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Résumé

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Résumé

Whole-cell enregistrement patch-clamp est une technique électrophysiologique qui permet l'étude des propriétés électriques d'une partie substantielle du neurone. Dans cette configuration, la micropipette est en contact étroit avec la membrane cellulaire, ce qui empêche les fuites de courant et fournit ainsi des mesures de courant ionique plus précis que la méthode d'enregistrement de l'électrode utilisée précédemment intracellulaire forte. Classiquement, l'enregistrement de cellules entières peut être effectuée sur des neurones dans divers types de préparations, y compris les modèles de culture cellulaire, les neurones, les neurones dissociés dans des tranches de cerveau, et chez des animaux anesthésiés éveillés ou intacts. En résumé, cette technique a grandement contribué à la compréhension des propriétés biophysiques passives et actives de cellules excitables. Un avantage majeur de cette technique est qu'elle fournit des informations sur la façon spécifique manipulations (par exemple, pharmacologique, expérimentateur induite par la plasticité) peuvent altérer les fonctions ou c neuronales spécifiqueshannels en temps réel. En outre, l' ouverture importante de la membrane plasmique permet à la solution de pipette interne de se diffuser librement dans le cytoplasme, en fournissant des moyens pour médicaments en introduisant, par exemple, des agonistes ou des antagonistes des protéines intracellulaires spécifiques, et la manipulation de ces cibles , sans altérer leurs fonctions dans les cellules voisines. Cet article se concentrera sur l' enregistrement de cellules entières effectuées sur les neurones dans des tranches de cerveau, une préparation qui présente l'avantage d'enregistrer les neurones dans les circuits du cerveau relativement bien conservés, à savoir, dans un contexte physiologique pertinent. En particulier, lorsqu'il est combiné avec la pharmacologie appropriée, cette technique est un outil puissant permettant d'identifier neuroadaptations spécifiques qui se sont produits après tout type d'expériences, telles que l'apprentissage, l'exposition aux drogues d'abus, et le stress. En résumé, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp en tranches de cerveau fournissent des moyens pour mesurer des changements durables ex vivo préparationdans les fonctions neuronales qui ont développé chez les animaux éveillés intacts.

Introduction

La technique de patch-clamp, une technique électrophysiologique qui a été développé à la fin des années 1970 1,2, est un outil essentiel pour l' étude des fonctions simples ou multiples canaux ioniques dans les tissus vivants. Parmi les différentes configurations de raccordement qui peuvent être atteints, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp permettent l'étude du comportement électrique d'une partie substantielle du neurone. Classiquement, cette technique est réalisée in vitro , soit sur ​​des coupes de cerveau, les neurones fraîchement dissociées, ou sur des modèles de culture cellulaire 3. Quand elle est réalisée sur des neurones dans des tranches de cerveau, cette technique présente plusieurs avantages. En particulier: (i) neurones sont enregistrés dans les circuits du cerveau relativement conservées que dans une certaine mesure, et comparées à des préparations de culture cellulaire, fournissent un environnement qui est physiologiquement pertinente 3. Ceci permet la capture précoce, ou même le suivi en temps réel, les événements cellulaires et moléculaires qui sont déclenchées par tout type de pharmacolog aiguëmanipulations iques - une résolution temporelle qui ne peut être réalisé en utilisant classique dans des conditions in vivo; (ii) la capacité d'identifier visuellement les régions du cerveau dans des tranches de cerveau permet une haute spécificité régionale 3 fois pour la région du cerveau étudié et pour les neurones spécifiques quand ils expriment des marqueurs fluorescents; (iii) l' accès à l'espace intracellulaire de la cellule par l' ouverture d' une partie importante de la membrane du plasma (contrairement à la perforation de la membrane avec une micropipette forte pour les enregistrements intracellulaires) 4. À son tour, cela permet à la teneur ou la concentration en ions spécifiques qui composent la solution interne à modifier les cibles moléculaires ou si les mécanismes cellulaires peuvent être étudiés dans des conditions différentes. Par exemple, lors de l' établissement configuration cellule entière, tout agent pharmacologique spécifique (par exemple, des antagonistes) que l' on peut ajouter à la micropipette d'enregistrement (patch pipette) solution directement diffuse dans le cytoplasme et agir en son putative cibles intracellulaires, sans altérer la fonction cible dans les cellules voisines. En outre, par rapport à l' enregistrement de micropipette forte, la grande ouverture à la pointe de l'électrode de patch-clamp offre une résistance plus faible, moins de bruit en concurrence, et donc un meilleur accès électrique à l'intérieur de la cellule 4. Toutefois, notez que la grande ouverture à la pointe de la pipette peut conduire à une dialyse cellulaire, et donc la perte de machinerie moléculaire intracellulaire qui peut être critique pour l'expression des phénomènes biologiques qui sont à l'étude 5,6. Dans ce cas, les enregistrements d'électrodes pointus peuvent être plus appropriés. Ce type d'enregistrement nécessite des micropipettes avec des pores qui est beaucoup plus petite que celles utilisées pour l'enregistrement de cellules entières, empêchant ainsi la majeure partie de l'échange d'ions entre l'espace intracellulaire et la solution de pipette interne.

Toute forme d'expérience (aiguë ou chronique), y compris l' apprentissage 7-10, l' exposition aux drogues 11,12, le stress 13,14, etc., peuvent modifier divers aspects de la fonction neuronale dans des régions spécifiques du cerveau. Parce que ces modifications nécessitent souvent le temps de développer (heures à quelques jours), des enregistrements de cellules entières dans des tranches de cerveau provenant d'animaux qui ont subi une expérience spécifique permettent aux chercheurs d'identifier ces changements. Fondamentalement, beaucoup (sinon la totalité) des composants qui participent à des fonctions neuronales (par exemple, les canaux ioniques activés par des ligands, des canaux ioniques voltage-dépendants, les transporteurs de neurotransmetteurs), et ainsi l' activité des circuits cérébraux et de comportement, peuvent être modifiés par l' expérience (dépendant de l' expérience plasticité) 10,15-17. Au niveau neuronal, l' activité des circuits cérébraux émerge des interactions constantes entre synaptique (par exemple, la transmission du glutamate) et les facteurs intrinsèques de l' excitabilité cellulaire (par exemple, les canaux ioniques axosomato-dendritique: sodium, Na +, potassium, K +, et de calcium, Ca 2+ ). Dans des conditions spécifiques en utilisant whole-cell patch-clamp techniques électrophysiologiques, des altérations de signaux provenant spécifiquement des changements de rapport synaptique excitabilité intrinsèque peut être isolé.

Dans la plupart des cas, l' excitabilité synaptique est évaluée en utilisant la technique de voltage-clamp à cellules entières. Ce mode d'enregistrement permet la mesure des courants ioniques [par exemple, médiée par des récepteurs d'acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ( récepteurs AMPA) et des récepteurs N-méthyl-D-aspartique (récepteurs NMDA)] à travers la membrane plasmique des neurones tout en maintenant le potentiel de membrane à une tension de consigne. Ici, les expérimentateurs utilisent les solutions internes de micropipette qui contiennent du césium (Cs +), un large bloqueur des canaux K + (facteurs clés de l' excitabilité intrinsèques). Lors de l' établissement de la configuration de cellule entière, la diffusion de Cs + dans l' espace intracellulaire , bloque les canaux K +, et ainsi permettra à la fois un espace de serrage et de pré relativement efficacevent influence des facteurs d'excitabilité intrinsèques sur d'autres mesures. Questions Espace-clamp, à savoir la difficulté de voltage-clamp toute la cellule, se posent lors de l' enregistrement des cellules de forme irrégulière (par exemple, les neurones), et en particulier les neurones avec un dendritique vaste et complexe tonnelle 18,19. Parce que somatique de verrouillage de tension de contrôle mal la tension dans l'arbre dendritique des neurones, les divers aspects de signaux électriques dendritiques à l'étude sont déformées d'une manière dépendant de la distance dendritique. Combinés avec des outils pharmacologiques telles que la picrotoxine (acide gamma-aminobutyrique, le GABA Un antagoniste des récepteurs) ou de l' acide kynurénique (large bloqueur des récepteurs du glutamate) dissous dans la solution extracellulaire (liquide céphalo-rachidien artificiel, ACSF), cette technique permet la mesure du glutamate et un récepteur - GABA R-médiée courants , respectivement.

En revanche, l'excitabilité intrinsèque est généralement évaluée en mode d'enregistrement en cours-clamp.Par opposition à l'enregistrement voltage-clamp, ce mode d'enregistrement permet de mesurer les variations de potentiel de membrane induite par des courants d'ions circulant à travers la membrane plasmique des neurones. En règle générale, la modification de l'excitabilité intrinsèque est évaluée par des changements dans la capacité des neurones à générer des potentiels d'action, ce qui nécessite à la fois Na + et K canaux +. Par conséquent, lors de l' exécution des enregistrements de courant de serrage, les micropipettes sont remplies avec une solution interne qui contient K + au lieu de Cs +. Combinés avec des agents pharmacologiques qui bloquent le glutamate et le GABA A courants médiés par les récepteurs dissous dans le ACSF, ce modèle expérimental permet la mesure de la contribution des facteurs intrinsèques (par exemple, des canaux K +) à la décharge neuronale sans être contaminé par des changements potentiels de l' excitabilité synaptique facteurs.

Cet article décrit les étapes de la procédure de base nécessaires to (i) préparer des tranches de cerveau en bonne santé; (Ii) réaliser la configuration de cellule entière, et (iii) de surveiller les paramètres de base pour évaluer synaptique et excitabilité intrinsèque.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux UT Southwestern, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l'inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire.

1. Solutions

Note: Préparer des solutions internes de micropipette à l'avance. Pour la plupart des fins expérimentales de base, deux types de solutions devraient suffire: des solutions à base de Cs + à base et K +.

  1. Solutions à base Utiliser Cs + (par exemple, solution Cs + gluconate, voir Matériaux) pour des expériences voltage-clamp. Préparer à la température ambiante.
    1. Préparer une solution 117 mM de gluconate Cs en mélangeant 4,62 g d'acide D-gluconique (~ 3,696 ml) avec du CsOH 3,54 g (~ 2,01 ml).
    2. Ajouter ddH 2 O à 90 ml et laisser équilibrer pendant 30 min.
    3. Ajouter les ingrédients solides (HEPES 20 = 0,476 g; mM EGTA 0,4 = 15,2 mg; mM NaCl 2,8 = 16,4 mg; 5 mM de tétraéthylammonium (TEA) Chlorure = 83 mg).
    4. Ajouter ddH 2 O à ~ 97 ml.
    5. Ajuster le pH de la solution à 50% de CsOH à 7/2 au 7/3.
    6. Vérifiez osmolarité et corriger si nécessaire avec ddH 2 O.
      Remarque: Une bonne gamme est ~ 280-285 mOsm. osmolarité optimale devrait être 15 - 20 mOsm ci-dessous l'osmolarité du ACSF standard (généralement 300-310 mOsm, 300 mOsm dans notre laboratoire). Osmolarité peut varier en fonction des solutions des compositions spécifiques.
    7. Aliquote à 1000 pi et conserver à -20 ° C ou moins.
    8. Préparer, aliquote, geler, et ajouter ATP / GTP à la solution interne le jour de l'enregistrement.
      1. Ajouter 64,63 mg ATP à 10 mg GTP et dissoudre dans 637.11 ul de ddH 2 O.
      2. Préparer 10 aliquotes et conserver à -20 ° C ou moins. Mélanger chaque aliquote 100x avec 1000 ul d'une solution interne, le jour de l'expérience. Une fois que l'ATP / GTP est ajouté à la solution interne, la maintenir sur de la glace pour empêcher degradati ATP / GTPsur.
  2. Solutions à base Utiliser K + (par exemple, la solution K-gluconate, voir Matériaux) pour les deux expériences courant et de tension-clamp où K + conductances restent fonctionnels de telle sorte que la décharge neuronale peut être évaluée. Préparer à la température ambiante.
    1. Peser tous les matériaux en fonction du volume final désiré. Pour la préparation de 90 ml de solution, 120 mM de K-gluconate = 2,81 g; 20 mM de KCl = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM d'EGTA = 0,008 g; 2 mM de MgCl2 = 0,021 g.
    2. Utiliser suffisamment ddH 2 O pour atteindre 90% du volume final de la solution. Cela devrait veiller à ce que suffisamment de place est laissée pour le pH et l'ajustement de l'osmolarité.
    3. Après addition et mélange tous les ingrédients, assurez-vous que la solution est limpide avant de mesurer le pH.
    4. Tout en agitant constamment la solution, ajuster le pH à 7,2 à 7,3 en utilisant K + hydroxyde (KOH).
    5. Après ajustement du pH, utilisez le osmomètre et adjuste osmolarité à 280-285 mOsm.
      Remarque: osmolarité optimale devrait être 15 - 20 mOsm ci-dessous l'osmolarité du ACSF standard (généralement 300-310 mOsm, 300 mOsm dans notre laboratoire). Osmolarité peut varier en fonction des solutions des compositions spécifiques.
    6. Aliquote à 1000 pi et conserver à -20 ° C ou moins.
    7. Préparer, aliquote, geler, et ajouter ATP / GTP à la solution interne le jour de l'enregistrement (voir étape 1.1.8).
  3. Préparer 1 L de ACSF standard (voir Matériaux).
    Note: Nous utilisons cette recette dans notre laboratoire lors de l'enregistrement des neurones épineux moyens (MSN) dans des tranches de cerveau, cependant, les recettes peuvent varier entre les laboratoires, et par conséquent, nous recommandons l'expérimentateur utiliser une recette qui est couramment utilisée lors de l'enregistrement de la région du cerveau d'intérêt .
  4. Préparer le ACSF de dissection (solution à découpage, ~ 125 ml. Note: le volume exact dépendra de la taille de la chambre de découpe comme il se soit complètement immergé dans le cerveau) destiné à être utilisé dansétapes 02.02 à 02.08.
    1. Préparer 5 mM d'acide kynurénique (pour bloquer glutamate processus excitotoxicité induite par le récepteur) dans la norme ACSF dans un volume suffisant pour submerger le cerveau pendant le tranchage. Utilisez un sonicateur pour aider à dissoudre l'acide kynurénique.
      Remarque: La durée de la sonication peut varier en fonction du volume et de la quantité de matières solides dans la solution. Les solutions doivent être claires à la fin du processus (environ 1 - 2 min dans nos conditions).
    2. Refroidir tout en faisant barboter avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux dans un seau de glace jusqu'à ce que la température atteigne 0-2 ° C.
  5. Préparer ACSF pour l'enregistrement.
    1. Prendre 1 L de type ACSF (ou ce qui reste de la solution préparée à l'étape 1.3), dans laquelle les agents pharmacologiques appropriés peuvent être ajoutés en fonction des expériences prévues.
      1. Par exemple, ajoutez 100 uM picrotoxine lors de l'enregistrement des courants post-synaptiques excitateurs ou potentiels (EPSCs ou RPEB), antagonistes des récepteurs de glutamate (kynurenic acide, 2 mM; ou une combinaison de D-APV 50 pM avec CNQX 10 uM) lors de l'enregistrement des courants d'inhibition post-synaptiques ou potentiels (CISP ou IPSP), et les antagonistes des récepteurs de picrotoxine et du glutamate lors de l'évaluation de la décharge neuronale en l'absence de toute influence des événements synaptiques.

2. Slice Préparation

  1. Construire ou obtenir une chambre de récupération de tranche.
    Remarque: Le principe d'une chambre de récupération est simple et peut être réalisée dans le laboratoire (figure 1). En bref, la chambre est un récipient dans lequel est inséré un panier pour contenir les tranches de cerveau à un niveau qui est inférieur à la surface de l'ACSF. Diverses sociétés scientifiques vendent également des chambres de récupération de tranche.
    1. A titre d'exemple, obtenir quatre anneaux (4 - 6 mm de haut) (Figure 1A, vue de côté; B, vue de dessus) en coupant une seringue de 30 cc. Ensuite, la colle tendue des filets (par exemple, couper à partir d' un hos en nylone) d'un côté des anneaux pour maintenir les tranches de cerveau (figure 1B) et coller les anneaux ensemble.
      Remarque: un pistolet à colle peut être utilisé.
    2. Une fois les quatre anneaux sont collés, coller un mur isocèle incurvée en plastique en forme de trapèze à deux des anneaux (figure 1A et B) pour détourner des bulles d'oxygène à partir des tranches de cerveau récupération (Figure 1C et D). Comme cela est représenté sur la figure 1D, insérer un système d'oxygène diffusant (ici, un tube de dispersion de gaz) sur le même côté que les parois en plastique.
  2. Avant de trancher, oxygéné (95% O 2/5% CO 2) et refroidir la solution de tranchage (voir étape 1.4) 0 - 2 ° C.
  3. Remplir la chambre de récupération personnalisée avec ACSF standard à RT. Assurez-vous que le ACSF est bien oxygéné (20 - 30 min, le temps peut varier en fonction du volume de la chambre) avant de placer les tranches dans la chambre de récupération. Veiller à ce que les bulles de gaz ne sont pas en con directetact avec les tranches ou les perturber.
  4. Tapisser le bac à glaçons vibratome avec de la glace et remplir avec de l'eau froide de sorte qu'un tiers à la moitié de la chambre de tranchage est immergée. Placez délicatement un système d'alimentation en oxygène (par exemple, gaz diffusant pierre) et une sonde de température dans la chambre de tranchage de sorte que ni l' article interfère avec le mouvement de la lame ou la manipulation de tranche.
  5. Préparer la zone de dissection et les outils nécessaires pour extraire le cerveau et disséquer la région du cerveau souhaitée.
    Remarque: La dissection exacte réalisée dépendra de la région spécifique du cerveau étudié que différentes structures cérébrales nécessiteront tranchage à différents plans (par exemple, coronale, sagittale ou tranches horizontales.).
    1. Placez les outils suivants sur un underpad: ciseaux de décapitation, scalpel, petits ciseaux à bout pointu droites, pinces navire de canulation (ou tout autre outil chirurgical avec une pointe large, tels que rongeurs, qui est plus approprié pour les crânes de rat), pinces hémostatiques courbées, tweezers, spatule, écopage spatule, papier filtre, boîte de Pétri, lame unique lame de rasoir, et colle cyanoacrylate.
  6. Lorsque la température atteint 0-2 ° C, transférer la solution de tranchage à la chambre de tranchage (bac tampon).
  7. Anesthésier la souris dans une chambre de dessiccation à l'isoflurane. quantité exacte peut varier en fonction de la taille de la chambre utilisée, mais pour une petite cage boîte à chaussures utiliser quelques gouttes (~ 3 - 4). Laissez la souris dans la cage jusqu'à immobile rendu (ne répondant pas aux stimuli tactiles; environ 15 s pour les conditions décrites ici). Effectuer des tests de la queue et les pieds presseurs pour assurer l'animal est profondément anesthésié, puis décapite avant que le cœur cesse de battre (améliore la viabilité des cellules).
    Note: Avec une justification appropriée, certains laboratoires obtiennent l'autorisation d'effectuer la décapitation en direct afin de minimiser autant que les processus d'excitotoxicité possibles et d'améliorer la viabilité des cellules.
  8. Effectuer la dissection.
    Remarque: Le cerveau doit êtreextraire rapidement (<45 s).
    1. En utilisant le scalpel coupé la peau superficielle sur le dessus du crâne du rostrale à caudale.
    2. Peler le cuir chevelu de chaque côté de la tête.
    3. L'utilisation de petits ciseaux à bout pointu droites, couper la plaque interparietal le long de la suture lambdoïde pour enlever le cervelet. Retirer l'os occipital.
    4. En utilisant les mêmes ciseaux, couper la suture sagittale.
    5. Faites glisser la pince navire de canulation (ou rongeurs se briser un crâne de rat) en dessous de chaque os pariétaux et tirer pour exposer le cerveau.
    6. En utilisant les pinces hémostatiques courbées, pincer les os frontaux pour les briser, puis utiliser des pinces ou des pinces de navire canulation pour enlever les os brisés. Couper et enlever la dure-mère aussi doucement que possible car il peut interférer avec la dissection.
    7. Faites glisser la spatule en dessous du cerveau et tirez doucement le cerveau sur le crâne pour le placer dans la chambre de tranchage (bac tampon) préalablement rempli de glace-froid ACSF. Que le cerveaurefroidir pendant 1 - 2 min.
    8. Préparer la plate-forme de dissection en remplissant une boîte de Pétri avec de la glace et de la glace d'eau pour permettre une plus grande surface de contact, couvrir avec son couvercle et placez un papier filtre sur le dessus. Mouiller le papier filtre avec ACSF froid.
    9. Une fois que le cerveau est refroidi, placez le cerveau sur la boîte de Pétri rempli de glace, et effectuer rapidement la dissection appropriée pour obtenir le plan désiré de tranchage.
    10. Pour obtenir des tranches sagittal contenant le noyau accumbens (NAc), utiliser un seul bord lame de rasoir pour couper et enlever les tubercules olfactifs et le cervelet si elles sont encore présentes. Ensuite, effectuer une coupe sagittale de 2 - 3 mm de la bordure latérale de l'hémisphère droit pour obtenir la surface plane qui sera collée sur le spécimen de maintien plaque (voir étape 2.8.11).
      Note: Cutting seulement 2 - 3 mm de la bordure latérale de l'hémisphère permettra la collecte de tranches contenant le NAc des deux hémisphères. La dissection appropriée dépendradans la région du cerveau qui est étudiée. Ici, la dissection est effectuée neurones afin NAc peuvent être enregistrés dans des tranches de cerveau sagittal.
    11. Rapidement la colle (avec de la colle cyanoacrylate appliquée sur la plaque d'échantillon de maintien), la surface de coupe plane du cerveau sur la plaque selon le plan de découpe désiré. Pour obtenir des tranches de cerveau sagittal voir l'étape 2.8.10.
    12. Immédiatement placer et fixer le spécimen de maintien plaque dans la chambre de tranchage de sorte que le cerveau est découpé rostro-caudale (pour la sécurité, mis en place le porte-lame que lorsque la plaque d'échantillon est fixé).
    13. Réglez le vibratome avec les paramètres appropriés de tranchage (paramètres utilisés dans le laboratoire pour le vibratome mentionné dans Matériaux: vitesse 3 - 4, 9-10 vibrations et tranche d' épaisseur 250 um).
    14. Lors de tranchage, utiliser une pipette de transfert en plastique garni pour transférer les tranches de cerveau à la chambre de récupération (à la température ambiante) (voir étape 2.3). Le temps de récupération peut varier en fonction du type de neurones qui est en cours d'étude(Typiquement 30-90 min).

