Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes

Résumé

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Résumé

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduction

Les sinusoïdes hépatiques contiennent de nombreux sous-types de leucocytes de diverses activités immunitaires importantes pour l'organisme. Par exemple, marginating hépatique (MH) tueuses naturelles (cellules NK), aussi appelées cellules de la fosse, se caractérisent morphologiquement comme grands lymphocytes granuleux (LGL) et fonctionnellement comme leucocytes avec une capacité cytotoxique spontanée, permettant hépatique résistance contre l'établissement de encéphalique métastases tumorales supportés. L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective des leucocytes MH, afin d'étudier cette population cellulaire importante et unique (et le compartiment immunitaire), et d'élucider l'impact des diverses manipulations (par exemple l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.

En dépit de l'absence d'immunité pour éliminer une tumeur primaire en développement, la preuve chez les patients cancéreux et les modèles animaux indiquent que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles Throul'immunité à médiation cellulaire gh (CMI). Cependant, il y a une contradiction apparente entre ces capacités dans vivo et des études in vitro chez l' homme et chez les animaux, qui démontrent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par circulation ou leucocytes spléniques ^1,2. Cette incohérence peut être attribuée, au moins en partie, à l'existence in vivo d'une sous - population leucocytaire distincte, à savoir les (sinusoïdes) leucocytes marginating-hépatique et leur sous - population de cellules NK activées, à savoir les cellules de la fosse ^3. En effet, les données non publiées provenant de notre laboratoire ont indiqué que des rats F344 cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélées résistantes aux leucocytes circulants et spléniques, ont été lysées par les cellules MH-NK ^4. Ainsi, les cellules tumorales qui sont prétendument "NK-résistant" aux leucocytes circulants peuvent être contrôlées par les cellules MH-NK. Il convient de noter, chez la souris l'activité accrue de MH-NK est évident qu'à la suite in vivo immunitairela stimulation (par exemple , par l'utilisation de poly I: C , ou le CpG-C) ^5.

Les cellules NK spécifiques hépatiques (MH-NK) sont situés à l'intérieur de la lumière sinusoïdales, adhérant aux cellules endothéliales et les cellules de Kupffer. Cellules MH-NK sont caractérisées exclusivement par des granules denses sphériques et des vésicules de tige-évidée ^6, qui contiennent de la phosphatase acide que les enzymes lysosomales et perforine et granzymes comme substances bioactives ^7,8. Par rapport à circulation des cellules NK, les cellules MH-NK présentent un plus grand nombre et la taille des granules et des vésicules ^9-11. Dans des conditions inflammatoires, des cellules MH-NK ont été révélés présenter une expression plus élevée de LFA-1 ¹² par rapport à la circulation des cellules NK. Cette expression accrue peut constituer un mécanisme par lequel les cellules MH-NK sont plus cytotoxiques contre certaines cellules tumorales circulantes que les cellules NK ^13,14. nterestingly, après une incubation in vitro avec l' interleukine (IL) -2, les cellules MH-NK se dilatent etleur nombre et la taille des granules augmentent, qui sont tous compatibles avec un pro fi le du tueur de lymphokine activé (LAK) cellules ^15.

leucocytes actifs MH ne peuvent pas être exclusivement obtenues par les méthodes de récolte leucocytaires du foie standard, qui sont basées sur le broyage et la dégradation biologique du tissu. Notre approche de perfusion décrit ici présente deux avantages majeurs par rapport aux approches standard. Premièrement, l'approche de perfusion récolte sélective des leucocytes MH, empêchant la contamination par d'autres leucocytes d'autres compartiments du foie. Deuxièmement, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité, l'activité, et le milieu physiologique des leucocytes MH, contrairement au traitement des tissus approches qui endommagent les cellules ou modifier leur morphologie, et en raison de lésions tissulaires, induisent la libération de divers facteurs qui modulent nettement immunitaire activité.

Le foie est un organe cible majeur pour les métastases du cancer and pour diverses infections ^16. Comme les cellules MH présentent des caractéristiques uniques, il est important d'étudier cette population spécifique dans diverses conditions à l'égard de ces pathologies. Par exemple, il est intéressant de noter que l' activation immunitaire systémique par divers BRM (par exemple poly I: C ou CpG-C) ont été montré pour activer MH-leucocytes plus de leucocytes ⁵ circulation.

Protocole

Déclaration d'éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université de Tel-Aviv.

