Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Résumé

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Résumé

Épithéliale de transition mésenchymateuses (EMT) décrit le processus de l'épithélium transdifferentiating en mésenchyme. EMT est un processus fondamental au cours du développement embryonnaire qui se produit également souvent dans le glioblastome, la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne. EMT a également été observé dans de nombreux cancers, y compris en dehors du cerveau cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer du côlon, le cancer gastrique. EMT est lié au centre de malignité en favorisant la migration, l'invasion et la formation de métastases. Les mécanismes de EMT induction ne sont pas pleinement compris. Nous décrivons ici un système in vitro pour isoler des cellules corticales normalisé souches neurales (NSC) et l' induction subséquente EMT. Ce système offre la possibilité d'utiliser soit des cellules simples ou explant. Dans ce système, un rat ou la souris NNC prosencéphale embryonnaires sont mises en culture dans un milieu défini, dépourvu de sérum et les enzymes. Les NSCs exprimés Olig2 et Sox10, deux facteurs de transcription observée dans oligodendrocles cellules précurseurs yte (OPC). En utilisant ce système, les interactions entre les FGF, TGF et BMP signalisation impliquant ZEB1, ZEB2 et Twist2 ont été observées lorsque la TGFß activation améliorée de manière significative la migration des cellules, ce qui suggère une BMP / TGF-interaction synergique. Les résultats indiquent un réseau de FGF, BMP et TGF-signalisation d'être impliqués dans EMT induction et l'entretien. Ce système de modèle est utile pour étudier EMT in vitro. Il est rentable et présente une forte reproductibilité. Il permet également la comparaison des différents composés par rapport à leurs réponses de migration (de mesure de distance quantitative), et le criblage à haut débit de composés à inhiber ou amplifier EMT (mesure qualitative). Le modèle est donc bien adapté pour tester les bibliothèques de médicaments pour les substances affectant EMT.

Introduction

Pendant plusieurs stades du développement embryonnaire, les cellules épithéliales perdent leur forte adhérence à l'autre (par exemple, les jonctions serrées) et d' acquérir un phénotype migratoire dans un processus appelé transition épithélio mésenchymateuse (EMT) ^1. EMT est requis pour la formation d' autres types de cellules, telles que les cellules de la crête neurale mésenchymateuses, une population qui se sépare de la neuroepithelium ^2. EMT est essentielle non seulement au cours des stades embryonnaires , mais aussi nécessaire à des étapes ultérieures de la vie adulte pour maintenir les processus physiologiques dans l'organisme adulte, comme la cicatrisation ³ et le système nerveux central (SNC) dans la régénération des lésions démyélinisantes ^4.

Les tumeurs épithéliales sont connus pour réactiver EMT comme une étape d'initiation pour la migration, l' invasion et les métastases, conduisant finalement à la progression du cancer ^1,3. EMT est en effet lié au centre de la forte ^1,3 de migration. Les étapes cellulaires de conditioning, initier, subissant et maintenir EMT ne sont pas pleinement compris et ont besoin d'une enquête plus approfondie.

Ici, un système in vitro de modèle normalisé basé sur EMT NNC, des facteurs de croissance définis et des milieux (sans sérum et sans l' utilisation de l' enzyme) est présentée. Ce système modèle est pertinent pour les scientifiques travaillant sur EMT. Les escargots, Zeb et Twist familles de protéines se sont avérés être critique pour EMT tant dans le développement et la maladie ^1. Les escargots, Zeb et Twist familles sont également impliqués dans le système présenté. Le système est basé sur une région spécifique du cerveau antérieur qui, normalement, ne subit pas de EMT fournir un avantage particulier pour l'étude des premiers événements au cours EMT induction.

Le système de modèle pourrait être appliquée à l'étude EMT dans les épithéliums en dehors du système nerveux central, depuis inducteurs EMT clés, tels que l'escargot, Zeb et les protéines Twist, sont également présents au cours EMT dans les systèmes de tissus en dehors du système nerveux central. Ce modèle système permet l'isolement normalisé de NNC du cortex en développement pour étudier les caractéristiques de cellules souches en général et EMT en particulier. Grâce à ce système, nous avons isolé NSCs, EMT induite et étudié la migration ultérieure sous l'effet de FGF2 et BMP4. Nous avons observé que interagit FGF et BMP-signalisation avec TGF-signalisation pour promouvoir la migration cellulaire, validant ainsi le système modèle.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont suivi le «Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire» (publication NIH, 8 ^e édition, 2011) et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de Bâle (Directives suisses pour le soin et l' utilisation des animaux). Par ces lignes directrices du protocole animal est considéré comme de la «qualité de la gravité de l'animal le plus bas».

1. Préparation de l'Expansion Medium

Remarque: Le travail dans des conditions aseptiques en tant que norme pour la culture de tissus.

1. Prenez deux tubes de 15 ml et ajouter 5 ml de L-glutamine libre-DMEM / F12 (1: 1) à partir d'un 500 ml de milieu bouteille dans chacun des deux tubes de 15 ml. Pour le premier tube de 15 ml, ajouter 50 mg apo-transferrine humaine, 50 pl de putrescine 1 M stock (0,1 mM de concentration finale) et 30 pi de sélénium de sodium 500 uM stock (concentration finale 30 nM).
   1. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans le flacon DMEM / F12 initiale.
2. Le deuxième tube de 15 ml, on ajoute 12,5 mg d'insuline. Ajouter6 - 9 gouttes de 1 M de NaOH. Tourbillonnement pour dissoudre complètement l'insuline. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans le flacon DMEM / F12 initiale.
   Remarque: NaOH est toxique et corrosif. Utilisez des gants de protection, manteau, et des lunettes de sécurité.
3. Ajouter 5 ml de pénicilline (10000 unités / ml) / streptomycine (10 000 pg / ml) / amphotéricine B (25 ug / ml) à la / F12 bouteille DMEM.
4. Ajouter 5 ml de 200 mM de L-glutamine mère fraîchement décongelés ou oligopeptides contenant glutamine (200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide) au / F12 bouteille DMEM.
5. Bien agiter. Préparer 50 ml aliquotes.
   Remarque: moyen d'extension peut être stocké pendant au moins 2 semaines à 4 ° C. tubes aliquoté montrent des changements de pH moins par rapport à moyen maintenu en bouteilles de 500 ml.

2. Préparation de repiquage Medium

1. Pour 1 L Ca ^{2 +} - et Mg ^{2 +} -free HBSS médias, ajouter 990,85 mg de glucose (5 concentration finale mM) et 840,10 mg de NaHCO ₃ (10 mM de concentration finale). Ajuster le pH à 7,3 avec HCl (1 M stock). Stériliser par filtration avec filtre de 0,2 um et de faire 50 ml aliquotes.
   Note: moyenne repiquage peut être stocké pendant au moins 4 semaines à 4 ° C.

3. Préparation des facteurs de croissance

1. PBS 1x stérile préparer avec 1% de BSA (PBS-BSA) seul ou avec de l'acide chlorhydrique (HCl) à 4 mM (PBS-BSA-HCl).
   Attention: HCl est corrosif et toxique et nécessite des mesures spéciales de sécurité (manteaux, lunettes, gants, hotte).
2. Dissoudre 10 pg / ml humain de croissance des fibroblastes recombinants du facteur 2 (rhFGF2) dans du PBS-BSA (10 ng / ml de concentration finale), 10 pg / ml humain de la protéine morphogénétique osseuse recombinante 4 (rhBMP4) dans du PBS-BSA (10 ng / ml final concentration), et 20 pg / ml de facteur humain recombinant de croissance transformant ß 1 (rhTGFβ1) dans du PBS-BSA-HCl (40 ng / ml de concentration finale).
   1. Ne pas filtrer stériliser. Préparer des aliquotes.
      Remarque: Des aliquotes de facteur de croissance peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 2 ans.

4. Revêtement de cellulaires Vaisselle Culture

1. Dissoudre 1,875 mg Poly-L-ornithine (OLP) dans 500 ml d' eau distillée H ₂ O pour préparer une OLP stocks 250x. Stériliser par filtration en utilisant un filtre à seringue de 0,2 um et faire 2 ml aliquotes.
   Note: Ces aliquotes peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins 2 ans.
2. Dissoudre 1 mg de fibronectine bovine dans 1 ml de H stérile distillée ₂ O pour préparer 1,000x fibronectine stock. Ne pas vortexer car cela peut coaguler la protéine collante. Agiter doucement à la main pendant 10 min.
   1. Incuber pendant 1 heure à température ambiante avec agitation occasionnelle par secousses. Vérifiez la dissolution complète. Chauffer la solution à moins de 37 ° C pour la dissolution complète de la fibronectine. Ne pas filtrer stériliser.
      Remarque: La solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
3. Utiliser des boîtes de culture en plastique cellulaire plasmatique prétraitée (100 mm ou d'autres dimensions comme requis pourl'expérience). Pour évaluer la migration, utilisez 35 mm plats avec grille de 500 um. Laisser incuber pendant une nuit avec des plats 2 ml 1x OLP pendant 12 heures à 37 ° C dans un CO ₂ culture tissulaire incubateur à 5%. Laver deux fois avec 2 ml 1x PBS.
4. Ajouter 2 ml 1x fibronectine (1 pg / ml de concentration finale) et on incube la vaisselle pendant un minimum de 12 heures à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%. Retirer fibronectine juste avant le plaquage des cellules.
   Remarque: Les plats fibronectine revêtus peuvent être conservés pendant au moins 2 semaines à 37 ° C.

5. normalisé Dissection et préparation de la zone corticale-ventriculaire (SVZ)

