Le "Rotifer Polyculture Méthode" complète et à jour pour élever un poisson zèbre Première Nourrir

Résumé

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Résumé

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un animal de laboratoire prééminente utilisé dans un nombre croissant de disciplines scientifiques, y compris mais non limité à la génétique du développement, de la toxicologie, de comportement, de l'aquaculture, de la biologie régénérative, et la modélisation de nombreux troubles ^humains 1 ^{- 5.} Bien que l'espèce est relativement facile à maintenir dans le laboratoire, il ya un certain nombre de défis de gestion associés à leur culture ^6. Le plus important d'entre eux est l'élevage des larves, en particulier lorsque le poisson commence d'abord à nourrir à la suite de la vessie de gaz de l'inflation ^7. Dans des conditions normales, contrôlées, cet événement se produit au développement ~ 5 jours après la fécondation (DPF), avec les 3 suivants - 5 jours de la croissance étant particulièrement critique ^7. La difficulté technique central lors de cette étape est de répondre adéquatement aux besoins nutritionnels de la première larves d'alimentation - articles d'alimentation doivent être de taille appropriée, Digestible, attrayant, et disponible sur une base presque continue, sans créer trop de déchets dans des bacs de culture. Historiquement cela a été réalisé généralement en fournissant de nombreuses petites quantités d'aliments pour les poissons dans des réservoirs, avec la routine ^8,9 d'échange de l'eau. Bien que ces méthodes sont à un certain degré de succès, ils sont inefficaces, nécessitent des apports élevés de main-d'œuvre, et ne retournent taux variables et limitées de croissance et la survie ^10.

Dans la nature, larves de poisson zèbre nourrir vraisemblablement sur ​​abondante petit zooplancton présents dans la colonne d'eau ^11. Pour cette raison, les protocoles de larviculture qui intègrent des aliments vivants tels que la paramécie, rotifères et Artemia sont généralement plus efficace ^7. En 2010, Best et co-auteurs ont démontré qu'il était possible de cultiver du poisson zèbre larvaire, l'eau saumâtre statique avec rotifères d'eau salée pour les 5 premiers jours de l'alimentation exogène ^12. Cette approche, qui exploiteres la productivité naturelle élevée des cultures de rotifères pour assurer assez proie, très nutritif sans polluer l'eau, les rendements des taux très élevés de croissance et la survie des larves avec l'apport du travail faible ^12,13. Au cours des dernières années, un nombre croissant de laboratoires dans le monde ont adopté des variantes de ce protocole, et beaucoup sont maintenant en culture de rotifères de façon continue de soutenir les systèmes de pépinières ^14.

Au cours des dernières années, des méthodes à la fois pour rotifères / polyculture poisson zèbre et la production de rotifères ont été affinée et améliorée pour devenir plus normalisé et facilement évolutive. Cet article fournit des instructions étape-par-étape pour 1) la production de rotifères continu et robuste et 2) l'établissement de la / système de polyculture poisson zèbre de rotifères utilisée pour soutenir la croissance robuste de poissons pour les 5 premiers jours de l'alimentation exogène.

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Protocole

1. Rotifer Culture

1. Composants de base d'un système de culture à l'aide d'un navire de 100 L Culture
   1. Rassemblez tous les composants nécessaires à l'installation de culture de rotifères. L'installation de culture de rotifères se compose d'un récipient de culture (CV) pour faire croître les rotifères; un navire similaire à maintenir rotifères avance matière (avance matière de navires de la culture, FCV); un pot à fond rond éclosion (Flux Reservoir, FR) pour le stockage du mélange d'alimentation des algues (AFM); une alimentation en air (AS) pour aérer le CV, CVF et le FR; une pompe péristaltique avec un temps de mesure (PMT) pour contrôler la livraison des aliments pour animaux d'algues dans le CV et FCV; et un filtre à particules fil (FPF) qui se trouve à l'intérieur du CV.
      NOTE: Une liste complète des fournitures et des composants est prévue dans la liste des matières.
2. Configuration
   1. Élever le CV et FCV sur un stand ou une table afin que les cultures peuvent être facilement récoltées via un montage dans une collection suite vidangeAINER (Figure 1). Utiliser des tubes d'alimentation en air flexible pour relier les AS à une longueur de tube rigide dans chaque récipient de culture. Assurez-vous que le tuyau est suffisamment long pour fournir de l'air au fond du CV ou de FCV.
   2. Utiliser une conduite d'air de petite capacité pour connecter les AS à une longueur de tube rigide qui se prolonge vers le bas de la FR qui contient l'AFM. Installez une vanne dans chaque ligne de l'air pour réguler le débit d'air. Branchez le FR à la PMT avec des tubes de distribution d'aliments, et exécuter le tube de la PMT dans un trou percé dans le côté de la CV / FCV, près du sommet. Figure 1.
3. Commencez
   1. Remplir le récipient de culture à 90% du volume disponible à l'eau d'osmose inverse (RO). Si RO ne sont pas disponibles, utiliser de l'eau municipale propre, sans chlore; Toutefois, une évaluation des risques en matière de biosécurité doit être effectuée pour s'assurer qu'aucun organismes potentiellement pathogènes sont présents dans l'eau de source. NOTE: Une telle analyse peut être effectuéepar tout laboratoire d'analyse de l'eau qualifié.
   2. Doser la culture de l'eau de la cuve avec le sel d'aquarium pour atteindre une salinité de 15 g / L. Régler le débit d'air dans le récipient de sorte qu'il maintient un "ébullition", puis ajouter lentement la quantité mesurée de sel dans le récipient de culture jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous par l'aération. Continuer aération de l'eau pendant> 1 heure pour s'assurer qu'il est bien oxygéné.
   3. Ajouter le mélange d'alimentation d'algues. Pour 3 L de propre, déchloré (0 ppm) de l'eau fraîche, ajouter 100 g de NaHCO ₃ et 100 g d'ammoniac neutralisant (hydroxymethylsulfonate de sodium). Ce dernier réactif offre l'avantage supplémentaire de neutraliser le chlore résiduel à partir de résidus de l'eau du robinet ou eau de Javel à la désinfection de l'équipement de culture. Il est essentiel de veiller à ce que ces composés sont complètement dissous. Puis ajouter 1 L de concentré d'algues (biomasse poids sec ~ 15%). Ajouter le mélange d'alimentation de la FR et conserver à 4 ° C.
   4. Ajouter une culture de départ de 5-10000000 Les rotifères Brachionus de au CV contenant 15 g / L d'eau de salinité aéré. Si les rotifères ont été réfrigérés pendant le transport ou le stockage, elles doivent être progressivement (pendant 30 min ou plus) acclimatés à la température de l'eau dans le récipient de culture (25 - 27 ° C).
   5. Allumez le PMT et commencer à pomper l'alimentation des algues dans la cuve de culture de rotifères. Utilisation de la fonction de la minuterie du PMT, fixer le taux de mélange d'alimentation des algues de livraison afin que ~ 1,6 ml de mélange d'alimentation des algues est livré par million de rotifères dans la culture, par jour. Distribuer les tétées en petites portions à intervalles réguliers au cours d'une période de 24 heures; la plus fréquente des tétées, le meilleur.
   6. Calibrer le débit de la pompe d'alimentation en tournant manuellement sur ​​le PMT pour une période déterminée (par exemple, 1 min) et de ramasser les algues qu'il pompe pendant cet intervalle dans un cylindre ou gobelet gradué. Par exemple, si les doses PMT 5 ml d'algues en 1 min, puis le débit de dose serait5 ml d'algues / min.
   7. Calculer le taux d'alimentation journalière requise en multipliant le nombre de rotifères présents, en millions, de 1,6 ml. Par exemple, une culture de rotifères avec une taille de population de 100 millions de rotifères exigerait ~ 160 ml d'aliment par jour (100 x 1,6 ml).
   8. Régler le PMT de doser l'exigence d'alimentation quotidienne totale à intervalles réguliers tout au long d'une période de 24 heures. Par exemple, la livraison d'une quantité d'alimentation quotidienne totale de 160 ml pourrait être livré dans les parties une fois toutes les 3 heures sur une période de 24 heures en utilisant un ensemble de PMT avec un débit de la pompe de dosage de 5 ml / min pendant 4 min, 8 fois par jour (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 tétées = 160 ml).
   9. Laisser la culture de se développer jusqu'à ce qu'il génère la population requise, généralement pour 48 à 72 h, avant la récolte. À 24 h post-démarrage, ajouter les filtres à particules soie à la cuve de la culture et de commencer l'entretien normal.
4. entretien
   REMARQUE: La culture fonctionne sur une base continue et nécessite routinmaintien de e qui devrait idéalement être effectuée à la même heure chaque jour, dans l'ordre suivant.
   1. Remplissez le FCV à 90% du volume disponible avec propre, sans chlore de l'eau fraîche, à la dose de 10 g / l de sels d'aquarium. Assurez-vous que l'eau est bien mélangée, et que tout le sel est complètement dissous. Régler le débit d'air dans le récipient de sorte qu'il maintient un "ébullition". Mesurer la salinité avec un réfractomètre et veiller à ce que la salinité est de 10 g / L. Il est essentiel pour atteindre cet objectif et de ne pas dépasser.
   2. Goûtez les rotifères dans le CV: Assurez-vous que la culture est bien mélangé, puis recueillir 3 échantillons d'un 2 - 3 ml chacun utilisant une pipette de transfert ou autopipettor, provenant de différentes parties de la culture. Combinez ces échantillons dans un tube ou un flacon de format pratique (par exemple, 10 ml).
   3. Transfer 1 - 2 ml de l'échantillon combiné sur une boîte de Pétri de façon à pouvoir être visualisé sous un microscope à dissection. Vérifier la qualité de la culture (natation comportement de larotifères, présence d'œufs détachés, protozoaires contamination).
   4. Immobiliser les rotifères de l'échantillon combiné restant par addition de 100 ul de solution à 50% d'iode Lugols à l'échantillon. En quelques secondes après l'addition des Lugols, observer les rotifères pour arrêter la natation. Maintenant, comptez facilement les rotifères.
      REMARQUE: éthanol, eau de Javel diluée, ou de vinaigre peuvent être utilisés à la place de Lugols. Vinaigre (2 gouttes / 10 ml) a l'avantage d'être non-dangereux, ne pas perdre de la force dans le stockage en tant que solutions de blanchiment et d'iode peut, et ne pas faire le contrat de rotifères, de sorte que la couronne de cils et le "pied" rester étendu et le animaux apparence plus naturelle.
   5. Veiller à ce que l'échantillon est bien mélangé (rotifères immobilisés vont se déposer rapidement), puis prendre rapidement un ml sous-échantillon ~ 2 dans une pipette en plastique et distribuer 1 ml dans une lame de comptage Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm carrés) (Figure 2 ). Utilisation d'un composé ou dissection microscope, compter les rotifères intactes et la tNuméro otal des oeufs attachés à ces rotifères (Figure 2). Comptent autant de la zone de diapositive que faut compter ~ 100 rotifères. Calculer le nombre de rotifères par ml, et d'enregistrer cela dans un tableur ou un journal de bord.
   6. Récolte ~ 30% du volume des rotifères dans le CV: Retirez l'alimentation en air et le filtre de la soie, ouvrir lentement la vanne de fond du CV et de permettre à l'eau de circuler dans un collecteur de plancton avec un tamis à mailles de 53 um. Recueillir l'eau sortant de la partie inférieure du collecteur après filtration dans un seau ou un drain. Utilisez un doux au flux modérée pour éviter d'endommager les rotifères. Ne laissez pas les rotifères à sécher sur l'écran.
   7. Pour des raisons de cohérence, il est conseillé d'établir le FCV avec un nombre standard de rotifères chaque jour. Par conséquent, basé sur le volume de la densité de rotifères de CV et la récolte connue, régler le volume FCV totale pour obtenir une densité finale conséquente (par ex., 1500 rotifères / ml). Ajouter le roti récoltésréfère à l'FCV: transférer délicatement les rotifères partir de l'écran de collection à l'aide d'une pissette remplie d'eau salée propre (10 - 15 g / L). Inversez l'écran au cours de la FCV et laver les rotifères dans le FCV avec un léger courant d'eau salée. Démarrez le PMT à livrer les aliments (~ 1,57 ml par million rotifères par jour) pour le FCV.
   8. Frotter tout l'intérieur du CV avec un chiffon propre, brosse douce en nylon ou tampon à récurer.
   9. Faire un nouveau mélange de 15 g / L d'eau en ajoutant la quantité appropriée de sel à une quantité mesurée d'eau RO propre dans un seau de 5 gallons pour remplacer le volume d'eau perdu à récolter. Ajouter le sel à l'eau dans le seau et mélanger vigoureusement jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous, puis ajouter au CV.
   10. L'utilisation d'un jet à haute pression dans un évier, rincer la soie filtre jusqu'à ce qu'il soit exempt de débris, puis le retourner au CV.
   11. Ajuster les taux d'algues délivrée à la CV en changeant la durée de chaque événement de dosage d'alimentation, selon le nombre quotidien de rotifères / ml.Utilisez les calculs prévus à l'étape 1.3.8, ci-dessus pour déterminer la quantité appropriée d'aliments à livrer.
   12. Environ 24 heures plus tard, répétez le processus. Lancer la récolte par les rotifères restant dans le FCV (qui ne sont pas nécessaires pour le jour précédent) de la même manière que celle décrite ci-dessus (étapes 1.4.2 - 1.4.10). Les concentrer dans 2 litres d'eau propre et fraîche déchlorée (5 g / L de sel). Ceux-ci peuvent être conservés à 4 ° C comme une alimentation de secours, ou utilisées pour nourrir les étapes ultérieures de poissons, au-delà de ce qui est décrit dans ce protocole.
       NOTE: Ce protocole permet jusqu'à 2 - 3 jours de maintenance réduite de culture (avec alimentation automatique normale), parce que les rotifères dans le CV peuvent tolérer omission des récoltes sans conséquences graves.

