Étude de la fonction de Coronin A dans la réponse Starvation précoce de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Par agrégation Assays

Résumé

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Résumé

Dictyostelium discoideum amibes se trouvent dans le sol, se nourrissant de bactéries. Lorsque les sources de nourriture se font rares, ils sécrètent des facteurs de lancer un programme de développement multicellulaire, au cours de laquelle des cellules individuelles chemotax vers les centres d'agrégation ^1-4. Ce processus dépend de la libération de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) ^5. AMPc est produit dans les vagues grâce à l'action concertée de l' adénylate cyclase et phosphodiestérases, et se lie à la protéine G couplée AMPc récepteurs ^6,7. Un essai largement utilisé pour analyser les mécanismes impliqués dans le cycle de développement de la partie inférieure eucaryote Dictyostelium discoideum est basé sur l'observation de l' agrégation des cellules dans des conditions submergées ^8,9. Ce protocole décrit l'analyse du rôle de coronine A dans le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus immergés dans une solution saline équilibrée (BSS) ^10. Coronin A est un membre de la pr largement conservéefamille otein de coronins qui ont été impliqués dans une grande variété d'activités ^11,12. cellules de Dictyostelium dépourvues Coronin A sont incapables de former des agrégats multicellulaires, ce défaut peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la ¹⁰ cascade AMPc. Les techniques décrites dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines pendant les premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum en amont de la cascade de l' AMPc. Par conséquent, l'utilisation de ce test d'agrégation peut permettre une étude plus approfondie des coronine Une fonction et de faire progresser notre compréhension de la biologie coronine.

Introduction

La famille coronine de protéines est fortement conservée tout au long des eucaryotes. Ces protéines sont caractérisées par la présence d'un tryptophane-aspartate amino-terminale (DEO) répéter contenant la région suivie d'une région unique connecté à un domaine coiled-coil carboxy-terminale ^13,14 (figure 1). Coronins ont été impliqués dans une variété de fonctions cellulaires, y compris la régulation du cytosquelette et la transduction du signal ^12. Chez les mammifères, jusqu'à six molécules courtes coronine (de coronine 1-6), ainsi que d' un «tandem» coronine 7, peuvent être co-exprimées ^12,15. Coronin 1 est membre de la famille le plus étudié, et a été montré pour être impliqué dans la destruction des agents pathogènes, la survie des cellules T et la signalisation neuronale. Comment, exactement, coronine 1 réalise ces activités reste incertaine. Alors que coronine 1 a été montré pour réguler Ca ²⁺ et dépendante de l' AMPc de signalisation, ainsi que F-actine cytosquelette modulation ^16-18, le co potentiel-expression jusqu'à 7 membres de la famille chez les mammifères a fait qu'il est difficile d'étudier la fonction moléculaire coronins dans ces systèmes, en raison de redondances possibles. Contrairement à des organismes mammifères, plus discoideum eucaryote Dictyostelium exprime seulement deux membres de la famille (coronine coronine de A, l'orthologue de mammifères coronine 1 et coronine B, l'orthologue de coronine mammifère 7) avec des fonctions apparemment non redondantes ^15,19,20. Ce fait rend Dictyostelium discoideum un modèle puissant pour étudier la fonction de coronins.

Pour étudier le rôle de coronine A dans Dictyostelium discoideum, nous avons provoqué le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus contenant une solution tampon de sel (BSS) équilibrée en utilisant soit des cellules ou des cellules de type sauvage manquant coronine A ^10. Nous avons constaté que les cellules dépourvues de coronine A ont été incapables de former des agrégats multicellulaires sur la famine. Pour une évaluation quantitative précise de ce phénotype duimagerie des cellules vivantes automatisé décrit dans ce protocole est un outil essentiel. Le défaut de l'initiation de la réponse précoce de famine dans les cellules dépourvues Coronin A peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la cascade AMPc. L'application exogène d'AMPc impulsions pour simuler le début du développement a été utilisé par plusieurs laboratoires dans le passé ^8,9. Toutefois, cette procédure est également connu pour être fortement dépendante de la densité des cellules et la synchronisation. Par conséquent, le protocole décrit ici vise à réduire ces variabilités afin de garantir un degré élevé de reproductibilité. Pris ensemble, les techniques utilisées dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines au cours des premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum et ont le potentiel d'identifier amont ainsi que effecteurs en aval de coronine Une fonction.

Protocole

1. Observez la réponse de famine précoce de Dictyostelium discoideum par microscopie time-lapse.
   1. Cultiver des cellules DH1.10 ou des cellules CORA de dans un erlenmeyer contenant HL-5 moyenne (pour 1 litre: 5 g de protéose - peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g de glucose, 5 g d' extrait de levure, 0,35 g de Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0,35 g de KH ₂ PO _4, 0,05 g de sulfate de dihydrostreptomycine, pH 6,6) à 22 ° C dans un incubateur à agitation avec une rotation de 160 tours par minute. Maintenir les cellules à une densité comprise entre 0,01 x 10 ⁶ cellules / ml et 2 x 10 ⁶ cellules / ml.
   2. Examiner l' agrégation cellulaire, par récolte phase logarithmique croissance des cellules DH1.10 ²¹ ou les cellules CORA ¹⁰ généré en arrière - plan DH1.10, cultivés en secouant la culture avec HL-5 moyenne à 22 ° C. Pour ce faire, prendre quantité appropriée de cellules (généralement entre 10 et 50 ml), centrifuger 3 min à 400 g et laver les cellules deux fois dans BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 2,5 mM de _CaCl2, pH 6,5).
   3. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Par la suite, les cellules de la plaque à une densité de (5, 10, 20 ou 40) x 10 ⁴ cellules / cm ² dans une plaque à 24 puits. Permettez-leur d'adhérer pendant 1 heure à 22 ° C dans le BSS.
   4. Visualisez l' agrégation par microscopie time-lapse comme décrit précédemment ^10, en prenant des images toutes les 135 secondes. en utilisant une imagerie de cellules vivantes mis en place équipée objectif 5X et une caméra à dispositif à couplage de charge électronique multipliant automatisé par le logiciel approprié (voir tableau des matériaux).
2. AMPc pulsation des cellules Dictyostelium discoideum pendant la famine.
   1. Examiner l'effet des impulsions d'AMPc appliquées de l' extérieur sur le développement des cellules DH1.10 ²¹ ou les cellules de DH1.10 CORA ^10, en récoltant les cellules. Pour ce faire, prendre quantité appropriée de cellules (habituellement entre 10 et 50 ml), centrifuger 3 min à 400 g et laver deux fois dans le BSS.
   2. Count des cellules en utilisant un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules à une densité de 1 x 10 ⁷ cellules / ml dans du BSS. Agiter les cultures (160 rpm) à 22 ° C pendant 2 heures avant d'appliquer des impulsions. Ajouter des impulsions AMPc en utilisant une minuterie contrôlée pompe péristaltique. Programmer la pompe pour délivrer une impulsion de 5 secondes à chaque 6,5 min de 15 pi de 50 nM AMPc (concentration finale) sur une période de 5 heures.
   3. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Par la suite, la plaque les cellules à une densité de (5, 10, 20, ou 40) x 10 ⁴ cellules / cm ² dans une plaque de 24 puits. Laisser adhérer pendant 1 h dans BSS.
   4. Visualisez l'agrégation après 16 heures à 22 ° C par microscopie à champ lumineux en utilisant un objectif 5X.
3. Induction du développement Dictyostelium discoideum par l' exposition à un milieu conditionné.
   1. Préparer un milieu conditionné frais comme décrit ^22. Recueillir les cellules DH1.10 en phase logarithmique ²¹ ou les cellules de DH1.10 CORA ^10, de secouer culteUres avec HL-5 moyenne à 22 ° C à l' aide d' une pipette, centrifugeuse pendant 3 min à 400 xg et laver les cellules à trois reprises en PBM (0,02 M de phosphate de potassium, 10 uM de _CaCl2 et 1 mM _MgCl2, pH 6,1).
   2. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre, resuspendre ceux - ci dans PBM à une densité de 1 x 10 ⁷ cellules / ml et agiter pendant 20 heures à 110 rpm / 22 ° C.
   3. Collecter milieu conditionné après centrifugation à 400 g pendant 3 min et clarifier par centrifugation à 8000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
   4. Filtre milieu conditionné à travers un filtre de 0,45 um (voir le tableau des matériaux) et diluer triple PBM.
   5. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque à une densité de (5, 10, 20 ou 40) x 10 ⁴ cellules / cm ² dans une plaque à 24 puits. Permettez-leur d'adhérer pendant 1 heure à 22 ° C.
   6. Échange surnageant des cellules avec le milieu conditionné préalablement préparé.
   7. Visualisez l'agrégation d'unprès avoir 16 heures par microscopie à champ lumineux en utilisant un objectif 5X.

Résultats

Les cellules déficientes en coronine Un spectacle d' un défaut dans le développement précoce (figure 2). En l'absence de Coronin A cellules sont incapables de former des agrégats multicellulaires, qui est l'étape initiale au cours du cycle de développement de Dictyostelium discoideum. Par conséquent, un coronine semble jouer un rôle dans la réponse de famine au début et / ou de signalisation de l'AMPc. En effet, l'absence de format...

Discussion

Les protéines Coronin se trouvent dans la plupart des taxons de clade eucaryote. Dictyostelium discoideum coronine A, l'homologue de coronine mammifère 1, est impliquée dans la réponse de famine précoce, étant donné que Coronin A déficientes cellules ne sont pas capables de former des centres d'agrégation au cours du développement précoce cycle de ^10. Pour être en mesure d'évaluer quantitativement et avec précision le retard dans le développement entre les souches, un micro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron