Intra-iliaque Artère injection pour la modélisation efficace et sélective des métastases osseuses Microscopique

Résumé

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Résumé

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Introduction

Métastases représentent plus de 90% des décès causés par des tumeurs solides. L'os est l'organe le plus commun affecté par des métastases de divers types de cancer, notamment les cancers du sein et de la prostate. Lorsqu'elle est diagnostiquée dans la clinique, les métastases osseuses habituellement sont déjà entrés dans les stades avancés avec soit ostéolytiques ou ostéoblastiques altérations osseuses, souvent accompagnées de symptômes neurologiques.

Des études antérieures principalement axées sur les manifestes des métastases osseuses ostéolytiques ^1-3, mais nous avons actuellement compréhension des micrométastases dans les os limité avant le début du processus d'ostéolyse. Ceci est au moins en partie à cause du manque de modèles et approches expérimentales appropriées. Des modèles de souris transgéniques de cancer du sein métastasent souvent aux poumons, mais beaucoup moins efficacement aux os ^4. De même, les tumeurs orthotopiquement transplantées développent rarement des métastases osseuses spontanées, avec une certaine 4T1 carcinom mammaire d'os-tropicalun sous-clones et MSP surexprimés modèle de souris transgénique PyMT comme des exceptions ^5-7. Perçage intra-tibial peut fournir les cellules cancéreuses à l'os ^8-10, mais il encourt également des dommages et de l' inflammation dans les tissus locaux. Actuellement injection intra-cardiaque de lignées de cellules de cancer du sein a été la principale approche pour étudier la colonisation osseuse ^11-13. Cependant, après que les cellules cancéreuses sont introduits dans le ventricule gauche seulement une proportion limitée sera finalement atteindre l'os et la moelle osseuse, ce qui rend difficile le suivi des métastases microscopiques d'une manière quantifiable.

Dans cette étude, nous établissons une technique, à savoir l' artère intra-iliaque (IIA) injection ^14, pour délivrer sélectivement les cellules cancéreuses dans les tissus des membres postérieurs, enrichissant ainsi les cellules cancéreuses dans les os et la moelle osseuse sans causer de dommages aux tissus locaux. En raison de la spécificité de l'os, cette approche permet également de suffisamment de temps pour les cellules cancéreuses indolents pour coloniser finalement avant unimals succombent à des tumeurs primaires ou de métastases dans d'autres organes vitaux. Lorsqu'il est combiné avec une variété d'autres techniques, telles que l'imagerie par bioluminescence, immunofluorescence et histomorphométrie osseuse, l'injection IIA est potentiellement utile pour un large éventail d'objectifs de recherche liés à des métastases osseuses, en particulier pour suivre la progression des cellules cancéreuses individuelles à multi-cellulaire micrométastases. En particulier, nous avons démontré que l'injection II nous permet de visualiser les interactions entre les cellules cancéreuses et les différents types de cellules dans le microenvironnement entourant l'os.

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Protocole

Tous les travaux de l'animal a été fait conformément aux directives de protection des animaux du Baylor College of Medicine.

1. Préparation des cellules

Remarque: Les différentes lignées de cellules cancéreuses peuvent être utilisés pour l'injection en fonction AII fins de recherche. Nous avons utilisé des lignées de cellules de cancer du sein MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 et la lignée cellulaire de cancer de la prostate C4-2 dans notre recherche. Nous utilisons généralement à la fois GFP et luciole cellules cancéreuses luciférase marqué pour notre étude et nous montrons quelques données ici à partir de la lignée cellulaire MCF7 GFP-luciférase marqué.

1. Maintenir les cellules dans du DMEM contenant 10% de FBS et 0,1 mg / ml de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans 5% de _CO2.
2. Avant injection IIA, trypsiniser cellules à 80 - 90% de confluence avec 0,25% de solution / EDTA trypsine. Utilisez PBS froide pour laver les cellules deux fois, et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS pour le comptage des cellules. Pour supprimer PBS, les cellules de centrifugation à 800 g pendant 5 min.
3. cellules Re-suspendreà une concentration de 5 x 10 ⁶ cellules / ml dans du PBS glacé.
4. Utilisez 100 GFP pi et les cellules cancéreuses luciole luciférase marqué pour l'injection IIA d'une souris.
   Remarque:. Par conséquent, le nombre de cellules reçues par chaque animal est de 5 x 10 ⁵ Ce nombre peut être nécessaire de modifier en fonction de l'agressivité des lignées cellulaires.
5. Gardez des suspensions de cellules sur la glace.
   Note: Les vibrations peuvent être nécessaires pour empêcher l'agrégation des cellules toutes les quelques minutes jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'injection. Pour certaines lignées de cellules (comme MDA-MB-231), des procédures plus strictes (par exemple, en passant par 45 um tamis cellulaire) peuvent être nécessaires pour empêcher l' agrégation. S'il vous plaît noter que le sabot des navires peut provoquer une nécrose des tissus, et donc confondre les expériences.

