Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris

Résumé

Cet article présente une méthode rapide et simple pour l'administration de la bléomycine directement dans la trachée de souris par intubation. Les principaux avantages de cette méthode est qu'il est hautement reproductible, facile à maîtriser, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de longs temps de récupération.

Résumé

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduction

En dépit de quelques différences anatomiques et physiologiques, ^{1 modèles} murins continuent à être très précieux pour la modélisation de la biologie humaine et la pathogenèse de la maladie. ² Du point de vue l'élevage, les souris sont faciles à manipuler, avoir un temps de reproduction faible, une durée de vie accélérée, et sont relativement peu coûteux à la maison. Avec le développement de souches diverses génétiques et stratégies (ex., Knock-out conditionnel, souris rapporteurs, les approches de la lignée de traçage, etc.), ainsi que la large gamme de réactifs disponibles (par ex., Des anticorps, des protéines recombinantes, des inhibiteurs, etc.), les souris sont devenues un organisme modèle vertébré essentiel pour découvrir les processus de l'homéostasie et les maladies humaines. ³

Les souris ont été particulièrement précieux pour l'étude des conditions pulmonaires, y compris les lésions aiguës du poumon (ALI) et la fibrose pulmonaire. ⁴ ALI chez l'homme peut être causée par un traumatisme, une blessure ou une septicémie et se caractérise par l'épithélium etfuite endothéliale (ie., oedème), l'inflammation et la fibrose naissante. Chez de nombreux patients, ALI progresse à sa forme sévère, syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), ce qui se traduit souvent par la fibrose et de la mort par insuffisance respiratoire. ^5,6 La fibrose pulmonaire est une pathologie évolutive fatale caractérisée par le dépôt excessif de matrice extracellulaire , notamment collagène de type I, qui conduit à la fonction pulmonaire. ^7,8 administration de la bléomycine (BLM) est le modèle le plus largement utilisé et le meilleur caractérisé pour induire ALI et de la fibrose chez les animaux expérimentaux. ⁹ Bien que BLM-induit une fibrose pulmonaire chez les rongeurs ne récapituler pas pleinement les phénotypes fibrotiques humains, ¹⁰ des études de souris avec ce modèle ont conduit à la découverte de nombreux facteurs importants influant sur ​​l'apparition et la progression de la maladie ^11.

Bien que le mécanisme exact (s) derrière fibrogenèse induite BLM-ne sont pas connus, la blessure initiationon pense résultant d'un contact dépendant des brins d'ADN des pauses dans les cellules épithéliales qui tapissent les voies aériennes et les alvéoles, et en particulier, tapez 1 pneumocytes. ¹² La nécessité d'un contact direct entre BLM et l'épithélium pulmonaire met en évidence l'importance d'un itinéraire de livraison robuste , et ces préoccupations sont également pertinentes pour un large éventail de traitements ciblés pour les voies aériennes distales, y compris les protéines recombinantes, les anticorps, siRNA, virus, bactéries, particules, et plus encore. Aspiration oropharyngée (OPA) a été largement utilisé à cette fin ^13, mais un défaut majeur de l'OPA est qu'une partie de l'agent livré peut être avalé dans le tractus gastro-intestinal, ce qui conduit à l'imprécision de la dose administrée. Une autre approche est largement utilisé instillation transtracheale, ce qui implique une trachéotomie sous anesthésie forte pour exposer la trachée et l'instillation d'un agent directement dans les voies respiratoires. ¹⁴ Cependant, non seulement, de tellesune procédure pas souhaitable en raison de son invasivité, mais il est aussi prend du temps, nécessite un peu juste de la formation, et provoque une blessure puissant pour les voies respiratoires. ^15,16 Plusieurs protocoles ont été élaborés qui impliquent l'administration directe des agents dans le trachée sans avoir besoin d'une intervention chirurgicale, ^{16,17,18,19,20} mais ces méthodes impliquent étendues temps de récupération causée par les anesthésiques puissants, l'utilisation d'un équipement coûteux (ie., otoscope / laryngoscope, disponibles dans le commerce planches de procédure, fibre optique fils, etc.), un excès de manipulation dans la cavité buccale, et l'incertitude en ce qui concerne le dosage.

Le présent document décrit une méthode relativement facile de l'administration par intubation qui permet à un chercheur rapidement, à moindre coût, et inculquer de manière fiable un réactif dans le poumon murin avec un risque limité de dommages résiduels aux tissus environnants.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les soins et l'utilisation des comités institutionnels animaux (IACUC) à l'Université de Washington et de Cedars-Sinai Medical Center ont approuvé les travaux nécessaires à ces études animales.

1. Préparation

1. Stériliser les deux pinces à extrémité franche et l'autoclave abaisse via.
2. L'utilisation d'un poste de sécurité microbiologique, préparer un stock de travail de BLM dans PBS de la poudre lyophilisée. Sonication la solution pendant 10 min à 35 kHz pour assurer un mélange homogène.
   Remarque: Un volume total compris entre 30 et 45 pi est recommandée pour éviter pipetage variation sur le bas de gamme, et la suffocation avec des volumes plus importants.
3. Préparer un espace de travail propre qui comprend environ 1 m ^{2 pour la} procédure elle-même, ainsi que des endroits désignés pour les cages à la fois avant et après la procédure.
4. Fixer la base de la procédure conseil sur le banc juste en face du chercheur en mettant 2 ou 3 bandes de ruban de laboratoire à travers la base et Ss-ying banc. Voir la figure 1 pour plus de spécifications sur la création d'un conseil.
5. Attachez une seule longueur de taille 4.0 fil de suture entre les deux vis de la carte de la procédure de positionnement.
6. Générer un spiromètre de fortune en enlevant et en écartant le piston de trois seringues de 1 ml, et le dépôt de 60 ul de PBS dans la partie supérieure de chaque cylindre pour former un joint étanche à l'air. Fixer le moyeu du cathéter de manière lâche l'une des seringues et le placer sur un côté de la planche.
7. Aspirer 300 pi d'air dans une seringue de 1 ml et placez-le sur un côté de la planche.
8. Couper une pièce supplémentaire de bande d'environ 6 pouces de longueur et la mettre de côté. Il sera utilisé pour fixer l'animal à la carte à l'étape 2.4.
9. Mettre en place une chambre isoflurane. Fixez O _2, l'isoflurane et vide aux ports appropriés à la fois la chambre d'exposition et le vide de dégagement. Alternativement, d'administrer un anesthésique dans un isoflurane compatible biologiqueenceinte de sécurité.

2. intubation

1. Anesthésier la souris avec de l'isoflurane dans la chambre jusqu'à ce qu'il perde conscience et la respiration ralentit à un taux approprié. Une exposition typique comprend 4% d'isoflurane et _{2% d'O 2} pendant 3 à 4 min, et le résultat idéal est de 2 à 2,5 minutes de la sédation. Cela correspond à un taux de respiration 1 toutes les 2 s de respiration.
2. En attendant que la sédation de mettre en, aspirer entre 30 et 45 pi de BLM dans une pipette et la mettre de côté.
3. Lorsque vous êtes prêt, de suspendre la souris sous sédation par ses incisives supérieures du fil attaché aux vis de la plate-forme de la procédure de positionnement. Assurez-vous que le dos de l'animal repose à plat sur la surface de la plate-forme.
4. En faisant attention de ne pas restreindre la ventilation, placez un morceau de ruban adhésif de manière lâche à travers le (caudale) partie inférieure de la cage thoracique, juste au-dessus du diaphragme. Le placement doit être assez serré pour maintenir un alignement correct au cours de la procedure, mais pas tellement serré qu'il restreint la respiration.
5. Allumer le dispositif d'éclairage entre 80% et 100% d'intensité et d'orienter le col de cygne de sorte qu'il est de 1 à 2 cm de la surface de la peau, à proximité du plexus solaire. Vérifiez régulièrement la pointe du col de cygne pour la chaleur pour assurer qu'il ne nuit pas à la souris.
6. Debout derrière la plate-forme, utilisez les, pince à extrémités franches stériles pour localiser la langue. En veillant à éviter les incisives inférieures, doucement adhérence et d'en tirer la langue hors de la cavité buccale.
7. En utilisant la main restant, insérer le dépresseur et l'utiliser pour aplatir la langue contre le fond de la cavité buccale. Relâchez la pince, mais laisser le abaisse en place pour les deux étapes suivantes.
8. Orienter la lumière de sorte que la trachée est visible par le col de cygne de guidage de manière proximale par rapport au niveau du plexus solaire jusqu'à ce qu'il atteigne le niveau des bronches de l'axe principal.
   Remarque: La trachée peut être facilement distinguée par l'action de la respiration, WHIch provoque la lumière émise à fluctuer en intensité. Lorsqu'il est correctement positionné, cette structure sera discernable dans le plan axial une broche situé au centre de la lumière avec un minimum de lumière ambiante dans la cavité buccale elle-même.
9. Angle de la seringue afin qu'il suive le chemin naturel de la trachée, et abaisser l'extrémité du cathéter 22-G, avec la seringue attachée contenant la goutte, directement dans la lumière. La bulle PBS va commencer à monter et descendre à chaque respiration lors du placement réussi.
   Remarque: Cette action peut être retardée de plusieurs secondes à la suite de la sédation profonde.
10. Nourrir le cathéter dans un supplément de 5 mm. Retirer l'abaisse-langue.
11. Décaler la seringue à la main opposée, et saisir le moyeu, retirez délicatement la seringue.
12. Dépôt entre 30 et 45 pi de BLM dans le centre de l'intérieur du moyeu de cathéter, fixer la deuxième seringue et dispense 300 pi de l'air dans le moyeu.
13. Remplacer la deuxièmeseringue avec le premier contenant la bulle de PBS. La bulle va continuer à augmenter et à l'automne si la procédure a été effectuée avec succès.

Soins 3. postopératoire

1. Retirer le cathéter et la bande, et placer l'animal dans un endroit chaud et sec jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience - généralement au bout de quelques minutes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Souris intubés ont été suivis quotidiennement pour perdre du poids et de la détresse, et sacrifiés 4, 10 ou 17 jours plus tard par injection intrapéritonéale de 2,5% 2,2,2 tribromoéthanol. Lavage broncho-alvéolaire (BAL) a été recueilli en trois lavages de PBS comme décrit par ailleurs ²¹ et le poumon droit a été fixé à 10% de formol, inclus dans la paraffine et coloré avec du trichrome de Masson par l'Université de Washington histologie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Dans les cas où aérosol est impossible, en raison de la disponibilité limitée de réactifs, de la sécurité, ou le coût, l'administration de la trachée directe est une méthode supérieure pour l'administration d'agents exogènes dans les poumons ¹⁶ transtrachéale instillation a été largement utilisé à cette fin.; Cependant, comme pour toute intervention chirurgicale, il porte aussi en elle le risque de complications causées par la procédure elle-même, et pas nécessairement l'a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101