1. Obtenir rat jour embryonnaire 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) et E13.5 de la souris (C57BL / 6) des embryons par minuté-accouplement. Maté animaux de 18h00 à 08h00 le lendemain matin. Noon après le jour de l'accouplement est considéré comme E0.5.
2. Anesthésier l'animal gravide avec 5% d'isoflurane et le débit d'oxygène de 0,8 L / min. Vérifier la réponse par la compression de la patte avec diss forteforceps exion. Décapitez l'animal. Évitez CO ₂ asphyxie CO ₂ affecte la tige la récupération des cellules.
3. Récupérer des embryons par césarienne.
   1. Placez l'animal en position couchée et désinfecter la fourrure avec 70% d'éthanol. Utilisez des pinces et des ciseaux chirurgicaux pour faire en forme de V-incision cutanée d'environ 8 cm dans le bas ventre au-dessus de l'utérus. Inciser seulement la peau avec de la fourrure tout en gardant intacte parois musculaires.
   2. Utilisez une pince frais et des ciseaux pour inciser les muscles et la paroi musculaire abdominale pour entrer dans le péritoine.
   3. Identifier l'utérus dans le péritoine postérieur inférieur. Retirer l'utérus par une séparation nette des tissus environnants.
   4. Laver l'utérus avec des embryons avec stérile 1x PBS et les placer dans la glace froide 1x PBS.
   5. Utilisez des ciseaux à pointe fine pour ouvrir les parois de l' utérus pour libérer l' embryon par l' embryon au microscope de dissection (3X grossissement, figure 1B). Utilisez une paire de pinces pour enlever les coques embryonnaires ( Figure 1B). Garder les embryons dans un milieu d'expansion sur la glace.
   6. Vérifiez le stade de développement correct par l'Atlas du développement du système nerveux Rat ^5. La taille de l' embryon correct est illustré à la figure 1B.
   7. Vérifiez âge exact en outre par la présence de commencer la formation de chiffres dans le forelimb de rat (FL) comme illustré sur la figure 1A.
      Remarque: Le membre postérieur (HL) ne montre pas encore la séparation de chiffres (figure 1B).
4. Pour la dissection, le transfert d'embryons à des plats non revêtus de Pétri remplis de glace-froid 1x PBS. Effectuer la dissection sous un microscope de dissection stéréo (3X à 20X grossissement) en utilisant une pince fine autoclavés.
   Remarque: Les boîtes de Petri empêchent la fixation du tissu à la surface de la boîte comme cela peut arriver avec des plats de culture de cellules plasmatiques enrobées. aiguilles de fil de tungstène aiguisés ou similaires sont également utiles pour certaines étapes de dissection.
5. Retirez la peau de la tête et du crâne à partir de l'intersection du télencéphale développement (TEL) et diencéphale (DI) (figure 1B) en tirant simultanément avant et en arrière avec deux pinces afin d'accéder au tube de neurones en développement (Figure 1C).
6. Identifier le-hindbrain-frontière mésencéphale (MHB, noir tête de flèche sur la figure 1B-D), séparant le mésencéphale (MES) à partir du rhombencéphale. Couper le rhombencephalon juste au ou en dessous du MHB (figure 1D, flèche triangulaire).
   Remarque: L'espace sous-cutané supplémentaire au MHB facilite l'enlèvement de la peau sans nuire au tube neural.
7. Sever la connexion entre le télencéphale / diencéphale à la base du crâne avec le squelette du visage (figure 1E). Il en résulte un bloc contenant le télencéphale, diencéphale et le mésencéphale (TEL-di-MES) (figures 1F-H).
8. Transférez le bloc TEL-DI-MES dans le milieu de l'expansion sur la glace. Keep it Completsely recouvert de milieu d'expansion dans une boîte de Petri non revêtue. Tenez le bloc au mésencéphale avec une paire de pinces pour éviter de toucher le télencéphale qui contient le SVZ corticale avec NNC.
9. Répéter les étapes 05/05 à 05/08 avec tous les embryons (figure 1F-H).
10. Transfert d'un TEL-DI-MES bloc dans la glace fraîche et froide 1x PBS. Coupez le long de la ligne en pointillé dans le mésencéphale antérieur (figure 1F-H), séparant le mésencéphale du diencéphale, comme le montre la figure 1I.
11. Séparez le DI du TEL en coupant le long des lignes en pointillés sur la figure 1F. Voir télencéphale isolé sur la figure 1J.
12. Diviser les deux hémisphères télencéphaliques, coupe le long de la ligne en pointillés sur la figure 1J. Il en résulte deux hémisphères séparés comme cela est illustré sur la figure 1K.
    Remarque: L'hémisphère gauche est amplifié dans la figure 1L.
13. Identifier la bande médianeéminences Lionic (MGE, Figure 2A; *) et éminences ganglionnaires latérales (LGE, Figure 2A; +) visible à travers l'avenir interventriculare foramen.
    1. En utilisant des pinces ou aiguille, disséquer le long d' une ligne droite à l'intersection entre la MGE et LGE et le cortex antérieur (ant-ctx, figure 2B). Couper une ligne droite à travers le cortex, l'hippocampe (hanche) et le plexus choroïde (CP). Ceci sépare le cortex antérieur dont le bulbe olfactif (OB) à partir des éminences ganglionnaires (GE, les figures 2B, C).
14. Couper une seconde ligne droite à l'intersection de l'éminence ganglionnaire caudale (EGC, figure 2C, D) et le cortex postérieur (figure 2C), la coupe à nouveau à travers le cortex, l' hippocampe et le plexus choroïde.
15. Aplatir le télencéphale. Retirez complètement le pôle postérieur et le bulbe olfactif (figure 2D). Identifierl'ourlet contenant du cortex et de l'hippocampe du plexus choroïde (figure 2C), tel que défini précédemment ^6,7.
    Remarque: L'hippocampe a une neuroepithelium plus mince que le cortex. Le CP contient des vaisseaux rouges.
    1. Séparer l'ourlet corticale du cortex, ce qui laisse la taille du cortex identique à la taille des éminences ganglionnaires (figure 2D). Il en résulte un bloc du cortex (le tissu cible) et les éminences ganglionnaires (GE, la figure 2D).
16. Retournez le bloc cortex-GE avec le ventricule latéral (interne) à la surface de la boîte.
    Remarque: La surface extérieure de l'hémisphère fera face à l'expérimentateur (figure 2E). Sur la surface extérieure sont les meninges contenant des vaisseaux de sang (figure 2E).
    1. Pin le GE à la surface du plat de la main gauche et éplucher les méninges avec une paire de pinces à la main droite (dominante) (Figure 2F ).
       Note: Ceci est l'étape techniquement plus exigeants parce que les meninges adhèrent fortement au cortex. La séparation des méninges du cortex est facilitée par la coupe une ligne complètement droite (non dentelée) dans les étapes 5.13.1 et 5.14.
17. Répétez les étapes à 5.16 pour 5.12 l'autre hémisphère et tous les embryons. Couper le cortex le long de la LGE dans une distance de la moitié du diamètre principal de la LGE (figure 2G, 2H). Le cortex disséqués couvre une superficie de 1,2 mm x 2,4 mm (figure 2H) et inclut la / couche germinale SVZ avec les NNC.

6. Préparation des cultures d'explants

1. Couper le cortex dans des explants de moins de 400 um de diamètre (figure 2I). Utilisez une grille de 400 um (figure supplémentaire 1) placé au- dessous de la dissection boîte de Pétri pour référence (Figure 2H et 2I). Transférer tous les explants dans une boîte de Pétri frais avec de la glace-comilieu d'expansion ld.
2. Retirez la fibronectine à partir d'une boîte de culture tissulaire (étape 4.4). Laisser sécher. Ajouter 1 ml de milieu d'expansion à froid au centre de la coupelle 35 mm avec grille de dimension de 10 mm x 10 mm (figure 3). Laisser le milieu pour former une goutte sphérique (Figure 3).
3. Insérer jusqu'à 8 explants par rapport au centre de la goutte. Les explants doivent être idéalement situés sur la grille avec au moins 3 mm de distance entre l'autre pour l'analyse de la migration (voir la section 8).
4. Laisser incuber le plat pendant environ 1 h dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 21% de O _2, 5% de CO ₂₎ pour la fixation des explants. Autoriser les explants à établir et à attacher à la surface de fibronectine. Ne pas secouer le plat, car les explants peuvent se détacher et se déplacer en dehors du centre de la grille optimale.
5. Après 1 heure d' incubation (37 ° C, 21% O _2, 5% de CO _2), remplir le plat à un volume total de 2 ml de milieu d'expansion plus la croissance facteurs ou de substances d'intérêt pour tester et incuber.
   Note: Ni la digestion enzymatique, ni sérum ou centrifugation sont nécessaires pour la préparation des explants. Ceci est optimal pour l'intégrité cellulaire.

7. Préparation du NSC unique Culture cellulaire

1. Réchauffez expansion et moyenne repiquage à 37 ° C.
2. Transférer les morceaux de cortex disséqués (étape 5.17) dans un tube de 15 ml avec un milieu d'expansion à froid (tube A). Centrifuger les morceaux de cortex pendant 5 min à 1200 x g. Aspirer le surnageant. Ajouter 200 ul de milieu d'expansion préchauffée à la remise en suspension des morceaux de cortex.
3. Ajouter 700 pi de milieu préchauffé repiquage au tube de 15 ml avec une pointe de P1,000 (tube A). Resuspendre doucement le culot. Placer la pointe à la partie inférieure du tube de 15 ml. Doucement et lentement dissocier les morceaux de tissu par aspiration à trois reprises avec la pointe de P1,000.
   Remarque: Le repiquage milieu favorise la séparation des cellules et il est nécessaire d'éviter l'utilisation d'enzymes.
4. Laisser le tube reposer pendant 30 à 60 secondes pour les plus grandes (plus lourds) pièces non dissociées pour régler au fond. Les cellules individuelles dissociées resteront dans le surnageant. Transférer environ 700 ul du surnageant dans un tube de 15 ml frais (tube B).
5. Répétez les étapes 7.3 et 7.4 de dissocier les gros morceaux.
6. Répétez les étapes 7.3 et 7.4 une deuxième fois pour dissocier les gros morceaux. Transférer la totalité surnageant dans le tube de 15 ml frais (tube B).
7. Ajouter au milieu d'expansion à un volume total de 5 ml. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Évaluer les cellules mortes par coloration au bleu trypan.
   Remarque: Les petits NSCs tolèrent les étapes 7.2 à 7.6 mieux que des cellules plus grandes. A partir de 10 embryons attendre environ 4 x 10 ⁶ cellules avec 10% de cellules mortes.
8. Pour l' extension de NNC, une plaque de 1,5 x 10 ⁶ cellules par boîte de 10 cm de culture tissulaire revêtus de fibronectine dans un volume de 8 ml de milieu d'expansion. Pour l'extension standard, ajouter 8 pi de 1,000x rhFGF2 stock. Ajouter 8 pi rhFGF2 chaque jour et me changerdia tous les autres jours.
   Note: Le cortex à ce stade de développement contient une majorité de NNC et seule une minorité de cellules différenciées. Les cellules différenciées de la minorité ne répondent pas au traitement rhFGF2 et meurent au cours de la culture d'expansion.
9. Passage élargi NSCs à 60% de confluence.
   1. Pour NSCs de passage, éliminer le milieu d'expansion. Laver les cellules rapidement trois fois avec du milieu 5 ml de repiquage. Attendez 2-4 min. Sans ^{Ca2 +} et ^{Mg2 +} les cellules se détachent de la surface lentement, arrondi vers le haut. Vérifier le détachement des cellules au microscope de phase. Attendez encore quelques minutes, si nécessaire, jusqu'à ce que le détachement visuel de la surface est observée.
      Remarque: Les cellules individuelles vont détacher complètement, mais la plupart des cellules seront toujours adhérer à la surface de la boîte. La durée nécessaire pour le détachement dépend de la durée du revêtement de fibronectine. Un revêtement de fibronectine courte (12 h ou moins) se traduit par le détachement des cellules plus rapidement. Pour des expériences plus longues (>; 1 semaine) fibronectine revêtement de plus de 24 heures est recommandé.
10. Utiliser une pipette de 10 ml pour détacher doucement les cellules de la surface. Recueillir le milieu de repiquage de 5 ml avec des cellules et la transférer à un nouveau tube de 15 ml. Répéter l'opération avec un supplément de 5 ml de milieu de repiquage.
11. Dissocier les cellules dans le tube de 15 ml par pipetage de haut en bas trois fois, en plaçant les 10 ml pipette au fond du tube. Spin le tube pendant 15 min à 1200 xg à la température ambiante. Retirer le surnageant et resuspendre le culot dans 2 ml de milieu d'expansion. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Utilisez bleu trypan pour évaluer les cellules mortes.
    Remarque: Après l' expansion à 60% de confluence, attendez 4 - 5 x 10 ⁶ cellules avec un nombre de cellules mortes à environ 10%.
12. Plate 8 x 10 ⁵ cellules par boîte de 10 cm pour les autres passages.

8. Évaluation des migrations

1. Pour l'évaluation de la migration, isoler explants conformément à la section 5. Seed les explants dans35 plats mm de la grille. Une heure après le placage, ajouter FGF2 (rhFGF2). Placer les capsules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 jours.
   Remarque: Pour la fixation d'expiant optimale, éviter de déplacer les plats.
2. Retirer moyenne de 1000 pointe ul. Ajouter 2 ml de milieu d'expansion de 1000 pointe ul à partir du cercle intérieur (figure 3). Ceci réduit la tension superficielle sur des explants.
3. Ajouter des facteurs de croissance seuls ou en combinaison selon les besoins de l'expérimentation. Utilisez FGF2 / BMP4 / TGFβ1 comme témoin positif. Remarque: Dans cette expérience, 2 pl FGF2 par boîte de 35 mm, 2 pl BMP4 et 4 ul TGFβ1 ont été ajoutés seul et en combinaison (Figure 5).
   1. Ajouter des facteurs supplémentaires et / ou des substances testables. Gardez les plats encore intact pendant 2 jours à 37 ° C.
4. Prenez des photos de explants sur un microscope inversé.
   Note: explants Living donnent de meilleures images à contraste de phase que les cellules fixes. Les deux peuvent être utilisés.
5. Pour la migrationévaluation, utiliser un logiciel graphique qui permet des mesures de pixels (par exemple, Fidji ^8).
6. Mesurer la grille de plat de 500 um distance en pixels et l'utiliser comme référence interne.
7. Définissez le centre de l'expiant comme point de départ de la migration. Mesurer la distance entre le centre de l'explant et le groupe le plus externe de 10 cellules.
   Remarque: Toutes les cellules migrent par centrifugation loin de l'expiant. Ils se forment spontanément une feuille à la périphérie dans les conditions testées (figure 5).

9. Évaluation Invasion

1. Préparer culture de tissu des plaques à 24 puits revêtues de fibronectine selon la section protocole n ° 4.
2. Placez 300 pi de milieu d'expansion au chaud dans le puits haut de chambres d'invasion cellulaire. Incuber les chambres pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
3. Retirer le moyen d'expansion du puits haut et placez la chambre de Boyden dans la plaque de 24 puits revêtue.
4. Ajouter 500 ul de milieu d'expansion chaud avec 0,5 pi de rhFGF2 et 0,5 ul rhBMP4 au fond puits.
5. NSCs Passage et compter comme décrit dans la section 7. Passages 1 à 4 sont adaptés.
6. Plate 5 x 10 ⁵ cellules dans un volume de 300 pi de milieu d'expansion chaud avec 0,3 pi de rhFGF2 et 0,3 pi de rhBMP4 dans le puits haut de la chambre de Boyden.
7. Culture Les NSCs ensemencées pendant 24 h.
8. Ajouter des facteurs supplémentaires et / ou des substances dans la chambre testables et la culture des cellules pendant encore 48 heures.
   Remarque: Si les cellules sont envahissantes, ils passent par le haut et à travers la couche de membrane basale au fond du puits. cellules envahissantes se cramponner au fond de la chambre de Boyden.
9. Suivre le protocole fourni par le fabricant. Utilisez des cotons-tiges (inclus dans le kit de dosage d'invasion) pour éliminer les cellules non-invasives dans le puits supérieur par le nettoyage deux fois.
10. Éliminer le milieu à partir des puits et ajouter du milieu de dilatation 500 ul avecune coloration de la membrane plasmique des cellules vivantes et avec le colorant nucléaire DAPI dans les puits.
11. Incuber pendant 10 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
    Remarque: Les colorants vont s'intégrer dans la membrane et le noyau des cellules invasives, respectivement, pour une visualisation optimale ^8. Option: Omettre plasma colorant membrane si multicolore immunocytochimie est prévu.
12. Retirez le support avec les colorants et laver deux fois avec un milieu d'expansion. Visualiser et compter les cellules invasives avec un microscope inversé à fluorescence comme démontré précédemment ^8.
    Remarque: Certaines cellules invasives peuvent être détachés de la partie inférieure de la chambre et ont chuté à la surface du puits au-dessous de laquelle ils adhèrent à la surface revêtue. Pour une analyse complète inclure les cellules à la surface du puits.
13. Retirez le support et fixer les cellules dans la glace fraîche et froide 4% PFA pendant 10 min. Laver 3x avec PBS 1x. Effectuer immunocytochimie sur les cellules invasives, comme décrit précédemment ^8-10.

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Résultats

Ce système modèle EMT est basée sur l'isolement normalisé de NNC à la fois comme des cellules individuelles ou sous forme d' explants provenant d' une région spécifique du tube neural en développement, le cortex central (figures 1 et 2). Pour l' évaluation quantitative, les explants ont été ensemencées à droite au centre d'une boîte de culture de grille de 500 um (figure 3). Des explants de cortex centra...

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Discussion

Dans cette étude , un système standardisé pour EMT analyse NSCs utilisant est décrite (résumé dans la figure complémentaire 3). La normalisation permet la reproductibilité (Tableau 1 et 2). Les NNC sont dérivées du cortex développement, un tissu qui, normalement, ne subit pas EMT. Ceci est avantageux pour l'analyse des premières étapes de l'EMT. Les premières étapes dans EMT ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate dans les cellules tumorales qui ont a...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BMP4, rhBMP4	RnD Systems	314-BP-01M
Bovine pancreas insulin	Sigma	I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay	Cell Biolabs	CBA-110	24 well plate system
Cell culture dish with grid	Ibidi 500 mm dish, 35 mm	80156
CellMask Orange	Life Technologies	C10045	Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI	LifeTechnologies	D1306	Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle	Gibco Invitrogen	21331-020
FGF2, rhFGF2	RnD Systems	233-FB-01M
Fibronectine, bovine	Sigma	F4759
Glutamax supplement	Gibco Invitrogen	35050-061
Graphics software with pixel measurement feature	Fiji	fiji.sc/Fiji	version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media	Sigma	H9394
Human apo-Transferrin	Sigma	T1147	Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine	Gibco Invitrogen	25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody	Genetex	GTX26142	Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody	Provided by Hirohide Takebayash	Personal stock	Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone	Gibco Invitrogen	15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody	Acris	DM3614P	Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine	Sigma	P3655
Putrescine	Sigma	P5780	Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite	Sigma	S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody	Millipore Chemicon	AB5774	Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1	RnD Systems	240-B-010
Uncoated Petri dishes	Falcon Corning	351029