2. Préparation des animaux

1. Pour la gestion de la douleur animale, donner 5 mg / kg / jour carprofène (ou un autre analgésique) avec supplément alimentaire pour les souris pas moins de 24 heures avant la chirurgie. Administrerune dose de 0,1 mg / ml de buprénorphine sous-cutanée 60 minutes avant l'intervention chirurgicale. Remarque: une procédure facultative consiste à implanter estradiol palette dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer le grossissement des cellules ER + cancer (par exemple, cellules MCF-7) ^9.
2. Anesthésier a 4 - souris âgées de 6 semaines (environ 20 g) avec de la kétamine (80 - 100 mg / kg) et de xylazine (10 -12,5 mg / ml) par injection intrapéritonéale.
3. Confirmer le niveau approprié de la sédation d'une souris de 20 g par pincement de l' orteil et l'observation d'une réduction de 50% de la fréquence respiratoire et rose des muqueuses (par exemple, la peau de l' oreille de la souris et de la peau de la patte). Gardez le contrôle de ces signes vitaux toutes les 15 min pendant la chirurgie. Remarque: Aucun mouvement de l'animal indique que l'animal est suffisamment anesthésié et prêt pour la chirurgie.
4. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Rasez la souris sur le bas-ventre, en particulier la région de l'aine droite où la chirurgie et l'injection seraprend place.
   Note: Ceci est pas nécessaire si la souris nude athymiques sont utilisés.
6. Placez la souris sur le dos, les jambes se propager dans leurs positions naturelles et de coller les orteils au carton de dissection mobile avec du ruban adhésif.
7. Essuyez la région de l'aine droite avec 70% d'éthanol isopropylique imbibés des cotons-tiges stériles, puis avec de la bétadine récurer chirurgicale plusieurs fois.

3. La Veine iliaque commune et Artère Lieu et séparation

1. Faire une incision de la peau de 1,0 - 1,2 cm de long entre le 4 ^e et 5 ^e mamelons dans l'abdomen inférieur droit, en utilisant # 10 carbone lames de scalpels en acier stériles maintenues dans une poignée n ° 3. Ensuite, utilisez un drap chirurgical stérile pour couvrir le corps de l'animal à l'exception du site d'incision.
2. Déplacer l'animal à banc norme top dissection microscope. Utilisez un grossissement de 4X pour injection.
3. 4X sous grossissement du microscope à dissection, insérer une pince de séparation entre émoussées le tissu adipeux et le peritoneum, et pousser les tissus vers l' extérieur sur les deux côtés pour exposer les vaisseaux iliaques et des nerfs (voir Figure 1).
   Remarque: L'artère entre l'aorte de la ligne médiane et la partie inférieure des branches de l'artère est appelée artère iliaque commune. Ceci est le lieu de l'injection.
4. Utilisez une paire de pinces fines droites pour briser le tissu conjonctif (comme une membrane) entre les navires et le nerf, plus près des vaisseaux.
5. Mettez les pinces fines droites à la main gauche. Prenez une paire de pinces fines à angle en utilisant la main droite. Insérez la pince de la main droite en même position où les tissus conjonctifs ont été brisées. Et puis coller la pince de la main droite à travers, sous les navires.
6. Dans le même temps, insérez la pince de la main gauche dans les tissus conjonctifs sur le côté gauche des vaisseaux pour guider la pince de la main droite en passant par.
7. Une fois que la pince de la main droite obtient sous les vaisseaux, essayer de séparer les vaisseaux de la ti environnantessu un peu plus, puis les garder au-dessus de la pince de la main droite.
8. Utilisez une pince de la main gauche pour délivrer la pointe d'une suture 4-0 en soie à la pince de la main droite, puis tirez la suture doucement et lentement à travers sous les vaisseaux. Note: Maintenant , les deux navires de la veine et l' artère communes sont soulevées par la suture (voir la figure 2).

4. Injection et post-injection de soins

1. Préparer les cellules pour l'injection dans un 31 G seringue à insuline. Utiliser 100 ul de suspension cellulaire dans du PBS par injection. Assurez-vous de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour séparer les cellules et éviter l'agrégation de telle sorte que les cellules injectées ne seront pas obstruer et bloquer le flux sanguin.
2. Avec la pince à angle dans la main gauche, placez la pince sous les navires le long de la direction de la suture, puis ouvrez les deux bras de la pince, ayant les navires détenus doucement sur la pince.
   Remarque: L'intervalle entre les deux branches de la pince sera l'iSite njection.
3. Tenez le G aiguille 31 avec 100 suspensions cellulaires ul dans la main droite, avec le biseau de l'aiguille vers le haut, prêt pour l'injection.
4. Insérez l'aiguille dans la lumière de l'artère (sang entrera dans la pointe de l'aiguille). Poussez ensuite la suspension cellulaire lentement pour injecter les cellules. La suspension cellulaire va repousser le sang rouge dans le récipient. Essayez de ne pas briser les vaisseaux ou d'une fuite de la suspension cellulaire sur.
5. Lorsque l'injection est terminée, tirez doucement l'aiguille et maintenez les vaisseaux sur la pince de la main gauche pour arrêter le saignement. Puis arracher la suture.
6. Retirez les pinces de la main gauche, et d'utiliser rapidement un coton-tige pour presser la zone d'incision de l'artère pour arrêter le saignement.
   Remarque: En général, 5-10 min pression continue est suffisante pour arrêter le saignement.
7. Lorsque le saignement arrête, utiliser la colle de peau pour fermer les bords de la peau de la zone de la chirurgie. Faire une marque auriculaire, et vérifier la signalisation pour examiner la répartition des cellules injectées bioluminescence.
   Note: Une injection réussie se traduira par une image similaire à la figure 3.
   1. Vérifiez la signalisation bioluminescence par injection de 100 pi de 15 mg / ml de luciférine dans du PBS à 75 mg / concentration kg souris via le sinus intra-orbitaire.
      1. Pour l'injection intra-orbitaire, mettre les doigts des deux côtés de l'oeil de la souris, utiliser la pression pour faire boule d'oeil légèrement pop hors du cadre de l'oeil, insérez 28 G aiguilles insuline de seringues entre boule d'oeil et le nez, puis pousser lentement seringue pour injecter luciférine .
         Remarque: À la bonne position, l'aiguille doit être en mesure d'atteindre une profondeur de 2 - 3 mm avant de frapper les tissus durs (os).
      2. Placer la souris dans le système d'imagerie pour l'imagerie in vivo de l' animal entier pendant 10-60 secondes à 5 min (voir la figure 3).
         Note: Une procédure facultative est d'implanter estradiol pellet dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer la croissance des cellules ER + cancer (par exemple, MCF-7cellules) ^15.
8. Laissez la souris sur un coussin chauffant au chaud jusqu'à ce qu'il se réveille. Surveiller le saignement, un gonflement, des signes de déhiscence et de la douleur au cours de la période post-chirurgicale. Mettez les souris dos à la cage avec une couverture analgésique (complément alimentaire carprofin suggéré) donnée pour la gestion de la douleur jusqu'à ce que aucun signe de douleur. Portez une attention particulière et des soins aux animaux pendant 7 jours après la chirurgie.

5. Suivi de croissance métastatique

1. histomorphométrie:
   1. Récolte portant une tumeur des tissus osseux, fixer les os dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, puis décalcifier les pH 7,0 solution d'EDTA 14% pour les 3 - 5 jours et les soumettre à l' inclusion en paraffine comme décrit précédemment ^14.
   2. Section Les tissus osseux paraffine intégrer à l'épaisseur de 3 um et effectuer la méthode histologique standard d'hématoxyline / éosine comme décrit précédemment ^14.
2. ImmunohistochemisEssai:
   1. Objet portant une tumeur osseuse dans la paraffine coulisse pour coloration immunohistochimique à diverses fins ¹⁴ comme décrit précédemment. En bref, MCF7 immunocoloration des cellules cancéreuses par des anticorps anti-GFP et les cellules ostéogéniques immunocoloration (pré-ostéoblastes et les ostéoblastes) par les anticorps anti-Osterix et l'anti-phosphatase alcaline (ALP) des anticorps, respectivement.

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Résultats

La figure 1 illustre la localisation anatomique et la relation de l' artère iliaque commune (rouge) et la veine (bleu).

La figure 2 montre la position relative des vaisseaux iliaques et les nerfs en microscopie de dissection. Comme le montre la figure 2A, les vaisseaux et les nerfs sont juste en dessous de la paroi péritonéale et peuvent être révélées après l'i...

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Discussion

Bien que l'artère iliaque est la cible d'injection pour les cellules cancéreuses, nous recommandons la séparation des deux veine iliaque et l'artère à partir de tissus environnants, et les élevons ensemble comme un paquet. En effet, la veine et l'artère contacter intensivement les uns avec les autres, et la paroi du vaisseau veineux est mince et est facile à briser. Par conséquent, pour une injection réussie, il fait gagner du temps et des efforts pour maintenir les deux navires ensemble, bien ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28 G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552