Une méthode rapide et efficace pour la purification des cellules endoderme Généré à partir d'embryons humains Cellules souches

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour la purification de cellules embryonnaires humaines différenciées souches qui se sont engagés envers l'endoderme définitif pour l'amélioration des applications en aval et d'autres différenciations.

Résumé

Les capacités de différenciation des cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) permettent une application thérapeutique potentielle pour les thérapies de remplacement cellulaire. Terminalement types de cellules différenciées peuvent être utilisés pour le traitement de diverses maladies dégénératives. In vitro la différenciation de ces cellules vers les tissus du poumon, du foie et du pancréas nécessite dans un premier temps la production de cellules endodermiques définitives. Cette étape est limitante pour une différenciation plus poussée vers des types de cellules matures en phase terminale comme les cellules bêta productrices d'insuline, les hépatocytes ou d'autres types de cellules endoderme dérivés. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme expriment fortement une multitude de facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, membres de la famille GATA, et le récepteur de surface CXCR4. Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100%. Ici, nous décrivons un procédé pour la purification d'une population de cellules CXCR4 + après différenciationdans le DE en utilisant des microbilles magnétiques. Cette purification élimine en outre des cellules de lignées indésirables. Le procédé de purification douce est rapide et fiable et peut être utilisé pour améliorer les applications en aval et différenciations.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes telles que des cellules souches embryonnaires (CSE) ont la capacité de se différencier en pratiquement tout type de corps humain de la cellule. Ainsi, les protocoles de différenciation in vitro peuvent être utilisés pour produire de nombreux types cellulaires adultes , tels que des cardiomyocytes ^{1, 2,} hépatocytes cellules bêta ^{3, 4} épithéliale pulmonaire ou des cellules neuronales ^5. Cela rend CES un outil précieux pour le traitement potentiel de diverses maladies dégénératives ^3.

La différenciation in vitro des CES vers les tissus adultes du poumon, du foie et du pancréas nécessite une pseudo-gastrulation dans des cellules qui rappellent l'endoderme définitif (DE) ^6. Etant donné que la différenciation en aval vers les types de cellules somatiques ci - dessus est nettement moins efficace, une différenciation endoderme optimale est considérée comme limitant la vitesse ^7. Les cellules qui se sont engagés envers la lignée endoderme subissent chachangements racteristic dans leur profil d'expression génique. Gènes régulateurs maîtres pluripotent sont régulés à la baisse, tandis que l'expression d'autres facteurs de transcription tels que FOXA2, Sox17, HNF1B, les membres de la famille GATA et le récepteur de surface de CXCR4 est fortement régulée à la hausse ^{6, 8, 9.} CXCR4 est connu pour être transactivé par SMAD2 / 3, en aval de la signalisation Nodal / TGF-β et Sox17 due à des sites de liaison spécifiques dans la région promotrice ^10. Il est donc un marqueur très approprié utilisé dans un certain nombre de rapports ^{6, 8, 11-13.} Ces changements d'expression reflète un événement pseudo-gastrulation, dans lequel les CES acquièrent première caractéristiques d'une population de cellules de série comme primitive et engagent ensuite dans la couche de germe de endoderme ^6.

Cependant, les protocoles de différenciation sont rarement efficaces à 100% en quelques cellules peuvent résister au processus de différenciation ou de se différencier vers d' autres lignées ¹⁴ non souhaitées. Ces cellules peuvent Influe négativementnce autre différenciation. En outre, des cellules indifférenciées résiduelles abritent de grands risques pour les expériences de transplantation ultérieures et peuvent donner lieu à des tératomes ^15-17.

Pour supprimer ces cellules indésirables précoce sur le marqueur CXCR4 de surface peut être utilisé pour la purification de cellules qui se sont engagés vers le DE ^18. Ici, nous décrivons une méthode pour la sélection positive des cellules CXCR4 + provenant de Cultures de différenciation. Pour cela, le marqueur de surface de CXCR4 est liée par un anticorps qui se lie à son tour à des microbilles magnétiques. Contrairement aux conditions sévères au cours de tri FACS, les cellules telles que le document DE-magnétiquement marquées peuvent ensuite être facilement purifiées dans un format de paillasse en utilisant un procédé de purification délicat. Ce protocole fournit une méthode simple pour l'élimination des populations de cellules qui a résisté au processus de différenciation DE.

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Protocole

1. Différenciation des ESC humain vers le Endoderme Definitive

1. Cultiver des cellules souches embryonnaires humaines (CES) dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Enduire un nouveau 6 puits plaque de culture cellulaire avec 1 ml d'une matrice de membrane basale et incuber la culture-ware pendant au moins 30 min à température ambiante. Pour plus de détails s'il vous plaît tourner vers les instructions du fabricant respectif.
3. Vérifiez que les CES de l' homme de culture ont atteint 80% -90% de confluence sous le microscope à l' aide d' un faible grossissement (par exemple, 4X). Aspirer le milieu des cavités par aspiration du milieu avec une pipette Pasteur stérile en verre. Laver les cellules une fois avec une solution saline (PBS), une solution de phosphate tamponnée. Pour cela, ajoutez 2 ml de PBS à chaque puits doucement agiter la plaque et aspirer la solution pour éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires.
4. Ajouter 1 ml de réactif de solution de repiquage sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C, und 5% de CO ₂ jusqu'à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes.
   NOTE: Le temps d'incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la section des matériaux, la durée d'incubation est d'environ 7 min.
5. Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber les agrégats de cellules restantes dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l'aide d'une pipette de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 et ajouter le support au tube de centrifugation.
6. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml ES milieu de culture cellulaire contenant 10 pM de la Rho-kinase (Roche) inhibiteur.
7. Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre et épépiner 150.000 - 400.000 cellules par 6 puits ou dans une autre disposition de la plaque, en fonction de la lignée cellulaire ES utilisée. Utilisez culture du milieu contenant l' inhibiteur de ROCK 10 um pour éviter l' apoptose et la culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
8. Environ 24 heures après l'ensemencement Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 2 ml de primitive moyenne série d'induction.
   Remarque: Ce milieu contient des concentrations finales de 1% de glutamine, 0,2% de FCS, 5 uM CHIR-99021 et 50 ng / ml d' activine A à l' avance du milieu RPMI-1640. Généralement, utiliser 2 ml de milieu de culture dans des plaques 6 puits.
9. 48 heures après l'ensemencement, remplacer le milieu de l'endoderme milieu d'induction. Cultiver les cellules dans ce milieu pendant encore 48 heures avec changement de milieu par jour.
   Remarque: Ce milieu contient 1% de glutamine, 0,2% de FCS et 50 ng / ml d' activine A dans Advanced milieu RPMI-1640. Les cellules qui se sont engagés envers l'endoderme définitif expriment le marqueur de surface CXCR4. La coloration de CXCR4 peut être utilisé pour quantifier le nombre de cellules DE-commis.

2. Coloration de CXCR4 + endoderme définitif cellules d'analyse de cytométrie en flux

1. Pour la dernière 24 heures, mais au moins 1 heure avant la récolte des cellules, ajouter un inhibiteur de ROCK 10 uM au milieu de culture.
2. Enduire la culture cellulaire-ware qui sera utilisé pour re-semis avec une matrice de membrane basale, à savoir, des plaques à 12 puits pour qPCR analyse ou chambre diapositives pour immunofluorescence. Incuber les plaques ou lames pendant au moins 30 min à température ambiante.
3. Aspirer le milieu avec une pipette Pasteur en verre stérile, à partir des puits des cellules différenciées utilisées pour la coloration et / ou de tri.
4. Ajouter 1 ml de réactif de la solution de passages sans enzyme pour la dissociation douce des amas de cellules. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de _CO2 jusqu'à ce que les cellules présentent des signes évidents de perturbation en petites grappes.
   NOTE: Le temps d'incubation dépend du réactif utilisé. Pour la solution de passages sans enzyme mentionnée dans la materisection als, le temps d'incubation est d'environ 7 min.
5. Ajouter 1 ml de DMEM / F-12 et de perturber restant agrégats de cellules dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas à l'aide d'une pointe de 1 ml. Utiliser cette fonction pour rincer les cellules de la surface et de transférer les cellules dans un tube de centrifugation. Pour récupérer toutes les cellules, laver chaque puits avec 1 ml de DMEM / F-12 w / o FCS et ajouter le support au tube de centrifugation.
6. Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Les cellules provenant de trois puits d'une plaque à 6 puits devraient aboutir à 10-15 x 10 ⁶ cellules après trois jours de différenciation. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g.
   NOTE: Le nombre exact de cellules obtenues dépendra de la lignée cellulaire pluripotente utilisée pour la différenciation.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon PEB contenant un inhibiteur de ROCK 10 uM. Utiliser 100 pl de ce tampon pour 10 ⁷ cellules. Ajouter l'inhibiteur de ROCK 10 uM au jour de staining. Utilisez ce tampon pour toutes les applications en aval (appelés PEB tampon + RI).
   REMARQUE: tampon PEB contient 0,5% de BSA et 2 mM EDTA dans du PBS. Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de la mémoire tampon en conséquence.
8. Ajouter 10 ul d'un anticorps CXCR4 APC pour 10 ⁷ cellules dans 100 ul, ce qui représente à peu près une dilution de 1:10.
   NOTE: L'utilisation d'un anticorps APC lié est pas obligatoire. Au contraire, il peut être remplacé en fonction des microbilles utilisées. Si plusieurs cellules sont colorées à ajuster le volume d'anticorps en conséquence.
9. Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g.
10. Aspirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en verre et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul PASE par 10 ⁷ cellules et ajouter 20 ul de microbilles anti APC.
    REMARQUE: Si plusieurs cellules doivent être colorées, régler le volume de micro-billes en conséquence.
11. Mélanger doucement par retournement du tube avec les doigts et laisser incuber à 4 ° C dans un réfrigérateur pendant 15 min. Resuspendre les cellules avec PEB tampon de 1-2 + RI. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le tampon. Remettre en suspension dans 500 ul PEB tampon + RI.

3. Séparation magnétique de CXCR4 + Cellules

1. Placez une colonne magnétique de taille moyenne dans un champ magnétique selon les instructions du fabricant. Pré-rincer la colonne avec 500 ul PEB tampon + RI. Appliquer la suspension de cellule entière à la colonne. Recueillir l'écoulement à travers les cellules car tous vont se lier à la colonne. Assurez-vous de ne pas perturber les colonnes pour une récupération optimale des cellules CXCR4 +.
2. Laver la colonne trois fois avec 500 ul PEB tampon + RI. Recueillir le premier écoulement à travers et les combiner avec les cellules recueillies à l'étape 3.1. Retirer la colonne magnétique du champ magnétique et placez-le dans untube de collecte approprié. Ajouter 1 ml PEB tampon + RI sur la colonne. Pour éluer les cellules appuyez fermement sur le piston dans la colonne.
3. Facultatif: Collecter tous les flux à travers des échantillons séparément et utiliser 20 pi chacun pour analyser le nombre de CXCR4 + cellules en utilisant la cytométrie de flux. Leur nombre devrait diminuer à chaque étape de lavage.
   REMARQUE: Au moins 2 x 10 ⁴ viable, les cellules bloquées doivent être comptés pour obtenir des résultats fiables.
4. Répétez les étapes 3.1-3.3 avec le flux collecté à travers l'échantillon de l'étape 3.1 et le premier écoulement à travers l'échantillon de l'étape 3.2 en utilisant une nouvelle colonne. Ne pas réutiliser la colonne précédente. En utilisant l'air de piston est pressée dans la colonne, ce qui le bloque.
5. Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. En fonction de l'efficacité de la différenciation jusqu'à 6 x 10 ⁶ cellules peuvent être triées d' abord et l' autre 1 x 10 ⁶ cellules à l'aide d' une seconde colonne lors de l' utilisation de 10 ⁷ cellules de la procédure.
6. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant et avec un verre pipette Pasteur stérile, et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d'induction endoderme à l'étape 1.9 avec un inhibiteur supplémentaire de 10 uM de roche.
7. Compter les cellules au microscope en utilisant un hémocytomètre. Ensemencer les cellules à une densité appropriée, soit ~ 4 x 10 ⁵ cellules par puits d'une plaque de 12 puits (app. 3,6 cm ² de surface) ou ~ 1,5 x 10 ⁵ cellules par puits d'une chambre-slide 8 puits.

4. Facultatif: Analyse de Purifié Population Endoderme Definitive

1. Pour immunofluorescence fixer les cellules purifiées de l'étape 3.7 à peu près 24 heures après l'ensemencement avec 4% de paraformaldehyde et tache pendant endoderme définitif (DE) et / ou des protéines marqueurs de pluripotence.
   NOTE: Généralement utilisé DE marqueurs comprennent FOXA2 et Sox17, les marqueurs de pluripotence couramment utilisés comprennent OCT3 / 4, NANOG et SOX2 ^{6, 8.}
2. foanalyse r RT-qPCR, récolter les cellules purifiées directement ou 24 heures après l'ensemencement, l'extrait total d'ARN et d'inverser la transcription d'ADNc à partir des échantillons d'ARN totale extraites. En utilisant 10 ng d' ADNc en tant que matrice pour la réaction de RT-PCR quantitative (triplicats) pour analyser l'expression de DE et les gènes marqueurs de la pluripotence ^{6, 8.}
   NOTE: Les gènes marqueurs couramment utilisés sont mentionnés dans l' étape 4.1. les conditions de cycle sont 5 min à 95 ° C et 40 cycles de 15 s à 95 ° C et 1 min à 60 ° C, puis en faisant fondre l'analyse de la courbe.

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Résultats

lors de la différenciation CES subissent des changements drastiques dans le gène et l' expression de la protéine. La figure 1 illustre les gènes marqueurs typiques qui peuvent être utilisés pour vérifier une différenciation endoderme réussie. Les principales cibles pour une analyse d'expression génique sont CGC, FOXA2 et Sox17. Dans une analyse relative expression du gène particulier FOXA2 et S...

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Discussion

protocoles de différenciation utilisés actuellement aboutissent rarement à 100% de cellules différenciées. Pour des raisons qui restent à aborder certaines cellules résistent au processus de différenciation. En fonction de l'efficacité du protocole de différenciation utilisé et la propension de l'ESC aligner un certain nombre de cellules pluripotentes résiduelles sont couramment observée même après différenciation dans l'endoderme définitif. Ces cellules résiduelles peuvent affecter différ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hues8 human embryonic stem cell line	Harvard Department of stem cell & regenerative biology		Suitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell line	ES Cell International		Suitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	ESC culture medium
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, human	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	magnetic field
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	ROCK inhibitor
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activin A	Peprotech	120-14
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stemcell Technologies	7174	Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately.
MS Columns	Miltenyi Biotec	30-042-201
MACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Technologies
Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Life Technologies
Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca	Life Technologies
Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc	Life Technologies
Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct	Life Technologies
Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies
Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R&D Systems	AF1924