Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Résumé

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Résumé

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Introduction

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

Protocole

Déclaration d'éthique de la recherche: Toutes les expériences impliquant des animaux détaillés ici sont soumis aux règles et règlements du Comité UNC de protection des animaux et aux normes du NIH pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation et Placage des dissociées neurones corticaux

1. Euthanasier femelles chronométrées-enceintes par inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale. Retirer cerveaux entiers des crânes de embryonnaires jour 15.5 (E15.5) souris et microdissect corticales de chaque hémisphère. Pour obtenir des instructions détaillées sur la microdissection de cortex de souris embryonnaires s'il vous plaît voir Viesselmann et al ^8.
2. Placez pas plus de 4 corticales dans 1 ml de milieu de dissection dans un stérile de 1,6 ml microtube. Ajouter 120 pi de 10x trypsine et inverser le tube 3 - 5 fois pour mélanger.
3. En utilisant un hémocytomètre, compter les cellules pour ensemencer des boîtes de culture cellulaire. Note: 1 hémisphère cortical fournit approximately trois millions de cellules.
   1. Pour le dosage SNARE de biochimie complexe SDS-résistant, plaque de six millions de cellules par boîte de 35 mm et d'utiliser deux plats par condition. Note: Ceci est simplifiée en utilisant des plaques de 6 puits lorsque l'on compare plusieurs conditions.
   2. Pour les essais de ramification, les neurones de la plaque sur l'acide nitrique lavés lamelles circulaires à une densité de 250.000 cellules par boîte de 35 mm, par DIC imagerie axone ramification plaque à une densité de 150.000. Ces densités d'éviter la surpopulation et de simplifier l'analyse.
4. Pour vivre la microscopie TIRF cellulaire, resuspendre deux millions de neurones par transfection dans nucléofection solution à la température ambiante.
   1. Ajouter 100 pi de suspension cellulaire à microtube contenant 10 pg de VAMP2-pHlourin plasmide d'expression et d' électroporation avec un Nucleofector selon le protocole du fabricant ^9.
   2. Après transfections ajouter immédiatement 500 pi de trypsine trempe médias, retirer la suspension à partir de cellules de la cuvette et la plaque à une densité de 400.000 cellules par 35 mm verre PDL enduit plat fond.
5. Plate tous les neurones corticaux dans 2 ml de milieu sans sérum.

2. SNARE Formation complexe Assay

Remarque: les complexes SNARE SDS-résistants ont été traitées et analysées comme décrit à l' origine ¹⁰ avec les modifications détaillées ci - dessous. Pour les anticorps alternatives validées à celles utilisées ici, voir la section des matériaux.

1. Stimulez neurones corticaux E15.5 2 jours in vitro (DIV) avec 250 ml de nétrine-1 ou simulacre de contrôle ng / pendant 1 heure avant la lyse.
2. Avant le traitement des échantillons, centrifugeuse refroidir à 4 ° C, et régler la température du bain d'eau à 37 ° C, et le bloc thermique à 100 ° C.
3. Retirer les plats de cellules de l'incubateur et de placer sur la glace.
   1. Aspirer le milieu de cellules, remplacer par ~ 2 ml de glace Phosphate froide solution saline tamponnée (PBS) doucement 2 fois pour 1 - 2 min par lavage.
   2. Pour cet essai, utiliser 2 puits par condition.
   3. Aspirer PBS à partir du premier puits d'une condition et le remplacer par 250 ul de tampon d'homogénéisation. Laisser sur la glace pendant 5 min, puis en utilisant un poussoir de cellule, homogénéiser les cellules sur la glace.
   4. Aspirer le PBS à partir du prochain puits de la même condition et ajouter le mélange homogénéisé récemment au puits. Cela permettra d'accroître les concentrations de protéines. Répétez l'opération pour toutes les conditions.
   5. Une fois terminée, la pipette à une solution pré-refroidie microtube de 1,6 ml homogénéisée sur de la glace et ajouter 20% de Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 1% de Triton X-100. Triturer mélanger 10 fois avec 1000 ul pipette tout en minimisant les bulles.
4. Incuber les tubes sur la glace pendant 2 min pour solubiliser des protéines. Après incubation, on centrifuge pendant 10 min à 6010 rcf à 4 ° C pour sédimenter la matière non solubilisée. Déplacer surnageant lysat en nouveau tube de 1,6 ml refroidi sur de la glace.
5. Effectuer une analyse de la concentration en protéines de Bradford en utilisant dosage ¹¹ et on dilue les échantillons à un final Concentration en protéines de 3 à 5 mg / ml avec du tampon d'homogénéisation restant supplémenté avec 1% de Triton X-100 et 5 x tampon d'échantillon additionné de B Mercaptethanol (BME).
6. Divisez chaque échantillon expérimental uniformément dans 2 tubes. Incuber un échantillon à 37 ° C pendant 30 min (complexes SNARE), et l'autre à 100 ° C pendant 30 min (monomères SNARE). Inversez tubes par intermittence pour maintenir les échantillons en solution.
7. Congeler les échantillons à -20 ° C jusqu'au moment de séparer par SDS-PAGE. Avant d'exécuter les échantillons par électrophorèse en utilisant des techniques standard, rebouillage échantillons préalablement bouillis pendant 5 min à 100 ° C, mais décongeler 37 ° C des échantillons à température ambiante.
8. doublons Exécuter des échantillons (30 - 40 pg de protéine par échantillon) à la fois sur 8% et un gel à 15%; 8% assure une séparation idéale du complexe, tandis que les 15% est utilisé pour quantifier la protéine SNARE monomères (SNAP-25 ~ 25 kDa, 18 kDa VAMP2 ~, syntaxine-1 ~ 35 kDa). Maintenir la source d'alimentation à 70 V jusqu'à ce que la ligne de colorant est à travers le stacroi du gel et une augmentation de la tension 90V. Exécutez gels jusqu'à ce que le colorant coule.
9. Pour préserver les monomères, le transfert des protéines à 0,2 um membrane de nitrocellulose sur de la glace en utilisant un tampon de transfert à froid avec 20% de methanol (MeOH) a été ajouté, à 70 V pendant 45 min.
10. membrane sèche dans un plat couvert pendant 2 heures à O / N à TA (O / N fournit les meilleurs résultats).
11. Bloc SNARE membranes complexes de 10% de sérumalbumine bovine (BSA) pendant 1 heure à température ambiante.
12. Préparer des anticorps primaires (reconnaissant des composants spécifiques de complexes SNARE) à une dilution de 1: 1000 et sonde O / N à 4 ° C sur un agitateur rotatif.
    1. Buvardages rinçage dans du Tris Buffered Saline plus 0,1% de Tween-20 (TBS-T), 3 fois pendant 5 min à chaque fois.
13. Préparer des solutions d'anticorps secondaires fluorescents à une dilution de 1: 20.000 à 1% de BSA dans du TBS-T et de la sonde pendant 1 heure, recouvert à la température ambiante. Étape 2.12.1 Répétez après 1 h.
14. blots d'image sur une machine de balayage fluorescent équipées suite logicielle et de quantifier à la fois la coopération de la protéine SNAREMPlex (bandes immunoréactives ci-dessus) 40kDa et des bandes de monomères (bandes immunoréactives à 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa pour SNAP-25, VAMP2 et syntaxine-1, respectivement) en utilisant les instructions du fabricant pour le dessin ROIs rectangulaire.

3. Imaging exocytose événements via FRBR Microscopie

Remarque: Ce protocole nécessite un équipement de microscopie spécialisée , y compris une chambre environnementale pour maintenir la température, l' humidité et le CO _2, un microscope TIRF inversé équipé d'un éclairage à épifluorescence, a / grande ouverture numérique (NA) L' objectif de la FRBR à fort grossissement, un stade XYZ automatisé, et un sensible charge Coupled Device (CCD) détecteur. Ce protocole utilise un microscope inversé entièrement automatisé équipé d'un objectif d'un solide état 491 nm laser 100x 1.49NA FRBR et une Multipliant CCD électronique (EM-CCD). Tout le matériel est contrôlé par imagerie et contrôle laser logiciel. Avant le début de la puissance du protocole d'imagerie sur la environnement chambre, étage, lampe, ordinateur, et la caméra.

