Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Plateforme Ocular pour tester Lentilles de contact

Résumé

Les modèles actuels in vitro pour l' évaluation des lentilles de contact (Cls) et d' autres applications liés aux yeux sont très limitées. La plate-forme oculaire présenté simule l'écoulement physiologique de la déchirure, le volume larme, exposition à l'air et à l'usure mécanique. Ce système est très polyvalent et peut être appliquée à diverses analyses in vitro avec NFT.

Résumé

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,^1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.⁷ The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Introduction

Deux domaines importants d'intérêt dans le domaine des lentilles de contact (CL) comprennent l'inconfort et le développement de nouvelles applications de CL. Élucider les mécanismes sous - jacents CL inconfort est une question qui a échappé le domaine depuis des décennies. ⁸ Le développement de nouveaux CLs fonctionnels, tels que les dispositifs d' administration de médicaments ^1,3,9 et biocapteurs, ^10-12 est un domaine d'intérêt croissant, avec des marchés potentiels importants. Dans les deux cas, un système sophistiqué dans le modèle in vitro pourrait fournir des informations pertinentes pour aider à la sélection appropriée des matériaux de lentilles ou des caractéristiques de conception lors de la phase de développement. Malheureusement, le courant des modèles in vitro pour évaluer CLs et d' autres applications oculaires liées sont relativement brut et sophistiqué. Traditionnellement, les études in vitro CL évaluant le dépôt du film lacrymal ou la délivrance de médicaments sont effectuées dans des flacons statiques, les grands volumes de fluide contenant un volume fixe, qui greadépasse tly quantités physiologiques. En outre, ce modèle simple n'a pas la composante de flux lacrymal naturel et le réflexe de clignement, qui sont tous deux des facteurs de l'environnement oculaire déterminant.

Le développement d'un «modèle» sophistiqué, physiologiquement pertinente de l' œil , il faudra une approche multidisciplinaire et exigent substantielle validation in vivo. Pour ces raisons, le cadre fondamental pour notre modèle in vitro de l' œil est très polyvalent, de sorte que le modèle peut être continuellement amélioré grâce à des améliorations et des modulations futures. À ce jour, le modèle est capable de simuler le volume larme, flux lacrymal, l'usure mécanique et exposition à l'air. L'objectif est de créer un modèle in vitro qui fournira des résultats significatifs, qui est prédictive et complémentaire à in vivo et ex vivo observations.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité et le respect de toutes les directives pertinentes énoncées par l'Université de Waterloo le comité d'éthique de la recherche animale. Les yeux de l'espèce bovine sont généreusement offerts à partir d'un abattoir local.

1. Eye Model

1. Conception et production de moules ¹³
   1. Concevoir les modèles de l' oeil en fonction des dimensions physiologiques moyennes des yeux humains adultes. ¹³
   2. Laissez un espace de 250 um entre le globe oculaire et les morceaux de la paupière du modèle de l'oeil. Concevoir les moules respectifs à l'aide de la conception (CAO) assistée par ordinateur.
   3. Créer un nouveau fichier .cad ou d'un fichier .sldprt avec AutoCAD ou Solidworks. Créer des modèles 3D du globe oculaire / paupière humaine. Créer des moules des modèles et enregistrer les moules sous forme de fichiers .stl.
   4. Importation de fichiers .stl dans le logiciel de l' imprimante 3D (par exemple, makeware pour replicator2). Spécifiez les paramètres de l'impression (localisation, faible densité, l' échelle, l' orientation, la douceur, etc. ) ^13.
   5. Enregistrez le fichier en tant que fichier G-code pour les imprimantes 3D à lire. Sélectionner des matériaux tels que le PLA (acide polylactique), l' ABS (styrène-butadiène - acrylonitrile), PC (polycarbonate), ou une combinaison de ceux - ci, pour imprimer les moules ^13.
   6. Installer filament souhaitée du matériau de choix. Importer le fichier G-code dans l'imprimante 3D à lire. Imprimer le moule.
      NOTE: En variante, la production des moules à l'aide d'un oeil commande numérique par ordinateur (CNC), si une surface plus lisse sur le modèle d'oeil est souhaitée. Pour CNC production de moules, des matériaux pour les moules ne sont plus limités aux plastiques thermiques, mais étendent sur le métal, la céramique et des polymères chimiquement résistants tels que le polytétrafluoroéthylène.
   7. Ouvrir l'interface de logiciel CNC qui est relié à un foret de coupe. Construire des moules 3D selon la face, de dessus, de côté et des vues en perspective des moules modèles globe oculaire / paupière précédemment construits dans l'interface du logiciel de commande. Sélectionnez les paramètres appropriés pour lausinage (taille de bits, matériau de substrat, l'épaisseur du matériau) et procéder à couper le moule.
2. Synthèse de Oculaires Utilisation PDMS
   1. En utilisant une seringue, mesurer 10 ml volume de PDMS (polydiméthylsiloxane) de base et le remplir dans un tube de centrifugeuse 15-50 ml. Ajouter 10% p / v de la solution d'élastomère en poids total du PDMS. L'utilisation d'une tige d'agitation, bien mélanger les solutions.
   2. Verser la solution PDMS dans le globe oculaire et la paupière moules. Laisser les PDMS à régler à TA O / N (ou pendant au moins 12 heures) pour démarrer la polymérisation et pour permettre aux bulles de se dissoudre hors du polymère.
      REMARQUE: Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles laissées dans le PDMS qui pourrait augmenter ou se développer.
   3. Par la suite, mettre les moules dans un four à 75 ° C (167 ° F) pendant 1 heure, ou 150 ° C (302 ° F) pendant 5 min. Pour un gel doux, laisser les PDMS sont assis à la température ambiante pendant au moins 48 heures pour polymériser complètement.
   4. Placer les échantillons dans un congélateur pendant quelques minutes; cela va réduire les PDMS et simplifierla suppression des échantillons provenant des moules. Extraire les oculaires des moules à l'aide d'une spatule fine.
   5. Pour la livraison de la solution dans l'espace entre le globe oculaire et pièces paupière, connectez un tube de polytétrafluoroéthylène 1/16 "x 1/8" avec un "connecteur de tube de coupleur 1/16 de la jambe égale et l'attacher à la pièce de la paupière au niveau du trou de tube .
3. Synthèse de Eyeball Piece Utilisation Agarose
   NOTE: Le morceau du globe oculaire peut être synthétisé en utilisant d'autres polymères tels que l'agarose. La procédure suivante peut être également modifié pour produire des morceaux de l'oeil à partir d'une variété de types de gélose, tels que PDA (agar de dextrose de pomme de terre) ou SDA (dextrose de Sabouraud agar-agar).
   1. Pour produire un 2% (2 g / 100 ml) de gel, mesure 2 g d'agarose et mélanger avec 100 ml d'eau ultrapure. Porter la solution à ébullition (100 ° C) de telle sorte que l'agarose se dissout complètement. Laisser la solution refroidir pendant 5 min.
   2. Verser la solution dans le moule du globe oculaire et laisser la solution refroidir pendant 30 min à température ambiante. Retirer les morceaux du globe oculaire avec une spatule. Stocker l'agar du globe oculaire dans un -20 ° C congélateur pour une utilisation ultérieure. Pour les études de microbiologie, stériliser les moules du globe oculaire par autoclavage et / ou UV-irradiation.
4. Incorporation de Bovine Cornea sur PDMS Eyeball
   NOTE:. Ce protocole a été adapté de Parekh et al ¹⁴
   1. Effectuer la dissection et l'incorporation des cornées bovines dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Acquérir les yeux et les disséquer le même jour.
   2. Tourner la hotte à flux pendant 10 minutes avant utilisation et désinfecter avec de l'alcool d'éthanol à 70%. Veiller à ce que tous les matériaux et instruments sont stériles par autoclavage à 273 ° F / 133 ° C pendant 45 min, et positionnés pas moins de 4 pouces de l'entrée de la hotte à flux.
   3. Immerger l'oeil bovin dans un bêcher contenant une solution de povidone-iode dilué pendant 2 min. Rincer l'oeil dans un bêcher contenant du tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4. Utilisation des pinces placent doucement l'œil sur une boîte de Pétri en verre, de la cornée face vers le haut.
   4. Retirer l'excès de muscle et le tissu adipeux en coupant au niveau des points de fixation scléral avec des ciseaux émoussés de dissection de fin. Éliminer le tissu en excès dans un bécher stérile désigné pour les déchets animaux.
   5. Utilisation de micro-ciseaux, retirer la conjonctive de l'œil. Envelopper l'oeil avec de la gaze stérile, en maintenant une distance d'au moins 1 cm à partir du limbe.
   6. À l'aide d'un scalpel, inciser la sclère d'environ 2 mm de la région limbique et superficiellement de manière à éviter la pénétration de la choroïde sous-jacente et le corps vitré. étendre soigneusement l'incision de 360 ​​° à l'aide d'un scalpel ou des ciseaux de dissection sans déformer la cornée de sa courbure naturelle.
   7. Avec une pince fine, enlever la cornée de l'oeil. En utilisant des pinces, retirez avec précaution tout tissu uvéal adhérant et rincer cornée avec PBS.
   8. Rangez la cornée à 31ºC dans un récipient stérile avec la culturemoyen (comme moyen 199) contenant 3% de sérum bovin fœtal pour maintenir l'humidité des tissus et de la nourriture de la cellule.
   9. Avant l'expérimentation, reposer la cornée excisée sur le globe oculaire PDMS, et serrer les deux pièces ensemble avec une pince spécialisée.

2. Blink-plateforme

1. Conception et production de Blink-plateforme
   NOTE: Le blink-plate-forme est composée de trois parties fonctionnelles: modèle d'oeil (décrit dans la section 1), système d'engrenage, et un système électronique.
   1. Conception et fabrication de la plate-forme de clignotement en utilisant la CAO et l'impression 3D, similaire à celle décrite pour le modèle de l'œil (section 1.1). Concevoir le système d'engrenage tel qu'il se traduit par simple rotation des moteurs dans les mouvements latéraux et de rotation des oculaires. ¹⁵
   2. En utilisant le pignon et le mécanisme d'engrenage, à traduire le mouvement d'un moteur pas à pas de rotation en un mouvement latéral d'un pignon, qui est relié aux éléments de la paupière.
   3. En utilisant lesystème d'engrenage conjugué, d'amplifier un mouvement de rotation d'un moteur pas à pas en trois (ou plus) des mouvements de rotation pour trois pièces de globe oculaire différentes.
   4. Aligner les deux systèmes d'engrenage, l'un pour la paupière et l'autre pour globe oculaire, de sorte que la distance entre les deux sont constants. Assembler le système électronique avec un microcontrôleur, le capotage moteur et deux moteurs.
      REMARQUE: Utilisez deux moteurs pas à pas pour fournir des moteurs de rotation, ce qui se traduit par le système d'engrenage en un mouvement de clignoter.
   5. Relier les deux moteurs pas à pas avec un système constitué d'un bouclier de moteur empilé sur le microcontrôleur. Connecter et configurer les composants électroniques pour travailler avec des logiciels open source.
   6. Programmer le système pour contrôler les paramètres du moteur tels que tours par minute (RPM), le nombre de tours avant, nombre de tours en arrière, et le style de tournage.
      REMARQUE: Se reporter au "fichier de code Arduino" supplémentaire pour plus de détails.
   7. Télécharger le logiciel système de la male site Web de nufacturers.
   8. Installez le logiciel et ouvrez-le. Ecrire du code pour la commande de moteurs pas à pas dans la configuration souhaitée. Connecter le système à une source pour alimenter le système électronique de façon à ce que les moteurs se déplacent de la manière désirée telle que définie par le chercheur.
      REMARQUE: Se reporter au "fichier de code Arduino" supplémentaire.
2. Montage avec microfluidique (Solution de larmes artificielles)
   1. Prenez le globe oculaire synthétisé et des morceaux de la paupière et de les glisser sur leur clip-ons correspondantes pour l'œil-modèle. Branchez le tuyau qui est relié avec une seringue et placée sur la pompe microfluidique avec la pièce de la paupière (section 1.2.5). Test de fonctionner la plate-forme et vérifier pour un mouvement cohérent.
   2. Premier tube et vérifier un flux constant de solution de larmes artificielles (ATS). La recette de l' ATS a été rapporté précédemment. ¹⁶
   3. déplacer manuellement les pièces de modèle oculaire ensemble sur un plan horizontal, de telle sorte que le globe oculaire et l'oeilcouvercle sont en contact. Régler le débit de la pompe microfluidique aux valeurs souhaitées d'écoulement. Régler les débits physiologiques à 1-1,5 ul / min. ¹⁷
   4. Démarrer la pompe et les actionneurs pour commencer l'expérience. Pour les expériences d'administration de médicaments, placer la lentille de contact contenant un médicament sur la pièce de globe oculaire.
   5. Laisser le liquide d'écoulement au goutte à goutte dans une plaque de 12 puits. Aux intervalles fixés désirés de temps, de quantifier la concentration d' un analyte ou d'un médicament en utilisant des procédés de détection communs , tels que la spectroscopie de fluorescence ou UV-Vis. ^1,4,18
   6. Pour les études évaluant le dépôt des composants de larmes sur les lentilles de contact, placez la lentille de contact sur le "globe oculaire" morceau. Recueillir le fluide d'écoulement, qui peut être mis au rebut.
   7. Une fois que les intervalles de temps désirés, retirer la lentille de contact de la pièce de globe oculaire et préparer la lentille pour une analyse ultérieure telle que la microscopie confocale.

Résultats

Les moules oculaires synthétisés obtenus à partir du magasin de machine et de l' impression 3D sont représentés sur la figure 1. Ces moules peuvent être utilisés avec une variété de polymères tels que le PDMS et d' agarose, pour produire des oculaires avec les propriétés souhaitées. L'assemblage fit signe de la plate - forme du modèle d'oeil avec une pompe à seringue microfluidique est représentée sur la figure 2. La plat...

Discussion

Il y a trois étapes critiques dans le protocole qui nécessitent une attention particulière: la conception et la production de moules (section 1.1), l'ensemble de la plate-forme (section 2.2.1-2.2.3), et le suivi de l'essai expérimental (section 2.2.4-2.2.7 ). En termes de conception et de production de moules (section 1.1), la pièce de globe oculaire doit être conçu selon les dimensions d'une cornée humaine. Cependant, il peut nécessiter plusieurs prototypes du moule avant une pièce de globe oculai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)	Adafruit	50	Board
Stepper motor	Adafruit	324	Motor and Motor shield
Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16"	VWR	CA11009-280	50 pcs of tube connector
Tubing PT/SIL 1/16"x1/8"	VWR	16211-316	Case of 50feet
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation
Agarose, Type 1-A, low EEO	Sigma-Aldrich	A0169-25G
PHD UltraTM	Harvard Apparatus	703006	MicroFluidic Pump
Bovine cornea	Cargill, Guelph/ON
Soldidworks	Dassault Systemes		Software
3-D printing	University of Waterloo - 3D Print Centre
Dissection tools	Fine Science Tools		General dissection tools
Medium 199	Sigma-Aldrich		Culture medium storage for cornea
Fetal bovine serum	Thermo Fisher		Add to culture medium, 3% total volume