Ex vivo l'imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Résumé

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

Résumé

Métastases est une cause majeure de morbidité et de mortalité liée au cancer. Métastase est un processus en plusieurs étapes et en raison de sa complexité, les processus cellulaires et moléculaires exacts qui régissent la dissémination métastatique et la croissance sont toujours insaisissable. imagerie en temps réel permet de visualiser les interactions dynamiques et spatiales des cellules et leur microenvironnement. des métastases de tumeurs solides couramment dans les poumons. Cependant, la localisation anatomique des poumons constitue un défi pour l'imagerie intravitale. Ce protocole fournit une méthode relativement simple et rapide pour les ex vivo imagerie en temps réel des interactions dynamiques entre les cellules tumorales et leur stroma environnant dans les métastases pulmonaires. En utilisant cette méthode, la motilité des cellules cancéreuses ainsi que les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans leur microenvironnement peuvent être visualisés en temps réel pendant plusieurs heures. En utilisant des souris transgéniques reporter fluorescentes, une lignée de cellules fluorescentes, injectable marqué par fluorescencemolécules et / ou des anticorps, de multiples composants du microenvironnement du poumon peuvent être visualisées, par exemple les vaisseaux sanguins et des cellules immunitaires. À l'image des différents types de cellules, un disque rotatif de microscope confocal qui permet l'imagerie en continu à long terme avec, quatre couleurs rapide acquisition d'images a été utilisé. les films en accéléré compilées à partir d'images collectées sur plusieurs positions et plans focaux montrent les interactions entre métastatique en direct et les cellules immunitaires pendant au moins 4 heures. Cette technique peut être en outre utilisé pour tester la chimiothérapie ou la thérapie ciblée. En outre, cette méthode pourrait être adaptée à l'étude d'autres pathologies liées pulmonaires qui peuvent influer sur le microenvironnement du poumon.

Introduction

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality¹. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions².

Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time.

The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma³. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models^4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published^6–9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs⁶. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses¹⁰. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining⁷. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death⁸, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

Protocole

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'institutionnel soins locale Animal Use Commission (IACUC).

1. Génération de métastases pulmonaires pour imagerie ex vivo en direct (transgénique ou veine de la queue Injection)

NOTE: métastases pulmonaires peuvent être générés en utilisant des modèles de souris transgéniques, soit par voie intraveineuse (iv) l'injection des cellules cancéreuses.

1. Générer des métastases pulmonaires pour l'imagerie en traversant un modèle murin de tumeur par génie génétique dans une souris rapporteur transgénique, par exemple, traverser le modèle murin de cancer du sein, un antigène de souris par le virus de la tumeur mammaire terminale longue milieu répétées polyome T (MMTV-PyMT) ¹¹ dans ACTB-ECFP souris modèle ^12.
   NOTE: Le modèle ACTB-ECFP exprime renforcée protéine fluorescente cyan (ECFP) sous la β-acten promoteur de telle sorte que toutes les cellules fluorescentes dans le canal PCP bleu. Cependant, les cellules cancéreuses sont de loin le plus important et apparaissent comme une masse de cellules positives ECFP au microscope. Le modèle de souris MMTV-PyMT développe une maladie progressive, dans lequel la croissance de la tumeur mammaire est associée à la diffusion des cellules cancéreuses de la périphérie, en particulier dans les poumons. Chez les souris MMTV-PyMT sur le FVB / N fond, micrométastases peuvent être observées autour 10-11 semaines d'âge. En général, ces progrès à macrométastases à environ 14 semaines de ^{13 ans.}
   OU
2. Générer des métastases expérimentales en utilisant des cellules primaires ou des lignées cellulaires syngéniques. Utiliser dans les cellules tumorales in vitro primaire manipulé ou des lignées cellulaires (par ex., La transduction), suivie par ¹⁴ injection intraveineuse.
   1. En bref, dans ce protocole, injecter une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant (de +) lignée cellulaire MMTV-PyMT dans des souris fluorescentes rapporteurs (ACTB-ECFP) ou des souris de type sauvage. Alors,visualiser ces cellules appelées cellules VO-PyMT ¹⁵ en utilisant le canal de la GFP vert.
      NOTE: La ligne d'origine cellulaire VO-PyMT a été dérivée à la Vanderbilt Orthopédie à Nashville, TN. VO signifie Vanderbilt Orthopédie.
   2. Après l'injection de 10 ⁶ cellules (dans 200 ul), d'observer immédiatement et jusqu'à l'extravasation des cellules cancéreuses à quelques heures après l'injection; observer micrométastases entre 1-3 semaines après l'injection et de détecter macrométastases 3 semaines après l'injection ^15.
      NOTE: Moins de cellules peuvent être injectées à prolonger la durée de l'injection à la croissance métastatique.