Protocole 1. Rats

1. Les préparatifs
   1. Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) de solution pour être utilisé à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d'héparine sans conservateur, par ml de solution saline de phosphate (PBS) 1 x solution tampon. Calculer 35 ml par animal.
   2. Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d'air.
   3. Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)).
2. Perfusion du foie et de la collection de MH-leucocytes
   1. Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 50 ml contenant un isofluranepad -soaked autour de la tête de rat jusqu'à l'ouverture de sa cavité thoracique.
   2. Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration. Évitez les saignements à travers ce processus.
      1. Plus précisément, commencer l'incision au niveau du point médian abdominale basse, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure.
   3. Dans environ une minute, de recueillir autant de sang que possible (~ 6 ml de 250 g animale) du ventricule droit dans une seringue.
   4. Fixer la veine cave caudale avec un hémostatique aussi près que possible du coeur, afin de permettre la collecte de perfusat.
   5. Tirez sur les intestins et en dehors de l'animal à la droite de l'expérimentateur, pour exposer la veine porte.
   6. Insérer un cathéter 25 G IV, relié à une pompe péristaltique, dans la veine porte, comme caudale que possible,mais rostrale à la veine splénique.
   7. Insérer une aiguille de calibre 25 de papillon, relié à une seringue de 5 ml, dans la veine cave inférieure, caudale par rapport à la pince hémostatique.
   8. Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 3 ml / min et de recueillir doucement les premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang dans la seringue. Continuez jusqu'à ce que la couleur perfusat est tour à tour rouge pâle (environ 3-5 ml). Notez que la couleur du foie évolue vers brun clair.
   9. Sans arrêter la pompe péristaltique, remplacer la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue de 20 ml, la récolte et la collecte d'au moins 20 ml d'une solution de perfusion du foie en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 4 ml / min). Surveiller en permanence le flux de perfusat dans la seringue de collecte, et d'éviter le vide qui est trop forte (qui peut obstruer l'aiguille à travers l'effondrement des murs de veine cave).
   10. Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair.
3. leucocytes Extraction
   1. Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g, 24 ° C.
   2. Aspirer le surnageant
   3. Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant. Sur la base des objectifs de l' étude, utiliser la préparation en est, ou de procéder à des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité).
      1. Plus précisément, la couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large.
      2. Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l'insérer dans un tube de 5 ml.

2. Protocole de souris

1. Les préparatifs
   1. Préparer une solution de PBS héparinisé (30 unités / ml) à utiliser à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d'héparine sans conservateur par ml de tampon phosphate salin (PBS) 1 x solution. Calculer 20 ml par animal.
   2. Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d'air.
   3. Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)).
2. Perfusion du foie et de la collection de MH-Leucocytes
   1. Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 15 ml contenant un tampon imbibé isoflurane autour de la tête de la souris jusqu'à l'ouverture de sa cavité thoracique.
   2. Fixer les membres de la souris à un lit.
   3. Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration, en gardant l'aspect inférieur de la membrane intacte (pour créer un pool de cavité thoracique de drainage). Évitez les saignements à travers ce processus.
      1. Plus précisément, commencer l'incision dans la partie inférieurePoint abdominale médiane, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure.
   4. Gigognes les intestins et en dehors de l'animal à la droite de l'expérimentateur, pour exposer la veine porte.
   5. Insérer une aiguille de 30 g, relié à une pompe péristaltique dans le rostre de la veine dans la veine splénique.
   6. Couper la veine cave inférieure au-dessus du diaphragme pour permettre le drainage et la collecte de la solution de perfusion à partir de la cavité thoracique.
   7. Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 3 ml / min et doucement recueillir les 3 premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang de la piscine de la cavité thoracique.
   8. Jeter cette perfusat. Répéter un tel lavage à nouveau si nécessaire, à l'aide d'une solution saline, et ensuite seulement commencer à recueillir perfusat du foie.
   9. Ré-amorcer la perfusion à une vitesse pouvant aller jusqu'à 4 ml / min, et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion à partir de la cavité de la poitrine à l'aideun papillon relié à une seringue.
   10. Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair.
3. leucocytes Extraction
   1. Centrifuger la solution de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
   2. Aspirer le surnageant.
   3. Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant en fonction des objectifs de l' étude, utiliser la préparation comme est, ou effectuer des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité).
      1. Plus précisément, chaque couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large.
      2. Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l'insérer dans un tube de 5 ml.

Résultats

Chez les rats F344, nous avons comparé la cytotoxicité des cellules MH-NK (collectées à partir des sinusoïdes du foie par perfusion du foie forcée) à la cytotoxicité de l'ensemble de la population de cellules du foie suite à un broyage mécanique du tissu hépatique et à la cytotoxicité des leucocytes circulants. Toutes les préparations de cellules ont été lavées au moins 3 fois, de routine dans des essais immunologiques, et en tant que lignées de cellules cibles, nou...

Discussion

La méthode de perfusion du foie présenté ici permet une récolte sélective et à l'étude de la population unique de marginating leucocytes hépatiques. Cellules NK hépatiques, également appelées cellules fosse ^3, constituent une population de cellules NK distinctif qui résident dans les sinusoïdes hépatiques. On les trouve chez les rats, les souris ¹⁷ et chez les humains ^18,19. Par rapport aux cellules périphériques isolées NK, des cellules de puits montré une cytotoxi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26 G
Butterfly needle	OMG		21 G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp