Utilisation Tomoauto: Un protocole pour la tomographie à haut débit automatisé cryo-électronique

Résumé

Nous présentons un protocole sur la façon d'utiliser à haut débit tomographie cryo-électronique pour déterminer haute résolution dans les structures in situ de machines moléculaires. Le protocole permet de grandes quantités de données à traiter, évite les goulots d'étranglement communs et de réduire l'indisponibilité des ressources, permettant à l'utilisateur de se concentrer sur des questions biologiques importantes.

Résumé

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introduction

III systèmes de sécrétion de type (T3SS) sont des déterminants de virulence essentiels pour de nombreux agents pathogènes Gram-négatifs. Le injectisome, également connu sous le complexe d'aiguille, est la machine de SST3 central nécessaire pour la translocation directe de protéines effectrices de la bactérie dans des cellules hôtes eucaryotes ^{1, 2.} L'injectisome comprend une aiguille extracellulaire, un corps de base, et un complexe cytoplasmique également connue comme le complexe de tri ^3. Des études antérieures ont permis d'élucider les structures 3-D de injectisomes purifiés de Salmonella et Shigella, ainsi que les structures atomiques de protéines majeures basale du corps ^{4, 5.} Récente dans les structures in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, et Yersinia ont été révélés par cryo-ET ^{6 , 7.} Cependant, le complexe cytoplasmique, essentielle pour la sélection d'effecteur et ensemble d'aiguille, n'a pas été visualisées dans ces structures.

Cryo-ET est le most technique convenable pour l'imagerie de machinerie moléculaire à une résolution nanométrique dans son contexte natif cellulaire (in situ). Néanmoins, la résolution obtenue par cryo-ET est limitée par l'épaisseur de l'échantillon. Pour pallier l'inconvénient, nous imagé injectisomes intactes dans une souche de Shigella flexneri virulente qui a été génétiquement modifié pour produire minicellules suffisamment minces pour la cryo-ET. Une autre limitation de cryo-ET est la sensibilité de l'échantillon au rayonnement induit par le faisceau d'électrons, qui détruit très rapidement l'information à haute résolution dans l'échantillon. En conséquence, des doses extrêmement faibles sont utilisés pour le basculement-images individuelles de telle sorte qu'une dose appropriée peut être répartie entre l'inclinaison de la série complète. Cela réduit considérablement le rapport signal sur bruit (SNR) dans la reconstruction finale, ce qui rend difficile de différencier les caractéristiques structurelles de l'objet à partir de la grande quantité de bruit dans le tomogramme et limite la résolution qui peut être obtenue par cryo- ET. Conventitraitement de l'image d'Onal comme Fourier et filtres-espace réel comme à la baisse échantillonnage peut être utilisé pour augmenter le contraste, mais au détriment de filtrer la plupart des informations à haute résolution. Récemment, la sous-tomogramme moyenne a permis d'augmenter considérablement le SNR et ensuite la résolution finale dans certains cas à des niveaux sub-nanométriques ^{8, 9.} Une analyse plus détaillée de complexes est rendue possible par l'extraction de calculs des milliers de sous-tomogrammes contenant les zones d'intérêt à partir des tomographies d'origine, puis l'alignement et la moyenne de la sous-tomogrammes pour déterminer in situ dans des structures complexes avec SNR plus élevé et de plus haute résolution. Ces méthodes peuvent être intégrées à des approches génétiques pour fournir encore plus de connaissances dans des assemblages macromoléculaires et leurs conformations dynamiques dans le contexte cellulaire natif.

En général, des dizaines, voire des centaines de milliers de sous-tomographies doivent être en moyenne afin de déterminer haute-Résolution structures in situ. L'acquisition d'un nombre suffisant d'inclinaison série nécessaire pour produire ce grand nombre de sous-tomographies devient rapidement un goulot d'étranglement. L'inclinaison de la série résultant sont souvent affectée par le déplacement induit par faisceau, jeu de scène, ainsi que l'agrandissement, rotation et inclinaison défauts, qui doit être résolu à apporter le tilt-série dans l'alignement avant la reconstruction. La série d'inclinaison est généralement aligné par Repérage or marqueurs de référence, qui sont traditionnellement choisis manuellement par l'inspection de l'inclinaison de la série, ce qui provoque encore un autre goulot d'étranglement. De nombreux logiciels ont été développés pour l'acquisition d'inclinaison série automatisé grâce à des microscopes électroniques contrôlés par l'ordinateur ^{10, 11, 12,} l'alignement tilt-série et de la reconstruction ^{13, 14 et} sous-tomogramme moyenne ^15-18. Comme ces paquets effectuer des opérations discrètes dans le workflow de cryo-ET, il devient souhaitable de construire un niveau d'abstraction plus élevé dans le processus de systemaquement de rationaliser l'ensemble du régime en un seul pipeline. Par conséquent, nous avons développé une bibliothèque de wrapper du logiciel "tomoauto" conçu pour organiser un certain nombre de ces paquets dans une unité semi-automatisé unique, permettant un fonctionnement utilisateur simple tout en conservant la configuration complète de chaque composant de manière centralisée. La bibliothèque est open-source, bien documenté, continuellement développé et librement disponible pour l'utilisation, le développement sur mesure ou une intégration plus au moyen d'un code source distante dépôt en ligne (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Ce haut-débit cryo-ET pipeline a été utilisée pour visualiser injectisomes intactes en S. minicellules flexneri. Un total de 1,917 tomographies ont été générés en utilisant cette méthode, révélant une haute résolution de la structure in situ de la machine intact, y compris la plate-forme de tri cytoplasmique déterminé par sous-tomogramme moyenne de ^19. Avec la modélisation moléculaire de type sauvage et mutant machines, notre pipeline à haut débit offre une nouvelle voie pour comprendre la structure et la fonction du injectisome intacte dans le contexte cellulaire natif.

Protocole

1. Préparation Minicell

1. Pour faire S. minicellules flexneri, transforment 1 ul de plasmide pBS58, qui exprime constitutivement les gènes de la division cellulaire d'Escherichia coli ftsQ, FtsA, et FtsZ à partir d'un faible nombre de copies spectinomycine résistant plasmide dans 5 ul électrocompétentes streptomycine résistant sérotype 5a (M90T-Sm) les cellules par électroporation à 2,5 kV pendant 5 ms à 1 mm cuvettes.
2. Les échantillons de conserver à -80 ° C dans 15% de glycerol dans un microtube de 1,5 ml cryogénique. Lorsque vous êtes prêt à l'emploi, gratter environ 5 pi de cellules de la microtube décongelés à l'aide d'une pipette et les cellules en suspension dans 4 ml de bouillon de soja tryptique avec spectinomycine ajouté à 100 pg / ml de concentration. Cultivez O / N à 37 ° C.
3. Introduire à la pipette 2 ml de la culture de bouillon de soja 1,2 dans 200 ml de spectinomycine à nouveau avec la trypsine a été ajoutée à 100 ug / ml de concentration. Croître à 37 ° C pour la phase logarithmique tardive.
4. Pour enrichir minicellules, centrifugeuse200 ml de la culture de 1,3 à 1000 g pendant 5 min. Versez délicatement la fraction de surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse et centrifuger à 20 000 g pendant 10 min. Versez délicatement et jeter la fraction de surnageant, et mélanger délicatement le culot avec le liquide restant à l'aide d'une pipette et transférer environ 100 pi du mélange de granulés à un tube de 1,5 ml.

2. EM préparation de grille

1. Placer un côté film de carbone de 200 mesh grille de cuivre carbone R2 / 2 à trous sur une lame de verre.
   NOTE: A / 2 grille de 200 mesh R2 est choisi pour maximiser le nombre d'inclinaison de la série qui peut être réglé à acquérir dans un carré de la grille unique tout en soutenant l'échantillon et en plaçant le bord du film de carbone dans le champ de la caméra au grossissement souhaité. Grilles à mailles plus fines et les petits films de carbone troué tels que R1.2 / 1.3 400-mesh peut être utilisé pour les échantillons imagés à un grossissement supérieur; plus grands films de carbone troué tels que R3.5 / 1 200 mesh peut être utiliséj pour les échantillons en image à un grossissement plus faible ou si la photographie ne doit pas contenir le bord de carbone et de films de carbone troué avec un plus grand espacement tel que R1 / 4 200 mesh peuvent être utilisés pour aider à l'alignement de la phase de la zone d'intérêt et la protection des zones de surexposition à se concentrer et de suivi des routines.
2. Placer la lame sur la plate-forme dans un dispositif à décharge luminescente.
   NOTE: Nous utilisons un dispositif en interne dans lequel une anode et la plate-forme a été usiné dans un dessiccateur à vide et est alimenté par un générateur à haute fréquence. Après avoir créé un vide, fixez la sonde de générateur haute fréquence à l'anode et la puissance sur la sonde pendant 1 min à décharge luminescente la grille. Le temps nécessaire pour la décharge luminescente la grille peut varier de quelques secondes à une minute. Varier le temps de décharge luminescente peut être utilisé pour diagnostiquer des problèmes avec la concentration de l'échantillon et les réseaux qui apparaissent sec, sans glace vitreuse.
3. Retirez la grille avec un ensemble de pinces, et verrouiller la pince fermée avec un b élastiqueet.
4. Ajouter 100 pi de 10 nm solution de l'or colloïdal au tube à centrifuger avec les minicellules préparés 1.4 et mélanger en tapotant doucement le tube avec un doigt. Avec une nouvelle pipette lieu le 4 pi du mélange sur la grille préparée en 2.2.
   NOTE: L'or colloïdal est disponible dans une variété de tailles et il faut prendre soin que la taille de l'or est de plus de 5 pixels étant donné la taille de pixel des micrographies à être transformés à l'agrandissement acquis, tandis que ne pas être trop grand pour caractéristiques obscures d'intérêt.
5. Préparer l'appareil plongée gel; remplir le réservoir externe de congélation à l'azote liquide, puis remplir la chambre intérieure avec de l'éthane liquide. Attacher la pince avec la grille de la tige de piston et verrouiller la tige de piston dans la position relevée.
   NOTE: Voir Iancu et al ²⁰ pour un protocole décrivant l'utilisation d'un appareil commercial plongée gel..
6. Sécher la grille en touchant soigneusement un morceau de papier filtre à til goutte d'échantillon jusqu'à ce que le ménisque entre la grille et le papier filtre sépare et la mèche sur le papier filtre arrête, puis relâchez immédiatement la tige de piston, le gel de la grille. Retirez délicatement la pince de la tige de piston et placer la grille dans un support de grille.
7. Préparer la station de transfert cryo-EM en remplissant le récipient de la pompe à la zone de chargement et l'absorption avec de l'azote liquide. Une fois que la zone de chargement est d'au liquide lieu de la température de l'azote le support de grille et une cartouche de spécimen de microscope dans la zone de chargement.
8. Retirez délicatement la bague de verrouillage, qui est soit un petit anneau de verrouillage fileté antérieures microscopes Polara ou un clip cycle C de style sur les modèles ultérieurs; placer la grille EM dans la cartouche en utilisant une pince, puis remettez doucement la bague de verrouillage en arrière sur la cartouche fixer la grille.
9. Retirer le porte-échantillon multiple du microscope et l'attacher à la station de transfert. Placez la cartouche de l'échantillon dans le porte-cartouches à l'aide des pinces unD rétracter le support de la zone de chargement et de transférer le support d'échantillon multiple vers le microscope.
   NOTE: Voir Chen et al ²¹ pour un protocole visuelle détaillant 2.1-2.9..

3. à haut débit Tilt-série automatisée Collection

1. Collection de faible grossissement Plans
   1. Ouvrez une nouvelle fenêtre Navigator en cliquant sur ​​«Ouvrir» dans le menu «Navigator» de SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Trouver cases de la grille qui contiennent des conditions acceptables d'imagerie (par exemple, la glace mince, pas de contamination, sujet d'intérêt) en utilisant l'écran fluorescent à faible grossissement (~ 2,300X pour le spécimen de minicellule).
      REMARQUE: [Facultatif:. Cette étape peut être automatisée avec SerialEM par par montage, l'ensemble du réseau, mais il peut être plus rapide pour sélectionner simplement quelques zones manuellement]
   3. Ajuster la phase de hauteur eucentrique par l'inclinaison du porte-échantillon à 50 ° puis ajusterla hauteur z jusqu'à ce que la translation de l'étage xy est minime entre les points de vue inclinés et non incliné.
   4. Déplacer vers le centre de la place de la grille et cliquez sur le bouton «Ajouter étape Pos» dans la fenêtre du navigateur pour mémoriser la position de stade actuel.
   5. Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que tous 3.1.1-4 positions acceptables en scène des cases de la grille ont été enregistrées.
   6. Ouvrez un nouveau fichier montage MRC en cliquant sur "Nouveau montage» dans le menu «Fichier». Dans le programme d'installation Montage de dialogue qui apparaît, sélectionnez un certain nombre de pièces en X et Y qui achètera le carré de la grille entière (par exemple, 10 x 10 pour une grille de 200 mesh standard). Utilisez un haut binning tels que 8 et sélectionnez le «Move scène au lieu de déplacer l'image» et «Passer corrélations utilisées pour aligner les pièces de boutons radio.
   7. Dans la fenêtre de navigation cliquez sur la première position de l'étape et réglez-le à acquérir en cochant la case «Acquire». Répétez cette opération pour chaque position de la scène dans la fenêtre Navigator.
   8. Ouvrez le navigateur Acquérir de dialogue en cliquant sur «Acquérir aux points 'dans le menu' Navigator '. Cochez la case 'image de carte Acquire »et cochez de eucentricity Rough et assurez-vous que toutes les autres cases ne sont pas cochées. Cliquez sur «Continuer» afin de recueillir un montage à chaque position de la scène.
2. Acquisition Tilt-série
   1. Dans la fenêtre Navigator sélectionnez l'une des cartes acquises et cliquez sur le bouton «Charge carte '.
   2. Dans la fenêtre de navigation cliquez sur 'Ajouter Points de bouton et sélectionnez points dans la carte à laquelle d'acquérir une inclinaison de la série. Puis cliquez sur «Stop Ajout de points de la touche. Répétez l'opération pour chaque carte recueillies.
   3. Dans le menu de l'appareil photo sélectionner «Paramètres» et de définir les paramètres pour les modes Mise au point, des essais et de la fiche. [Facultatif:. Dose-fractionne les données peuvent être spécifiés dans les paramètres pour le mode Record]
   4. Sélectionnez un point dans la fenêtre du navigateur et vérifier le «Tilt-Series9; cochez la case. Dans la fenêtre de dialogue Configuration Tilt-Series qui ouvre sélectionner les paramètres souhaité pour la collecte tilt-série. Répétez l'opération pour le reste des points sélectionnés dans la fenêtre du navigateur, mais ne sélectionnez pas les cartes.
   5. Dans le menu Navigator sélectionner à nouveau la «Acquérir aux points '. Dans le navigateur Acquérir dialogue choisissez 'Réalignez au point', Autofocus »et« eucentricity Rough que les tâches préliminaires, et sélectionnez «Acquérir série d'inclinaison 'que la tâche principale, et sélectionnez« Fermer les vannes de colonne à la fin »pour fermer la colonne quand tout des points ont été recueillies. Lors de poursuivre une inclinaison de la série seront recueillis à chaque point de chaque carte.

4. à haut débit traitement Tilt-série automatisée et de la reconstruction Utilisation Tomoauto

1. Correction de motion Beam-induite dans les données dose-fractionnées [facultatif]
   REMARQUE: Tomoauto utilise MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) pour enlever mouvement induit par faisceau de micrographies de dose fractionnée. NOTIONCORR ¹⁶ doit être installé sur le système.
   1. Avec l'inclinaison de la série originale, le journal de sortie de SerialEM ^{10 et} les images de la dose fractionnée individuels tous dans le répertoire de travail courant, dans un terminal, exécutez la commande:
      dose_fractioned_to_stack
      est le nom de l'inclinaison de la série à traiter.
2. Alignement et la reconstruction du Tilt-série
   REMARQUE: Tomoauto utilise par défaut IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) pour gérer l'inclinaison de la série automatisé génération de modèle de repère, l'alignement, la détermination de la fonction de transfert de contraste (FCE), la FCE-correction ^23, et reconstruction. Alternativement utilisateurs ont la possibilité d'utiliser dans tomoauto RAPTOR ²⁴ (inclus dans IMOD) pour automatisé génération de modèle de repère, la FCEFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) pour déterminer le FCT, et tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) pour la reconstruction ou de toute combinaison de logiciels par configuration. Cette configuration ainsi que les paramètres disponibles dans chaque colis est assurée par un fichier de configuration globale qui peut être modifié en fonction des valeurs les plus couramment utilisées dans un laboratoire alors que les fichiers de configuration locaux peuvent également être créés à des paramètres de détail utilisé pour un spécimen spécifiques, collecte définir ou individuelle tilt-série. Tous les paquets qui souhaitent être utilisées doivent être installés sur le système.
   1. Avec l'inclinaison de la série dans le répertoire de travail courant, dans un terminal exécuter la commande
      tomoauto --CTF --mode = align
      est l'inclinaison de la série à traiter et est le Diameter des marqueurs de référence dans nanomètres. Cette commande permettra d'aligner et d'estimer le FCT de l'inclinaison de la série automatiquement. Il est possible de sauter le traitement FCT en supprimant l'option --CTF de la commande.
   2. Inspectez le tilt-séries alignées visuellement pour des erreurs flagrantes dans le traitement d'alignement et d'inspecter le FCT estimée en exécutant les commandes:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      respectivement, où est le nom de l'inclinaison de la série sans suffixe. Vérifiez également la sortie de la commande de tomoauto pour voir l'erreur résiduelle moyenne générée par l'alignement, qui est une statistique quantitative de la qualité de l'alignement.
   3. Étant donné un alignement acceptable de procéder de traitement en exécutant la commande:
      tomoauà --CTF --mode = reconstruire
      avec les mêmes substitutions d'utilisateur comme en 4.2.1. Cette commande va corriger le FCT, effacer les marqueurs de référence de l'inclinaison de la série et calculer la reconstruction. Encore une fois le traitement de la FCE peut être ignorée comme en 4.2.1.
   4. [facultatif] Pour sauter l'étape de l'inspection visuelle et automatiser entièrement le traitement et la reconstruction exécuter la commande
      tomoauto --CTF
   5. [facultatif] Pour utiliser une configuration locale spécifique, reportez-vous à la documentation de tomoauto sur la façon de générer un fichier de configuration local, puis exécutez la commande
      tomoauto [options] -L
      où est le nom de la conf localefichier iguration.

5. Sous-tomogramme moyenne

NOTE: Nous utilisons le paquet de ¹⁵ i3 (http://www.electrontomography.org/) pour traiter les expériences de moyenne sous-tomographie, mais le protocole décrit applique généralement à la plupart disponibles sous-Tomogram expériences sous-tomographie de processus de packages16to logiciel de calcul de la moyenne de la moyenne, cependant le protocole décrit applique généralement disponible à la plupart des sous-tomogramme logiciels de calcul de la moyenne ^{de 16-18.}

1. Avec la tomographie reconstruit dans le répertoire de travail courant ouvrir le tomogramme pour la cueillette de particules en exécutant la commande:
   tomopick .rec
   où est comme dans 4.2.2. Dans la fenêtre qui ouvre utiliser le bouton gauche de la souris pour cliquer sur la première basale du corps, puis la pointe d'aiguille pour sélectionner un injectisome et utiliser les touches fléchées haut et bas pour riff à travers les tranches de la tomogram. Sélectionnez tous injectisomes visibles de cette manière. Cette mémorise les coordonnées dans un fichier texte qui définissent l'axe longitudinal de la structure, ainsi que de l'estimation de deux trois angles d'Euler qui décrit l'orientation de la structure.
2. Extrait de calcul 400 ³ voxels cubes de la tomographie centré au milieu de l'axe de temps défini par l'exécution de la commande:
   couper redimensionnement -cx -cy -CZ -ix 400 400 -iy -iz 400
   .rec _001.mrc
   où , , sont les coordonnées milieu de la structure et est comme dans 4.2.2. La taille du cube extrait devrait varier selon la structure et le grossissement utilisé, et devrait être suffisamment grand pour englober adéquatement la structure d'intérêt, qui, pour cet échantillon est de 400 ³ voxels.
3. Down-échantillon (bin) du sous-tomographie par un facteur de quatre à réduire le temps de calcul pour l'alignement initial en exécutant la commande:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   où est aussi en 5.2.
4. Appliquer le Euler déterminé angles à des sous-tomographies et calculer la moyenne mondiale pour produire le modèle initial en exécutant la commande.
   I3totsum.sh
5. Aligner et classer les sous-tomographies bas-échantillonnés en utilisant un masque de classification binaire de la zone cytoplasmique. Effectuez sous-tomogramme moyenne dans l'espace de Fourier pour minimiser les artefacts de coin manquants caractéristiques de la tomographie. Pour binning données 4, s'il vous plaît utiliser SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Répétez l'étape 5.5 en utilisant des sous-tomographies-échantillonné par un facteur de deux (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") et une fois de plus avec les données d'origine (SAMPFACT =" 1 1 1 »).
   i3mramsacls.sh

Résultats

Des échantillons de minicellules S. flexneri ont été recueillies et traitées comme montré sur la figure schématique 1, en ​​utilisant le pipeline suivant tomoauto détaillée sur la figure 2. Tilt-séries ont été recueillies à l'aide SerialEM ^10, qui permet à haut débit acquisition tilt-série aux points désignés par l'utilisateur sur les cartes de montage ?...

Discussion

La méthode à haut débit décrit ici nous a permis de traiter 1917 cryo tilt-série et de produire plus de 4500 sous-tomographies de la intacts S. flexneri injectisome ^19. Les données recueillies ont abouti à la caractérisation détaillée de injectisome in situ, y compris le tri complexe cytoplasmique. Le procédé a également été utilisé pour visualiser plusieurs cellules mutantes avec deletion spécifique de composants protéiques putatifs, ce qui a permis d'élucide...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org