2. Polyculture

1. Installer
   1. Recueillir embryons de poisson zèbre à partir d'un événement de frai en versant embryons engendrés par une passoire à thé, puis rincer délicatement avec FIS stérilesh d'eau (ou de toute autre source non contaminée de la solution conditionnée de manière appropriée, par exemple, le milieu de l'embryon, E3, etc.) à partir d'une bouteille dans des boîtes de Pétri de lavage.
   2. Incuber les embryons à 25 - 28 ° C dans des boîtes de Pétri, à une densité de 40 - 50 embryons par boîte pendant 5 jours.
   3. Commencez la phase de polyculture au jour 5 post-fécondation, ou lorsque plus de 90% des larves écloses sont activement la natation dans la colonne d'eau.
2. Inoculation
   1. Ajouter 500 ml de culture de rotifères directement à partir du FCV à un 3.5 L pépinière réservoir; inclusion de l'eau de culture de rotifères fournit l'alimentation des algues qui maintient le contenu nutritionnel des rotifères pendant polyculture.
   2. Verser délicatement les larves d'une boîte de Pétri dans le réservoir de la pépinière. Veiller à ce qu'aucun larves restent dans le plat.
   3. Ajouter 500 ml d'eau propre de poisson, conditionné à partir d'un système de recirculation de l'eau ou d'une source dédiée à la cuve pour parvenir à un volume final de 1 L et une finale salinity de 5 g / L.
      NOTE: Cette salinité est critique parce que la survie des larves de poisson zèbre sera impacté négativement si la salinité est> 7 g / L et la survie des rotifères seront négativement impactés si la salinité <2 g / L.
3. Phase de polyculture
   NOTE: La phase de polyculture devrait durer jusqu'à quatre jours après l'inoculation (un total de 5 jours, correspondant à 5-9 jours après la fécondation).
   1. Observez le réservoir de polyculture au moins une fois par jour pendant cette période pour assurer que les rotifères et les poissons sont présents et en croissance. Veiller à ce que les rotifères sont visibles dans toute la colonne d'eau. Veiller à ce que les les fishs sont également visibles au sein de la colonne d'eau, nager parmi les rotifères.
   2. Commencez écoulement normal des eaux à travers le réservoir. Placer un écran ou déflecteur au-dessus de l'orifice de vidange afin d'assurer que les larves ne sont pas évacuée de la cuve.
      NOTE: A la fin de cette phase, les poissons seront assez grand pour consommer de plus grandes proies telles que Artemiaarticles d'alimentation nauplii ou transformés dans la gamme de taille de 75 à 125 um.
      NOTE: La dynamique des populations de rotifères dans un réservoir de polyculture représentant ont été mesurées par échantillonnage / rotifères compter du réservoir de la même manière que celle décrite dans les étapes 1.4.2 - 1.4.5. Ceci a été réalisé une fois par jour depuis le début de la phase de polyculture jusqu'à ce qu'elle soit terminée.

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Résultats

Le système de culture de rotifères continu décrit ici est dynamique, et il est normal pour les numéros de rotifères de fluctuer dans une faible mesure au fil du temps si il ya des variations dans les taux d'alimentation et de récolte quotidienne. La population de rotifères dans l'une des cultures actives dans les installations d'aquaculture à l'Hôpital pour enfants de Boston, maintenue de la manière décrite ci-dessus, a été surveillée pendant 30 jours

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Discussion

Mise en œuvre réussie de la méthode de polyculture de rotifères pour alimenter début poisson zèbre larvaire nécessite des protocoles efficaces pour deux tâches: la mise en place et la maintenance d'un système de culture de rotifères continue de nourrir les poissons, et la culture de la première alimentation larves de poisson zèbre avec rotifères dans le même réservoir.

L'installation d'un système de production d'eau salée de rotifères continue pour les labor...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning