Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Résumé

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

L' évolution dirigée dans Saccharomyces cerevisiae offre de nombreux avantages attrayants lors de la conception d' enzymes pour des applications biotechnologiques, un processus qui implique la construction, le clonage et l' expression de bibliothèques de mutants, couplé à haute fréquence recombinaison homologue de l' ADN in vivo. Ici, nous présentons un protocole pour créer et bibliothèques de mutants d'écran dans la levure basé sur l'exemple d'un champignon aryl-alcool oxydase (AAO) pour renforcer son activité totale. Deux segments de protéines ont été soumis à l' évolution concentrée dirigée par mutagenèse aléatoire et in vivo la recombinaison de l' ADN. Surplombs de ~ 50 pb flanquant chaque segment a permis au réassemblage correcte du gène AAO-fusion dans un vecteur linéarisé donnant naissance à un plasmide à réplication autonome complète. Bibliothèques de mutants fonctionnels enrichis avec des variantes AAO ont été criblés dans S. Les surnageants cerevisiae avec un dosage à haut débit sensible à la base de la réaction de Fenton. Le processus général deconstruction d'une banque de S. cerevisiae décrit ici peut être facilement appliquée à évoluer beaucoup d' autres gènes eucaryotes, en évitant des réactions PCR supplémentaires, in vitro recombinaison de l' ADN et ligature étapes.

Introduction

Évolution moléculaire dirigée est une méthode robuste, rapide et fiable pour concevoir des enzymes ^{1, 2.} Par séries itératives de mutation aléatoire, recombinaison et de criblage, des versions améliorées des enzymes peuvent être générés qui agissent sur ​​de nouveaux substrats, dans de nouvelles réactions, dans la non-naturelle environnements, ou même pour aider la cellule à atteindre de nouveaux objectifs métaboliques ^3-5. Parmi les hôtes utilisés dans l' évolution dirigée, la levure Saccharomyces cerevisiae du brasseur propose un répertoire de solutions pour l'expression fonctionnelle des protéines eucaryotes complexes qui ne sont pas autrement disponibles dans homologues procaryotes ^6,7.

Utilisé de façon exhaustive dans les études de biologie cellulaire, ce petit modèle eucaryote présente de nombreux avantages en termes de modifications post-traductionnelles, la facilité de manipulation et de transformation d' efficacité, sont tous les traits qui importants à l' ingénieur enzymes par évolution dirigée ^8. En outre, la haute fréquencede recombinaison homologue de l' ADN dans S. cerevisiae couplé à son appareil de relecture efficace ouvre un large éventail de possibilités de création de la bibliothèque et de l' assemblage de gènes in vivo, de favoriser l'évolution des différents systèmes d' enzymes uniques aux voies artificielles complexes ^9-12. Notre laboratoire a passé la dernière décennie la conception d' outils et de stratégies pour l'évolution moléculaire des différentes ligninases dans la levure (des oxydoréductases impliquées dans la dégradation de la lignine lors de la pourriture du bois naturel) ^13-14. Dans cette communication, nous présentons un protocole détaillé pour préparer et bibliothèques de mutants d'écran dans S. cerevisiae pour un modèle flavooxidase, -aryl-alcool oxydase (AAO ¹⁵⁾ -, qui peut être facilement traduits à de nombreuses autres enzymes. Le protocole implique une méthode d'évolution ciblée dirigée (MORPHING: Mutagène organisée par recombinaison homologue Process in vivo Regroupement) assistée par l'appareil de cellule de levure ^16,da test de criblage très sensible basé sur la réaction de Fenton, afin de détecter l' activité AAO sécrété dans le bouillon de culture ^17.

Protocole

1. Mutant Library Construction

1. Choisissez les régions à soumettre à MORPHING avec l'aide d'algorithmes de calcul sur la base des modèles disponibles sur la structure cristalline ou homologie ^18.
   1. Ici, cibler deux régions de AAO de Pleurote du panicaut pour la mutagenèse aléatoire et la recombinaison (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), tout en amplifiant le reste du gène (844 pb) par PCR haute fidélité (Figure 1).
      Note: Plusieurs segments peuvent être étudiés par MORPHING de manière indépendante ou combinée ^16.
2. Amplifier les zones ciblées par PCR mutagène. Créer des zones de chevauchement entre des segments (~ 50 pb chacun) en superposant des réactions PCR des régions définies.
   1. Préparer une PCR mutagene des segments ciblés dans un volume final de 50 ul contenant une matrice d'ADN (0,92 ng / ul), 90 nM de détection de l'oligo (pour le segment de RMLN IM et AAO-BP pour le segment M-II), 90 nM d'unntisense amorce (AAO-92C pour le segment IM et RMLC pour le segment M-II), mM dNTP 0,3 (0,075 mM chacun), 3% (v / v) de diméthylsulfoxyde (DMSO), 1,5 mM de _MgCl2, 0,05 mM de _MnCl2 et 0,05 U / pl de Taq ADN polymerase. Amorces séquences sont décrites en détail dans la figure 1.
   2. Utilisez le programme de PCR suivant: 95 ° C pendant 2 min (1 cycle); 95 ° C pendant 45 s, 50 ° C pendant 45 s, 74 ° C pendant 45 s (28 cycles); et 74 ° C pendant 10 min (1 cycle).
3. Amplifier les régions non-mutagène avec ultra-haute polymérase fidélité et inclure les zones correspondantes se chevauchent les segments mutagènes et / ou des surplombs de vecteur linéarisé.
   1. Préparer des mélanges réactionnels dans un volume final de 50 ul contenant: modèle d'ADN (0,2 ng / pl), 250 nM d'oligonucleotide sens HFF, 250 nM d'oligo antisens HFR, 0,8 mM de dNTP (0,2 mM chacun), 3% (v / v) de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et 0,02 U / pl d' ADN polymerase iProof. Amorces séquences sont détaillées dans Figure 1.
   2. Utilisez le programme de PCR suivant: 98 ° C pendant 30 secondes (1 cycle); 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 25 s, 72 ° C pendant 45 s (28 cycles); et 72 ° C pendant 10 min (1 cycle).
      Remarque: Avec les conditions décrites en 1.2 et 1.3 chevauchements de 43 pb (région plasmidique-M1); 46 pb (M1 region-HF); 47 pb (HF région M2 région) et 61 pb (M2 plasmidique de région) sont conçus (Figure 1) pour favoriser dans l' épissage in vivo dans la levure.
   3. On purifie tous les fragments de PCR (mutagènes et non mutagènes) avec un kit d'extraction de gel du commerce, selon le protocole du fabricant.
4. Linéariser le vecteur de telle sorte que les régions d'environ 50 pb adjacentes sont créées, qui sont homologues aux extrémités 5 'et 3' extrémités du gène cible.
   1. Préparer un mélange réactionnel contenant de linéarisation 2 pg d' ADN, 7,5 U Bam HI Xho I 7,5 U, 20 ug de BSA et 2 pi de tampon de Bam HI 10x dans un volume final de 20 ul.
   2. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 2 h et 40 min. Ensuite, procéder à l'inactivation à 80 ° C pendant 20 min.
5. Purifier le vecteur linéarisé par extraction sur gel d' agarose afin d' éviter toute contamination avec le plasmide circulaire résiduel (figure 2).
   1. Charger le mélange de réaction de digestion dans le méga-puits d'un gel semi-préparative bas point de fusion d'agarose (0,75%, w: v), ainsi que d'une partie aliquote (5 pi) du mélange de réaction dans le puits adjacent en tant que journaliste.
   2. Run ADN électrophorèse (5 V / cm entre les électrodes, 4 ᵒC) et séparer le gel d'agarose correspondant à la méga-puits et le stocker à 4 ᵒC dans 1x TAE.
   3. Colorer la voie avec l'échelle de poids moléculaire et le journaliste. Visualisez les bandes sous lumière UV. Nick la position où les places de vecteurs linéarisés.
      Remarque: Comme la qualité du vecteur linéarisé purifié est un critifacteur cal pour la recombinaison avec succès et de l'assemblage dans la levure, éviter la coloration de gel d'électrophorèse d'ADN semi-préparative. L'utilisation de colorants et de l' exposition aux UV pour l' extraction de gel peut affecter la stabilité du vecteur d'ADN, ce qui compromet l'efficacité in vivo de recombinaison. Comme alternative aux colorants de EtBr toxiques gel rouge et des colorants SYBR sont couramment utilisés pour la coloration du gel.
   4. En l'absence de lumière UV, d'identifier le vecteur linéarisé dans le fragment méga-puits en utilisant la direction des entailles dans la voie indicatrice colorée de manière à pouvoir être isolée.
   5. Extraire le vecteur linéarisé à partir d'agarose et on purifie avec un kit d'extraction de gel du commerce, selon le protocole du fabricant.
      Remarque: Utilisez haute copie vecteurs navettes épisomique avec des marqueurs antibiotiques et auxotrophie: Dans cet exemple , nous avons utilisé l'uracile indépendant et résistance à l' ampicilline pJRoC30 vecteur, sous le contrôle du promoteur de levure GAL1.
6. Préparer une mi équimolairexture des fragments de PCR et le mélanger avec le vecteur linéarisé à un ratio de 2: 1, avec pas moins de 100 ng du plasmide linéarisé (essai différents rapports de bibliothèque équimolaire / vecteur ouvert à obtenir de bons rendements de transformation).
   1. Mesurer l'absorbance des fragments de PCR et le vecteur linéarisé à 260 nm et 280 nm afin de déterminer leur concentration et leur pureté.
7. Transformer des cellules compétentes de levure avec le mélange d'ADN en utilisant un kit de transformation de levure commerciale (voir le tableau pour les fournitures) selon les instructions du fabricant.
   1. Ici, utiliser une protéase déficiente et URA3 ^- dépendante S. cerevisiae, BJ5465. Transformer les cellules avec le vecteur circularise parental comme standard interne durant la sélection (voir ci-dessous). En outre, vérifier les antécédents en transformant le vecteur linéarisé en l'absence de fragments de PCR.
      Remarque: En cas de détection de niveaux initiaux de sécrétion faible, utilisez S.cerevisiae souches déficientes en protease comme BJ5465 pour favoriser l'accumulation de protéine active dans les surnageants de culture. Si l'enzyme cible est soumis à une hyperglycosylation, l'utilisation de souches de glycosylation déficiente (par exemple Δ kre2 qui est seulement capable de se fixer oligomères plus petits mannose) pourrait être une option appropriée.
8. Plaque les cellules transformées sur SC plaques d'abandon et les incuber à 30 ° C pendant trois jours. Plate (sur SC plaques d' abandon complété par l' uracile) URA3 ^- S. cellules cerevisiae dépourvues du plasmide comme témoin négatif pour le dépistage (voir ci - dessous).

2. Haut-Throughput Screening Assay (Figure 3)

1. Remplir un nombre approprié de plaques à 96 puits stériles (23 plaques pour analyser une banque de 2.000 clones) avec 50 ul par puits de milieu minimal à l'aide d'un robot de pipetage.
2. Prélever des colonies individuelles de la SC-goutte sur les plaques et les transférer sur les plaques à 96 puits.
   1. Dans chaque assiette, inoculer le numéro de la colonne 6 avec le type parental comme étalon interne et bien H1 avec URA3 ^- S. cerevisiae (cellules dans du milieu SC complété avec de l' uracile) sans plasmide en tant que témoin négatif.
      Remarque: Eh bien H1 est rempli spécifiquement avec les médias d'abandon complété par l' uracile. Un média vierge puits contenant sans cellules peut également être préparé comme un contrôle de stérilité supplémentaire.
3. Couvrir les plaques avec leurs couvercles et les envelopper dans Parafilm. Incuber les plaques pendant 48 heures à 30 ° C, 225 tpm et 80% d'humidité relative dans un shaker humide.
4. Retirer le parafilm, ajouter 160 ul de milieu d'expression dans chaque puits à l'aide du robot de pipetage, et de reboucher les plaques incuber pendant encore 24 heures.
   Note: moyenne minimale et moyenne d'expression sont préparés comme rapporté ailleurs ^19. Les taux de sécrétion peuvent varier selon le gène à l'étude et, par conséquent, le til l'incubation fois doivent être optimisées dans chaque cas pour synchroniser la croissance des cellules dans tous les puits.
5. Centrifuger les plaques (plaques de base) à 2800 x g pendant 10 min à 4 ° C.
6. Transférer 20 pl du surnageant des puits de la plaque maîtresse à la plaque de réplique à l'aide d'un robot de manipulation multiposte liquide.
   Remarque: Pour favoriser la sécrétion de l' enzyme , il est conseillé de remplacer le peptide signal natif de la protéine cible par des peptides de signal couramment utilisés pour l' expression hétérologue dans la levure (par exemple, le facteur α prépro-chef, le chef de la K ₁ tueur toxine de S. cerevisiae, ou même des versions chimères de deux peptides ^13). En variante, le peptide signal natif peut être évolué exclusivement pour la sécrétion dans la levure.
7. Ajouter 20 pi de 2 mM de p -methoxybenzylalcohol dans 100 mM de tampon phosphate de sodium à pH 6,0 à l'aide du robot de pipetage. Incorporer les plaques brièvement avec un nous 96ll mélangeur de plaque et les incuber pendant 30 min à température ambiante.
8. Avec le robot de pipetage, ajouter 160 ul du réactif FOX à chaque plaque de réplique et remuer brièvement avec le mélangeur (concentration finale de mélange FOX dans le puits: 100 uM xylénol orange, 250 uM Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} et 25 mM de H ₂ SO _4).
   1. Ajouter plusieurs additifs au réactif pour améliorer la sensibilité, tels que des co-solvants organiques (DMSO, l' éthanol, le méthanol ou le sorbitol) ^17. Ici, amplifier la réaction par addition de sorbitol à une concentration finale de 100 mM (figure 4).
9. Lire les plaques (mode point final, t ₀₎ à 560 nm sur un lecteur de plaque.
10. Incuber les plaques à température ambiante jusqu'à ce que la couleur se développe et mesurer l'absorption à nouveau (t _1).
    1. Calculer l'activité relative de la différence entre la valeur d'ABS après incubation et celui de la mesure initiale normalisée à la éplucherType ntal pour chaque plaque ₍₁ At - t _0).
11. Soumettre les meilleurs tubes mutants à deux re-projections consécutives pour exclure les faux positifs.
    Remarque: En général, re-projections comprennent l' isolement du plasmide à partir de levure, d' amplification et de purification dans Escherichia coli, suivie d' une transformation de cellules de levure fraîche avec le plasmide ^19. Chaque clone sélectionné est re-projeté en pentaplicate.

Résultats

AAO de P. eryngii est un flavooxidase extracellulaire qui fournit des peroxydases fongiques par H ₂ O ₂ pour commencer à attaquer la lignine. Deux segments de AAO ont été soumis à l' évolution centrée dirigée par MORPHING afin d'améliorer son activité et son expression dans S. cerevisiae ^19. Indépendamment des enzymes étrangers hébergés par S. cerevisiae, la question la plus critique lors de la construction ...

Discussion

Dans cet article, nous avons résumé la plupart des trucs et astuces employées dans notre laboratoire pour concevoir des enzymes par l' évolution dirigée dans S. cerevisiae ( en utilisant AAO comme exemple) afin qu'ils puissent être adaptés pour une utilisation avec de nombreux autres systèmes enzymatiques eucaryote en suivant simplement l'approche commune décrite ici.

En termes de création de la bibliothèque, MORPHING est une méthode en un seul pot rapide à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)