2. L'étiquetage des composants d'intérêt dans le métastatique Microenvironnement (transgénique et / ou injectables)

NOTE: L'étiquetage peut être réalisé par les souris transgéniques et / ou de divers produits injectables. Assurez-vous d'utiliser différentes couleurs fluorescentes pour l'étiquetage des différents types de cellules.

1. Les composants Label du microenvironnement métastatique utilisant des souris transgéniques. Traverser le modèle de tumeur de souris a été mentionné précédemment (par ex., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) dans un modèle de souris transgénique dans lequel les cellules stromales d'intérêt sont marquées par une protéine fluorescente qui ne ECFP, par ex., C-fms-EGFP ^4,16.
   NOTE: En plus de la visualisation de cellules cancéreuses dans le canal PCP, ce qui permet la visualisation de cellules myéloïdes dans le canal ⁴ de la GFP.
   ET / OU
2. Étiqueter les différents composants de la micro-métastatique injectables en utilisant des souris transgéniques de rapporteur fluorescent (ou non fluorescent) souris de type sauvage.
   NOTE: Plusieurs composés peuvent être injectés pour marquer diverses composantes du micro-métastatique, par exemple, un anticorps Gr-1 AF647 conjugué est utilisé ici pour identifier les neutrophiles et les monocytes ^{13 et} des différents dextranes de poids moléculaire sont utilisésétiqueter les capillaires pulmonaires. Pour la préparation de ces produits injectables voir l'étape 4.

3. Préparation du matériel avant la dissection

1. 2% d'agarose
   1. Peser 0,2 g d'agarose et ajouter 10 ml 1 x PBS. Chauffer la solution pour dissoudre la gélose. Agarose se solidifie à température ambiante, afin de maintenir dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à l'utilisation de l'inflation.
2. CO ₂ et du contrôleur de température
   1. Vérifiez ddH _{2 O} dans la chambre d'humidification. Remplir en cas de besoin. Insérez la plaque de configuration dans le support de plaque de palier de température (chambre climatique). Allumez le contrôleur CO _{2 et régler} CO ₂ à 5%. Assurez-vous que le débit d'air est fixé à 0,4 Nl / min.
   2. Ouvrez l'air et de CO _{2 soupapes.} Mettez le régulateur de température. Assurez-vous que la température de la chambre climatique et le couvercle sont fixés à 37 ° C.
   3. Relâcher la pression de l'air _{sur le CO 2} mètres. Vérifiez CO ₂ de plus en plus, equilibration peut prendre jusqu'à 30 minutes.
3. disque filage microscope confocal
   NOTE: Détails du microscope set-up ont été décrits précédemment ^4,17.
   1. Allumer les lasers (le laser argon pour 488 nm excitation et à l'état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers). Allumer le microscope, la caméra, l'unité de commande de disque en rotation, l'AOTF, l'unité de commande de laser et le dispositif de commande de la caméra.
   2. Ouvrez le volet de microscope, tourner sur l'ordinateur exécutant le microscope et ouvrir le logiciel.
4. Préparation des outils et de la plate-forme de dissection.
   1. Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Nettoyer 2 paires de ciseaux chirurgicaux et des pinces avec de l'eau et du savon. Stériliser les instruments pendant au moins 30 secondes. Laissez les outils se rafraîchir. Utilisez un couvercle de polystyrène comme plate-forme de dissection. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant.

4. Préparation des injections

NOTE: En fonction de la demi-vie et la réponse préférée, injection marqué par fluorescence des anticorps et / ou des molécules fluorescentes, soit immédiatement avant le sacrifice animal ou un couple d'heures à quelques jours avant.

1. Pour neutrophiles l'image Gr1-positifs et les monocytes, préparer une seringue avec 7 ul d'actions AF647 conjugué Gr-1 anticorps (1 mg / ml) dans 100 pi de PBS stérile sous le capot. Placez une aiguille 27 G ½ sur la seringue.
2. À l'image des capillaires pulmonaires, préparer une deuxième et une troisième seringue avec 100 ul de 70 kD rhodamine-dextrane conjugué (4 mg / ml) ou de dextran 10 kD AF647-conjugué (4 mg / ml). Placez une aiguille 27 G ½ sur les seringues.
3. Injecter l'AF647 conjugué solution d'anticorps iv 5 heures avant l'excision des poumons.
4. Injecter une ou deux solutions de dextran iv immédiatement avant l'excision des poumons.

5. Préparation des poumons pour imagerie ex vivo en direct

NOTE: Essayez de travailler comme stérile et minutieuse que possible pour éviter des difficultés inutiles des cellules immunitaires dans les poumons.

1. Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) d'une dose mortelle d'un anesthésique permise par le protocole approuvé par le IACUC animale, par exemple., 1 ml d'Avertin à 2,5%. Attendez que la souris pour arrêter de respirer et être complètement non-réponse à des stimuli nocifs (patte arrière de pincement).
   NOTE: La dislocation cervicale et le dioxyde de carbone de l'euthanasie doit être évitée car elle peut affecter négativement la viabilité des cellules du poumon.
2. Immobiliser la souris sur une planche de dissection et stériliser la souris avec 70% d'éthanol.
3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux d'abord faire une incision transversale épigastrique à travers la peau, suivie par une incision similaire à travers le péritoine. Tenez la carte de dissection dans une position verticale et couper l'aorte descendante, de sorte que les piscines de sang dans l'abdomen et non pas dans la cavité thoracique.
4. Spincer une petite ouverture dans la membrane pour libérer le vide. Couper le long du 10e et 12e côte pour exciser le diaphragme et d'obtenir un accès visuel aux poumons.
5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau jusqu'à la trachée sur la cage thoracique, mais laisser la cage thoracique intacte. Séparer la peau de la cage thoracique. Exposer la trachée en retirant le tissu conjonctif environnant, en faisant attention à ne pas endommager la trachée elle-même (figure 1A).
6. Couper une petite ouverture d'environ 1 mm de diamètre dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux, au plus près du larynx que possible (figure 1B). Veillez à ne pas couper complètement à travers la trachée.
7. Prenez une aiguille 20 G et insérer délicatement l'aiguille 4-5 mm dans la trachée sans force contre (figure 1D). L'extrémité de l'aiguille doit être visible à travers la trachée (figure 1C). Utiliser une pince pour stabiliser l'aiguille dans la trachée. Alternativement, une suture peut être lié around la trachée pour maintenir l'aiguille en place.
   NOTE: En insérant trop profonde, la carène peut être traumatisé ou seulement un côté des poumons pourrait être gonflé.
8. Remplir une seringue avec 400 ul de 37 ° C 2% d'agarose à faible température de fusion (pris directement à partir d'un bain à température constante). Assurez-vous que le conseil de dissection est debout et instiller lentement l'agarose chaud à travers l'aiguille dans les poumons, utilisez ~ 400 pi pour gonfler les poumons.
   NOTE: Suivre les poumons de gonflage à l'intérieur de la cage thoracique. Ne pas trop gonfler le poumon comme il se rompt.
9. Une fois que les poumons sont gonflés, le remplissage ~ ⅔ de la cage thoracique, détacher la seringue et maintenir l'aiguille à l'intérieur de la trachée pour empêcher toute fuite d'agarose.
10. Verser environ 50 ml de 20 ° C PBS sur les poumons gonflés pour permettre la gélose dans les poumons de fixer et de se solidifier. Retirer lentement l'aiguille et fermer la trachée avec une pince pour éviter toute non-solidifié agarose de fuir.
11. Exposer les poumons en effectuant une sternotomie et exciser ensuite les poumons. Pour excision des poumons, tenir à la trachée tout en coupant à travers la trachée complètement. Tirez doucement sur ​​la trachée jusqu'à, couper le tissu conjonctif et de l'œsophage, tout en tirant les poumons de la cavité de la poitrine jusqu'à ce que les poumons est séparée de la souris (figure 1E).
12. Plonger les poumons à chaud RPMI-1640 pour laver le sang excessive et séparer délicatement les lobes en utilisant ciseaux et des pinces pour couper la tige principale des bronches des lobes à hile (figure 1F).
13. Placer les lobes avec la surface plate afin de maximiser la surface d'imagerie, dans un puits d'une plaque de formation d'image à 24 puits (figure 1G). Ajouter 100 ul de 37 ° C le milieu RPMI-1640 au-dessus des lobes. Placer plusieurs lames de microscope de couverture circulaire 15 mm au-dessus des lobes pour l'empêcher de flotter.
14. Verser chaud PBS dans les puits environnants pour empêcher les médias RPMI-1640 de évaporateurcolla-. Insérer la plaque à 24 puits dans la chambre climatique équilibrée et maintenir les lobes pulmonaires à 37 ° C avec de l'air et 5% de CO _2. Insérez la chambre climatique sur la scène du microscope confocal.
    NOTE: D'autres mélanges de gaz (par exemple, 5% O _2, 5% de CO ₂ en N ₂ d'examiner le comportement des cellules dans des conditions d'hypoxie / oxygène plus faible) pourrait également être envisagée.

Figure 1. Le protocole de préparation des poumons pour l'imagerie en temps réel. (A) l'exposition de la trachée après la préparation de la souris. (B) Petit snip faite dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux. (C) 20 aiguille G 5.4 mm insérée dans la trachée. (D) L'instillation de 400 ul de 2% à faible température de fusion d'agarose dans les poumons. (E) InflATED poumons séparés de la souris. (F) lobes séparés après inflation. (G) lobes placé dans un puits d'une plaque d'imagerie de 24 puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Acquisition et analyse d'images

Remarque: Les images peuvent être acquises avec une variété de disque rotatif microscopie confocale pris en charge par les différents logiciels. Dans ce protocole, soit μManager avec un disque filer microscope confocal sur-mesure ou Zen avec un disque filer microscope confocal disponible dans le commerce est utilisé pour l'acquisition de l'image, tout en Imaris est utilisé pour l'édition et l'analyse vidéo.

1. Acquérir des images à l'aide de μManager. Une étape détaillé par le protocole d'étape pour l'acquisition d'images en utilisant un logiciel μManager est décrit précédemment ^18.
   OU
2. acquérir des imagesen utilisant un logiciel d'analyse d'image tels que Zen (voir Figure S1).
   1. Cliquez sur l'onglet «Localiser», et choisissez objectif (10x ou 20x) dans le «Chemin de Lumière 'outil (Figure S1A, boîte rouge). Par la suite, cliquez sur "Eyes - DAPI 'à regarder le canal PCP à travers l'oculaire (Figure S1A, boîte bleue). Localiser l'échantillon manuellement à l'aide du microscope. Cliquez sur "Tout Off'after le tissu est centre du champ de vision.
   2. Cliquez sur l'onglet «Acquisition» pour régler tous les paramètres d'acquisition d'images.
   3. Dans l'outil «canaux», cliquez sur le bouton '+' (Figure S1B, boîte rouge). Un menu pop-up apparaît et la recherche pour le colorant (s) présent dans l'échantillon dans la «base de données Dye '(Figure S1B). Sélectionnez le colorant et cliquez sur "Ajouter".
      NOTE: Le programme sera mis tous les filtres à être optimisés. Un colorant peut être suppriméen le sélectionnant suivi en cliquant sur ​​le bouton de la corbeille (Figure S1B, boîte jaune).
   4. Dans le menu "Mode d'acquisition ', set' Binning» pour 5x5. Double-cliquez sur ECFP dans le menu des canaux pour le sélectionner. Abaisser la puissance du laser à 20% si l'échantillon ne sera pas blanchie lors de la configuration des paramètres d'acquisition d'images.
   5. Cochez la case 'Tuiles »dans la section« Experiment Manager' et l'outil de tuiles apparaît dans le groupe de l'outil «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1C). Cliquez sur le bouton 'Configuration avancée' pour voir l'image en direct de la caméra. Cliquez sur le bouton "Ajouter" dans la section "Positions de d'ajouter 4 à 6 positions à l'expérience. Pour supprimer une position, sélectionnez cette position et cliquez sur le bouton de la corbeille.
   6. Dans le groupe «Acquisition paramètre 'outil, ouvrir l'outil« Stratégie Focus », et sélectionnez« Absolute fixe position Z 'dans la liste déroulante.
   7. Cochez la case Z-Stack dans la section «Experiment Manager 'et l'outil Z-Stack apparaît dans le groupe de l'outil« multidimensionnelle Acquisition »(Figure S1D). Double-cliquez sur l'une des positions dans la section «positions» et appuyez sur 'Live'. Définir manuellement premier et définir dernière position du domaine de l'imagerie. Définir l'intervalle à 4 pm.
      NOTE: Le programme permettra de déterminer le nombre de tranches pour la gamme choisie et l'intervalle. Idéalement, 5-7 tranches sont pratiques pour permettre la visualisation suffisante et acquisition rapide des images.
   8. Cochez la case 'Time Series dans la section «Experiment Manager'. Set souhaité 'Durée' et les temps "intervalle" dans l'outil 'Time Series qui est apparu dans le groupe d'outils «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1E).
   9. Dans le '' acquisitionMode tion 'menu, mis' Binning »pour 2x2. Double-cliquez sur un fluorophore dans le menu des canaux pour le sélectionner et d'augmenter la puissance du laser à 100%. Appuyez sur 'Live' et régler le «temps d'exposition». Répétez cette opération pour chaque fluorophore.
   10. Cochez la case 'Activer Auto Save "boîte. Sélectionnez un dossier et tapez le nom du fichier. Toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier.
   11. Cliquez sur 'Début de l'expérience »dans la section« Experiment Manager' pour lancer l'acquisition d'images.
3. Après l'acquisition de l'image, compiler les données brutes dans les logiciels Imaris. Convertir des images en .ims fichiers et des ajustements peuvent être faits. Une étape détaillé par le protocole de l'étape de conversion des fichiers, faire des ajustements et des films d'épargne utilisant Imaris est décrit précédemment ^18.
4. Lors de l'enregistrement du film, réglez le "Frame Rate" à 5 images par seconde (fps).

Résultats

En utilisant la microscopie confocale à disque tournant, les différents systèmes de modèles de souris et injectables, le micro-métastatique peut être visualisée et suivi dans le temps. Utilisation d'un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP modèle de souris transgénique triple, différents composants cellulaires sont marquées par fluorescence (Figure 2A, Film 1). La structure typique du parenchyme pulmonaire peut être visualisé dans le canal PCP étan...

Discussion

Ce manuscrit décrit une méthode détaillée pour ex vivo l'imagerie en direct de métastases du poumon chez des souris modèles de métastases. Ce protocole d'imagerie fournit une visualisation directe des interactions tumeur-stroma cellulaire et dynamiques spatiales dans le microenvironnement du poumon. Il est une méthode relativement simple et rapide qui permet l'imagerie fiable de métastases pulmonaires pendant au moins 4 heures. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être util...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MMTV-PyMT/FVB mice	Jackson Laboratory	2374	Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
FVB mice	Jackson Laboratory	1800	Female mice
GFP+ VO-PyMT cells	UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D1818	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated	Invitrogen	D22914	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic			Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS	UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform			Will be used as dissection board
Fine scissors sharp	Fine Science Tools	14060-11
Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5135
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30min before use
Air	UCSF
Oxygen	UCSF
Carbon dioxide	UCSF
1 mL syringe without needle	BD	309659
27 G x 1/2 needle	BD	305109	for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel	BD	305178
Low-melting-temperature agarose	Lonza	50111	To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red	Life Technologies	11835-030
24 well Imaging plate	E&K scientific	EK-42892
Glass cover slides, 15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
Digital CO2 and temperature controller	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Climate chamber	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale lab, UCSF		Open-source software