Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Résumé

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Résumé

Coxiella burnetii, l'agent responsable de la fièvre Q, est une bactérie intracellulaire obligatoire. Des dosages diagnostiques basées sur la PCR ont été développées pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures de cellules et d' échantillons cliniques. PCR nécessite un équipement spécialisé et une formation approfondie de l'utilisateur final, et par conséquent, il ne convient pas pour le travail de routine en particulier dans une zone de ressources limitées. Nous avons mis au point une boucle à médiation par une amplification isotherme (LAMP) essai pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de patients. Ce procédé est effectué à une seule température d'environ 60 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant. La sensibilité de ce dosage de la lampe est très similaire à la PCR avec une limite de détection d'environ 25 copies par réaction. Ce rapport décrit la préparation de la réaction en utilisant des réactifs lyophilisés et la visualisation des résultats en utilisant le bleu hydroxynaphthol (HNB) ou une lampe UV avec colorant fluorescent intercalant dans la réaction. Les réactifs LAMP étaient lyophilized et conservé à température ambiante (TA) pendant un mois, sans perte de sensibilité de détection. Ce test LAMP est particulièrement robuste car la préparation du mélange réactionnel ne comporte pas d'étapes complexes. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans des environnements à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.

Introduction

Le petit Gram négatif bactérie Coxiella burnetii est l'agent causal de la fièvre Q, qui est une zoonose dans le monde entier. En raison de la distribution mondiale de la fièvre Q et la forte infectivité de C. burnetii, les militaires et les civils américains déployés à l' étranger sont à risque d'être infectés dans les zones endémiques.

La fièvre Q se manifeste sous deux formes: les infections aiguës et chroniques. La fièvre Q aiguë se présente avec des symptômes semblables à la grippe, l'hépatite, ou la pneumonie, et est habituellement une maladie auto-limitation avec un faible taux de mortalité. La fièvre Q chronique, alors que moins répandue, se traduit souvent par une endocardite, qui a un taux de mortalité beaucoup plus élevé si non traitée ^1,2. Par conséquent, le diagnostic précoce pour guider un traitement approprié est essentiel pour les soins aux patients. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) et en temps réel de PCR quantitative (qPCR) essais ont été développés pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures cellulaires et des échantillons cliniques ^{3-5 <}/ Sup>. Les deux PCR et qPCR sont coûteuses et souvent pas facilement disponibles dans les zones de ressources limitées pour le travail de routine.

Initialement décrit par Notomi ^6, isothermes amplification de boucle médiée (LAMP) offre une méthode d'amplification d' ADN alternative. Lampe utilise l' ADN polymerase Bst pour la synthèse d'ADN par déplacement de brin ainsi que des ensembles d' amorces spécialement conçues qui reconnaissent au moins six régions indépendantes du gène cible. L'avantage le plus important de lampes est que l'amplification se produit dans des conditions isothermes. Par conséquent, seul un bain d'eau, bloc chauffant ou un incubateur est nécessaire. Cette méthode a été utilisée pour détecter plusieurs pathogènes rickettsies ^7-9. La visualisation des produits d'ADN amplifiés par électrophorèse sur gel est la méthode la plus précise qui permet de différencier les vrais positifs de faux positifs dus à une amplification non spécifique. Toutefois, les procédures impliquées dans l'électrophorèse sur gel ne sont pas pratiques pour les ar des ressources limitéeseas. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter les produits de la réaction. Ces alternatives, telles que la turbidité dérivée de la formation de pyrophosphate de magnésium ¹⁰ ou à l' aide d' un colorant fluorescent intercalant pour être visualisé sous lumière UV ^11,12 sont plus favorables que l' exécution d' un gel. Les réactifs LAMP ont été stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à 25 ° C et 37 ° C, qui sont des températures ambiantes dans les pays tropicaux et sub-tropicales où la fièvre Q est endémique ^13.

Un essai de lampe a été développé dans notre laboratoire pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de plasma ^14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation du mélange réactionnel de lampe à partir des réactifs lyophilisés. Les réactifs lyophilisés sont stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à température ambiante. Lorsqu'il est combiné avec une méthode de visualisation facile, ceci est une méthode idéale à utiliser pour détecter C. burnetii dans un cadre de ressources limitées.

Protocole

1. Préparer ADN plasmidique Dilutions comme standard pour LAMP Réaction

1. Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique (DO) à 260 nm pour déterminer le plasmide (contenant IS1111a du gène cible de C. burnetii RSA 493) la concentration d'ADN. Une _DO260 de 1 correspond à 50 pg / pl d'ADN.
2. Convertir la quantité d'ADN plasmidique dans le nombre de copies. Étant donné que la taille du plasmide est de 6330 pb, le poids moléculaire de ce plasmide est de 4,1 x 10 ⁶ g (6,330 bp x 649 g / pb). La concentration d'ADN du plasmide est de 34,2 ng / pl (tel que déterminé à l'étape 1.1). 1 ul de cet échantillon d'ADN contient 34,2 ng d'ADN de plasmide, ce qui équivaut à 5 x 10 ⁹ copies (34,2 x 10 ^-9 g / 4,1 x 10 ⁶ x 10 6,02 gx ²³⁾ de l' ADN.
3. Ajouter 10 ul d'ADN plasmidique (5 x 10 ⁹ copies / pl) à 90 pl d'eau pour une dilution de 10 fois pour obtenir un échantillon d'ADN de 5 x 10 ⁸ copies / ul.
4. Répétez l' étape 1.3 pour préparer des échantillons d' ADN de 5 x 10 ^7, 5 x 10 ⁶ à 5 x 10 ⁵ 5 x 10 ⁴ à 5 x 10 ³ à 5 x 10 ² à 5 x 10 ¹ et 5 x 10 ⁰ copies / ul.

2. Préparer Modèle d'ADN à partir d'échantillons pour LAMP Reaction

1. Réaliser une extraction d'ADN à partir d'échantillons de plasma humain en utilisant un kit d'ADN de mini-utilitaire selon le protocole du fabricant. Utilisez un total de 200 échantillons ul pour l'extraction et éluer l'ADN extrait dans un volume de 20 pi.

3. Préparer 2x tampon de réaction LAMP

1. Mélanger 200 pi de 10x Pol Buffer, 320 pi de 5 M trimethylglycine, 12 pi de 1 M MgSO _4, 280 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun) et 188 pi d'eau pour faire 1 ml de tampon 2x LAMP. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.

4. Effectuez standard LAMP Réaction

1. Mélanger 12,5 pl de 2x LATampon MP (tel que préparé à l' étape 3; 40 mM de Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM , du sulfate de magnésium 16 _4, 20 mM (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% de Triton X-100, 1,6 M triméthylglycine, 1,4 mM de mélange de dNTP), 1,2 pi de mélange d' amorces, 1 pi d'ADN polymerase Bst (8 U / ul) et 5,3 ul d'eau pour rendre le mélange réactionnel (20 ul) dans un tube PCR de 0,2 ml.
2. Ajouter 5 pi d'ADN (de l'étape 1 ou 2) au mélange de réaction de 20 ul et bien mélanger.
3. Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou d'un bloc de chauffage. Ceci est la température de réaction optimale déterminée au préalable.
4. Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction.
5. Charge 5 pi de produits de réaction sur un gel d'agarose 2% coloré avec intercalation colorant d'acide nucléique.
6. Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE.
7. Visualisez les résultats par la lumière UV.

5. Effectuez LAMP Réaction avec ReconstituéRéactifs

1. Mélanger 125 pi de tampon 10x Pol, 200 pi de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M _MgSÛ4, 667,5 pi d'eau pour faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.
2. Retirer les tubes qui contiennent les réactifs lyophilisés du sachet en feuille d'aluminium scellée. Ne pas utiliser les tubes si le sac de papier d'aluminium ne soit pas scellé ou si elle est endommagée.
3. Ajouter 20 pi de tampon de reconstitution dans chaque tube pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés.
4. Mélanger par pipetage tampon de haut en bas 5 fois. Jetez un coup d'oeil pour vous assurer que les réactifs lyophilisés sont complètement remis en suspension. La poudre blanche devrait disparaître dans le tube.
5. Ajouter 5 ul de matrice d'ADN (de l'étape 1 ou 2) pour les réactifs reconstitués et bien mélanger.
6. Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou d'un bloc de chauffage.
7. Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction.
8. Charge 5 pi de réactionproduits à un gel d'agarose à 2% coloré avec intercalation colorant d'acide nucléique.
9. Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE.
10. Visualisez les résultats par la lumière UV.

6. Effectuer LAMP Réaction avec tampon de reconstitution contenant HNB ou fluorescent intercalant Dye

1. Mélanger 125 ul de 10 x Pol tampon, 200 ul de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M MgSO _4, 7,5 pi d'mM HNB 20 (ou 12,5 pi de 100x colorant fluorescent intercalant) et 660 ul (ou 655 pi) d'eau à faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.
2. Utilisez le tampon reconstitué préparé à l'article 6 de répéter les étapes 5.2 - 5.6.
3. Visualisez les résultats par l'oeil nu (réaction contenant HNB) ou une lumière UV (réaction contenant colorant fluorescent intercalant).

7. Effectuer en temps réel LAMP Réaction avec Tube Scanner

1. Ajouter 5 ul ADN à la reconstitutréactifs és contenant colorant fluorescent intercalant, fermer le tube et l'insérer dans le scanner de tube.
2. Régler la température d'incubation à 60 ° C. Mesurer la fluorescence à 520 nm pendant 60 min.

Résultats

Les réactifs LAMP lyophilisés l' intérieur du tube de 0,2 ml contient Bst ADN polymérase, des amorces et des dNTP. 20 ul de tampon de reconstitution est utilisée pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés. La figure 1 montre les résultats de la réaction LAMP sur des gels d' agarose avec des réactifs fraîchement préparés et des réactifs lyophilisés. Le réactif lyophilisé ne réduit pas son activité. Les réactions de LAMP prép...

Discussion

Auparavant, nous avons développé un test LAMP sensible et spécifique ciblant l'élément d'insertion IS1111a ^14. L'élément IS1111 a été choisi parce qu'il est hautement conservée entre les différentes souches de C. burnetii et son nombre élevé de copies (7-110) dans les bactéries (Klee 2006). Nos résultats ont montré que la lampe peut détecter environ 25 copies de l'élément IS1111, qui peut en corrélation avec aussi peu que une copie ch...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP primers	Eurofins MWG operon	10 nmol, salt free	Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 units/ml
10x Thermo pol buffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP mixture	New England Biolabs	N0447L	10 mM each
Betaine	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	gel loading buffer
SYBR green	Invitrogen	S7585	10,000x, visualize products in tubes
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents	Gene Reach
Hydroxynaphthol blue	Fluka	33936-10G
ESEQuant tube scanner	Qiagen		real-time detection