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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Résumé

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Introduction

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

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Protocole

1. L'électroporation de fibroblaste avec deux vecteurs d'expression EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito

  1. Cultiver les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris immortalisée sur 10 cm plaque de culture tissulaire en utilisant du DMEM (le milieu de Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C.
    1. À 80% de confluence des cellules, éliminer le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml d' une solution tampon de phosphate de 1x stérile (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 et 1 L distillation de H 2 O, pH: 7,4).
    2. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu complet DMEM, remettre les cellules et sortir 10 _6, l de la suspension cellulaire pour le comptage hémocytomètre.
      NOTE: Le hémocytomètre est conçu de telle sorte que le nombre de cellules dans une série de 16 cases d'angle est égal au nombre de cellules x 10 4 / ml.
  2. Semences 1 x 10 6 cellules sur 10 cm boîtes de culture tissulaire de 24 heures avant le processus d'électroporation.
  3. Jeter le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml de PBS stérile. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu DMEM complet et remise en suspension des cellules dans un tube de 15 ml.
  4. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 xg pendant 5 min en utilisant une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C). Jeter le surnageant par aspiration stérile et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 g pendant 5 min à 4 ° C.
  5. Jeter le surnageant par aspiration stérile, et ajouter 100 pi of solution mélange pour l'électroporation (82 pi de solution d'électroporation V + 18 pi de solution supplémentaire 1) au culot cellulaire et resuspendre doucement le culot par pipetage (Pour plus de détails reportez-vous au guide de l'utilisateur). Ajouter 2 pg de EYFP-Parkin (excitation / émission 514/527) et 1 ug Mito-pDsRed2 (excitation / émission 565/620) à la suspension cellulaire.
  6. Transférer la solution dans la cuvette stérile à l'aide d'un pasteur jetable (les deux outils sont fournis avec le kit) et l'électroporation en utilisant le programme de pré-série NIH / 3T3 U-030 (impulsion unique, tension 200 V, capacité 960 uF, temps d'impulsion de 20 millisecondes , nombre d'impulsions: 1).
  7. Immédiatement après l'électroporation, ajouter 500 pi de milieu préchauffé frais DMEM complet et ensemencer la cellule sur un 6 cm plaque de culture tissulaire live-imagerie de qualité et de les incuber dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.

2. Time-Lapse Video Microscopy

  1. Régler la température de la chambre du microscope à 37 ° C avant utilisation.
  2. À ce stade, préparer un support d'imagerie en direct spécifique de procéder au protocole expérimental. Préparer le milieu de l'imagerie en direct de la manière suivante; mélanger du DMEM exempt de phénol supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine. Préchauffer le moyen d'imagerie en temps réel à 37 ° C dans un bain d'eau.
  3. Jeter le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajouter 1 ml de milieu préchauffé imagerie en temps réel, en utilisant une pipette P1000 et incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C.
  4. Pendant la période d'incubation de la plaque, l' afflux 5% de CO 2 dans la chambre du microscope déjà à une température stable de 37 ° C.
  5. Placer la plaque avec les cellules électroporées dans la chambre du microscope évitant les mouvements ou oscillations majeures.
  6. Utilisation de l'interface du logiciel, réglez le microscope afin de détecter à la fois fluoreles signaux de Scence des protéines de fusion codées par les vecteurs cotransfectées, EYFP-Parkin (plage d'excitation 495-510 nm et la plage d'émission de 520-550 nm, vert) et le pDsRed2-Mito (excitation maximum de 558 nm et une émission maximale de 583 nm, rouge).
    1. Ouvrez le logiciel de microscopie vidéo time-lapse. Dans le menu supérieur sélectionnez le FITC pour EYFP-Parkin et rhodamine pour pDsRed2-Mito. Dans le menu supérieur sélectionnez le grossissement (20X).
  7. Utilisation de l'interface du logiciel, recherchez la cellule unique exprimant les deux vecteurs co-transfectées et enregistrer la position. Répétez cette étape jusqu'à un minimum de 10 cellules est recueilli pour chaque condition expérimentale (groupe expérimental).
    1. Sélectionnez le menu "Applications" et cliquez sur multi dimensionnelle Acquisition. Dans les fenêtres multi dimensionnelles Acquisition sélectionner les paramètres nécessaires, tels que le nombre d'acquisitions, l'intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur "Acquire"Pour démarrer le processus d'acquisition.
  8. Lancer l'acquisition basale des deux EYFP-Parkin et DsRed2-Mito signal fluorescent collecte des images toutes les 5 minutes pour un intervalle total de 15 min.
  9. Préparer moyen d'imagerie en temps réel préchauffée à une concentration de FCCP deux fois supérieure à la concentration finale de travail (0,1 à 10 uM, dépendant du type cellulaire).
  10. Interrompre le processus d'acquisition et ajouter doucement 1 ml de pré-chauffé support d'imagerie en temps réel avec FCCP dans la plaque à l'intérieur de la chambre du microscope à l'aide d'une pipette P1000.
  11. Redémarrer le processus d'acquisition, comme décrit précédemment, pendant une durée totale de 3 heures, à l'aide de la position enregistrée. Enregistrer toutes les images acquises afin de les analyser et de créer une vidéo du processus mitophagic lorsque l'acquisition est terminée.

3. Analyse

  1. Collecter toutes les images acquises en format ".tiff" sur un ordinateur personnel
  2. Ouvrez les images avec un chiffon doux graphiqueWare et définir l'intervalle de temps se sont produites à partir de la mitochondriale induite par dépolarisation au FCCP à la première image montrant le recrutement de Parkin dans la membrane mitochondriale (Les images sont acquises toutes les 5 minutes). Répéter cette analyse pour chaque cellule dans le groupe expérimental.
  3. Étiquette de la première cellule de la colonne sur une feuille de calcul avec le nom du groupe expérimental. Pour chaque groupe expérimental, mesurer les intervalles temporels pour Parkin recrutement d'un minimum de 10 cellules. Faire une moyenne des intervalles temporels calculés pour le recrutement Parkin et de définir l'écart-type pour chaque groupe expérimental (moyenne ± SD, N = 10).
    1. Organiser en colonnes les intervalles temporels calculés simples. Chaque colonne contient n = 10 mesures du groupe expérimental.
    2. Sélectionnez la fonction «moyenne» dans le menu Formula Builder. Sélectionner les données contenues dans la colonne. Sélectionnez la fonction "Déviation standard" dans le menu Formula Builder. Select les données contenues dans la colonne.
  4. En utilisant une approche statistique, comparer les groupes expérimentaux appliquant la statistique appropriée afin de définir une différence significative dans la dynamique de mitophagy entre les groupes expérimentaux. (Par exemple, deux groupes = test t de Student, trois ou plusieurs groupes = ANOVA plus un test post-hoc)

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Résultats

Ici, nous montrons comment la microscopie time-lapse vidéo est une technique puissante qui peut être utilisé pour suivre les événements moléculaires des protéines par fluorescence marqués dans une seule cellule. Les résultats représentatifs montrent aussi comment cette technique permet l'acquisition d'images de haute qualité. Lorsque les images du processus moléculaire, sont obtenus, nous avons la possibilité de les analyser de différentes manières. Ici, nous analy...

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Discussion

Vidéomicroscopie peut être définie comme la technique qui étend l'imagerie des cellules vivantes à partir d'une seule observation dans le temps pour l'observation de la dynamique cellulaire sur de longues périodes de temps. Cette méthodologie se distingue d'un confocal simple, ou la microscopie de cellules vivantes, car elle permet à l'observateur d'identifier en temps réel une seule protéine fluorescente étiquetée et suivre sa dynamique à l'intérieur d'une seule cellule viv...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Références

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