1. Sélectionnez objectif dans le logiciel d'imagerie. Une fois que l'objectif est en place, fixer le chauffe objectif autour du col.
2. Assurez-vous que l'objectif est complètement abaissé avant de fixer l'incubateur d'étape dans la fente de la scène. Versez de l'eau distillée dans les entrées de l'incubateur de scène uniforme pour empêcher le déversement.
3. Allumez le système d'incubation. Ouvrez la valve du réservoir de CO ₂ et confirmer la pression est approprié pour le système selon les instructions du fabricant. Laisser la chambre un peu de temps pour atteindre 5% de CO ₂ et 37 ° C. Avant d'ajouter le plat d'imagerie, placez un plat vide dans l'incubateur pour éviter la condensation de l'eau sur l'objectif.
4. Puissance de la source laser.
5. incubateur de scène ouverte et ajouter l'huile d'immersion à la lentille. Placer l'échantillon dans l'incubateur et de stabiliser les bras de stabilité ou un poids plat. Élever l'objectif jusqu'à ce que l'huile est en contact avec le fond de l'échantillon. Switch à l'illumination lumière transmise et trouver le plan focal neuronal à travers les oculaires.
6. Démarrez le logiciel laser et se connecter au logiciel de contrôle de laser. Réglez l'éclairage à widefield et sélectionnez l'objectif utilisé (100X 1,49 NA FRBR est recommandé). indice de réfraction Ensemble de l'échantillon (cellules ~ 1,38). Ajuster l'intensité du laser en décochant "TTL" pour le laser 491 nm. Réglez le curseur à 100 puis le ramener à une valeur comprise entre 20 - 40%. Revérifier "TTL".
7. Focus sur l'échantillon à nouveau dans l'illumination de lumière transmise. Accédez au logiciel d'imagerie et sélectionnez 491 nm illumination laser et de l'obturateur ouvert. Le réglage fin du point focal du laser sur le plafond et centrer le point au centre du diaphragme de champ clos avec le condenseur retiré. Placez le condenseur à l'envers sur le banc optique, afin de ne pas l'objectif de zéro.
8. Remplacer le condenseur et aller au logiciel FRBR et régler la profondeur de pénétration (PD) à 110 nm. Passer de l'éclairage widefield à FRBR illummode ination pour l'imagerie.
9. Trouver VAMP2-pHluorin des cellules exprimant à travers les oculaires en utilisant épifluorescence Widefield avec source de lumière épifluorescence.
   1. Régler les paramètres d'imagerie (temps d'exposition, le gain et la puissance du laser) pour maximiser le rapport signal sur bruit et une plage dynamique en utilisant le temps d'exposition minimale et l'intensité du laser pour réduire photoblanchiment et de phototoxicité (par exemple: exposition entre 50 - 100 msec, avec un 15-30 acquérir à 30% de la puissance laser maximale).
   2. Régler autofocus continu par cellule. Acquérir une image timelapse mis à l'acquisition se produisant toutes les 0,5 secondes pendant 5 min. Pour la condition nétrine-1 stimulée, ajouter 500 nétrine-1 ng / ml à plat de cellules dans une hotte à flux laminaire et retourner le plat à l'incubateur pendant 1 heure avant l'imagerie.
10. Pour quantifier la fréquence des événements exocytose normalisés par zone cellulaire et le temps, des piles d'images ouvertes dans ImageJ en faisant glisser le fichier dans la fenêtre ou Fichier> Ouvrir> Nom du fichier (Figure0; 2A Encadré 1).
    1. Pour éliminer les signaux fluorescents stables qui ne représentent pas les événements de fusion vésiculaire, créer une z projection moyenne de l'ensemble de la pile en utilisant l'image> Stack> Z-Project> Type de projection: Intensité moyenne. Soustraire cette image moyenne de chaque image dans le timelapse utilisant Process> Calculatrice d'images> Image1: votre opération de la pile: Soustraire Image2 nouvellement créé z projection moyenne. Cela met l' accent sur ​​les événements exocytose (Figure 2A Encart 2 - 3).
    2. Comptez les événements de fusion exocytose par oeil. Exocytose événements sont définis comme étant l'apparition d'un signal de fluorescence limitée par la diffraction, qui diffuse rapidement VAMP2-pHluorin diffuse au sein de la membrane plasmique (figure 2A Encart 6).
    3. Utilisez la commande de seuil pour mettre en évidence la première image en utilisant Image> Réglages> Seuil> curseur de réglage jusqu'à ce que la cellule entière est seuil mis en évidence (figure 2A Inset 7-8).
    4. Sous AnaLyze, choisissez SetMeasurements et de la zone et de l'étiquette d'affichage vérifier. Sélectionnez la zone cellulaire seuillée en utilisant l'outil baguette de traçage et appuyez sur m »pour mesurer (figure 2A Inset 7-8).
    5. Transfert à la fois les événements de fusion exocytose comptent, les mesures de surface cellulaire, et le temps d'imagerie écoulé à une feuille de calcul pour calculer le nombre d'exocytose événements / mm ² / heure (Figure 2A Encart 9).

4. Contraste interférentiel différentiel (DIC) Timelapse Microscopie de Axon Branching

Remarque: Un protocole complet et la démonstration d'une approche générale à l' imagerie DIC est disponible ^12. Bien que ce protocole utilise DIC, d'autres méthodes de microscopie lumière transmise peuvent être utilisés pour les mêmes fins (par exemple: contraste de phase).

1. A 2 DIV, placez fond de verre plat d'imagerie contenant les neurones non transfectées dans la chambre de l'environnement pré-chauffé pour maintenir un env humideironnement avec 5% de CO ₂ et 37 ° C. Utiliser un microscope équipé d'un 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC lentille d'objectif et de haute condenseur NA pour une meilleure qualité et résolution.
2. Réglez le plan focal pour trouver les neurones à travers les oculaires en utilisant l'éclairage lumière transmise.
3. Utilisation de la fonction d'acquisition de la zone à plusieurs sur un logiciel d'imagerie, trouver et enregistrer les emplacements XYZ d'au moins 6 cellules. Positionner la scène afin que les neurones d'intérêt en forme dans le champ de vision pour obtenir les meilleurs résultats.
   1. Stimulez avec 250 ng / ml de nétrine-1 et appuyez sur «démarrer l'acquisition de la zone multi». acquérir séquentiellement des images à chaque position toutes les 20 secondes pendant 24 heures, une pause acquisition et recentrage nécessaire.
4. Revoir les images dans le logiciel d'imagerie utilisant les applications> Revoir Dimensional données> nom de fichier ouvert Multi. Identifier les branches axonales stables (20 um de long) qui se forment au cours de la session d'imagerie. Utilisez l'outil de tirage de ligne pour mesurer un branc de stableaxonh à partir de la base à l'axone à la pointe pour assurer la qualification de longueur de 20 um est remplie.
   1. Dans une feuille de calcul, enregistrer le numéro de trame après stimulation nétrine lorsque protubérances membranaires lancer dans des zones où les branches forment plus tard, ainsi que le numéro de trame après stimulation nétrine lorsque les branches naissantes atteignent 20 mm de longueur.
   2. Multiplier le nombre de trames entre la saillie et la formation de la branche de 20 secondes pour calculer le temps de formation par branche.

5. Manipulations à toxines et immunofluorescence cellulaire fixe

1. À 2 DIV traiter les neurones dans des conditions expérimentales avec 250 ng / ml de nétrine-1 et / ou 10 nM de toxine botulinique A (BoNTA) qui clive la SNAP25 protéine SNARE et inhibe efficacement SNARE exocytose à médiation par ^13, ainsi que 250 ng / ml de nétrine 1. Laissez un ensemble de neurones non traités comme condition de contrôle.
   ATTENTION: BoNTA nécessite l'utilisation d'une protection oculaire et des voies respiratoires lors de la préparation et l'utilisation desolutions. Maintenir tous les matériaux contaminés en tant que matières infectieuses et autoclave le plus tôt possible.
2. A 3 DIV (post - traitement 24 h) les médias aspirés, et remplacer immédiatement avec au moins 1 ml de MEHP fix (voir le tableau 1 pour plus de détails) chauffée à 37 ° C. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à la température ambiante.
3. Rincer 3x avec PBS (pour la future joint utilisation avec parafilm et conserver à 4 ° C).
4. La place des lamelles dans sombre chambre de coloration, humidifié et perméabiliser les membranes cellulaires pendant 10 min dans fraîchement diluée de 0,2% TritonX-100 dans du PBS (fabriqué à partir de 10% de Triton-100 stock).
5. Enlever la solution de perméabilisation et rincer avec 50 pi de 1x avec PBS. Bloc pendant 30 min à environ 50 pi de 10% de sérumalbumine bovine dans du PBS (BSA-PBS) ou 10% de sérum d'âne bouillies dans du PBS à température ambiante.
6. Rincer avec PBS 1x nouveau. Incuber lamelles dans 50 ul d'anticorps primaire (1: 1000 ßlll tubuline, pour confirmer l'identité neuronale) dans 1% de BSA-PBS pendant 1 heure à température ambiante, dans le noir.
7. Effectuer 3x 5 min lavages dans du PBS. Incuber lamelles dans 50 pi d'anticorps secondaire spectralement distincts pour tubuline (1: 400), et la phalloïdine fluorescente (varie par excitation: 488 phalloïdine à 1: 400, 647 phalloïdine à 1: 100) dans 1% de BSA-PBS pendant 1 heure .
8. Laver 3x 5 min dans du PBS 1x et monter des lamelles sur des lames dans les milieux de montage.
9. milieu de montage sous vide en excès des bords de la lamelle et le joint avec du vernis à ongles transparent.
10. Collecter les images épifluorescence sur un grand champ microscope inversé avec un objectif 40X 1.4NA, capacités épifluorescence et EM-CCD.
    1. analyser manuellement ramification en utilisant ImageJ. Ouvrez piles d'images dans ImageJ en faisant glisser le fichier dans la fenêtre ou Fichier> Ouvrir> Nom du fichier (figure 4A encadré 1).
    2. Utilisation de la ligne> ligne segmenté, trace l'axone, définie comme étant la plus longue neurites étendant du soma (figure 4A encadré 2 - 3).
    3. Utilisation Analyse> Outils> Gestionnaire de retour sur investissement, sauver l'axone traçage comme une région d'intérêt. Trace et enregistrer chaque branche de l'axone, définie comme une neurite ≥20 mm de longueur. Inclure les branches seulement primaires (excroissances poussent directement à partir de l'axone) dans l'analyse (figure 4A encadré 3 - 4).
    4. Appuyez sur 'm' pour mesurer les régions enregistrées d'intérêt, et le transfert de longueurs en pixels à une feuille de calcul pour calculer la longueur en um.
    5. Diviser le nombre de branches axonales ≥20 um de longueur, par la longueur de l'axone en um divisé par 100 pour obtenir le nombre de branches axonales par longueur de 100 um.

Résultats

Utilisant des techniques biochimiques in vitro de doser la quantité de complexes SNARE SDS-résistants dans une population de neurones. La figure 1 montre le western blot après l' achèvement résultant du SNARE dosage complexe SDS résistant sondé pour SNAP-25, syntaxin1A et VAMP2.

Microscopie TIRF à la membrane des cellules basales fournit des images haute résolution des différents événe...

Discussion

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011