorer la viabilité des cellules.
   5. Après l'étape 1 réticulation, utiliser un dispositif de bioprinting pour créer des structures d'hydrogel souhaitées contenant les sphéroïdes hépatiques primaires (ou d'autres cellules).
      Remarque: Cette technologie fournit un système pour biofabricating une grande variété de structures. Des paramètres tels que volume total, le nombre de cellules ou sphéroïdes, la géométrie de la structure imprimée, et le substrat sur lequel sont imprimés des constructions sont fortement tributaires des objectifs de l'utilisateur.
   6. Après le dépôt dans la configuration désirée, à administrer une lumière UV pendant 2-4 secondes pour amorcer le mécanisme de réticulation secondaire, la stabilisation de la constructs et en augmentant la rigidité au niveau souhaité.
      Remarque: la concentration de PEG-alcyne, et donc la densité totale de réticulation finale, contrôle essentiellement la rigidité de la construction finale.
   7. Répétez les étapes 3.2.4 et 3.2.5 afin de créer des constructions multi-couches.

Résultats

Lorsque les procédures décrites ci - dessus sont suivies correctement, les hydrogels doivent contenir un profil biochimique spécifique au type de tissu cible, ²⁰ permettent un degré élevé de contrôle sur bioprinting et module d' élasticité finale, ³⁴ et soutenir des cellules fonctionnelles viables dans des constructions de tissus.

Hydrogel Personnalisation
Pour mieux f...

Discussion

Il y a plusieurs éléments qui sont essentiels à considérer lors de la tentative de biofabricate constructions de tissu 3-D, pour une éventuelle utilisation chez les humains ou pour des applications in vitro de dépistage. En utilisant les composants cellulaires appropriés détermine la fonctionnalité potentielle d'extrémité, tandis que le dispositif de biofabrication lui-même détermine la méthodologie générale pour parvenir à la construction finale. La troisième composante, le biomatériau, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronic acid	Sigma	53747
Gelatin	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primary human hepatocytes	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primary human liver stellate cells	ScienCell	5300
Primary human Kupffer cells	Life Technologies	HUKCCS
Hepatocyte Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatocyte Media Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Other manufacturers are ok.
Ammonium hydroxide	Fischer Scientific	A669	Other manufacturers are ok.
Fresh porcine cadaver tissue	n/a	n/a
Lyophilizer	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.
Hanging drop cell culture plate	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D Culture Platform