3. Micropipettes Enregistrement et préparation de Rig

  1. Se reporter aux directives spécifiques du manuel de l'utilisateur de l'extracteur pour obtenir les propriétés désirées de micropipette.
    Note: Pour MSN, nous utilisons une gamme de résistance à la pipette de 3,2 à 4,0 MQ.
  2. Oxygéner l'ACSF et régler le débit à 2 ml / min. ACSF à vide en utilisant une pompe ou à vide péristaltiques lignes installées dans l'établissement.
  3. Allumez le contrôleur de chauffage de perfusion et d' ajuster les réglages de température afin d'obtenir la température désirée (par exemple, 31,8 à 32,2 ° C).
    Remarque: la stabilité de la température dépend ayant à la fois un niveau de ACSF constante et la vitesse d'écoulement constante dans la chambre. Etant donné que plusieurs propriétés biophysiques des neurones (par exemple, la résistance d'entrée, R i, appelée aussi résistance de la membrane, R m) sont sensibles à la température, le maintien d' une température stable est importante.
  4. Allumez compuamplificateur commandé ter, caméra, micromanipulateur et microscope fond clair. Si vous effectuez une expérience qui nécessite une stimulation électrique du tissu, tourner sur le contrôleur de relance et l'unité d'isolement.
    Note: Certains amplificateurs de autres produits manufacturés recommander un "warm-up" avant de l'utiliser, il est donc recommandé de consulter le manuel pour le mode opératoire exact.
  5. Lancer la capture de la caméra, l'acquisition du signal et le logiciel de l'amplificateur.
  6. Slice Placement et visualisation:
    1. En utilisant une pipette de transfert en plastique garni pointe, dessiner doucement dans une tranche de cerveau de la chambre de récupération.
    2. Placez la pipette de transfert dans la chambre d'enregistrement et presser doucement la tranche de la pipette sur la lamelle recouvrant le fond de la chambre.
      Remarque: Tant qu'aucun débordement se produit, il est inoffensif pour avoir une certaine ACSF de la chambre de récupération se jeter dans le bain.
    3. Utilisez une pince pour modifier la position de la tranche so la zone souhaitée sera placé exactement au centre de la chambre d'enregistrement. Utilisez le microscope de faible puissance (4X) objectif et l'oculaire de l'aide dans le positionnement.
    4. Après la position désirée a été atteinte, fixer la position de tranche de cerveau avec une retenue de tranche (également connue sous le nom de «harpe») dans la chambre.
    5. Passez à haute puissance (40X) objectif et abaisser doucement jusqu'à ce que le contact est formé avec l'ACSF dans la chambre.
    6. Utilisez la molette de réglage fin pour amener le tissu dans le foyer. Alors en contact avec l'ACSF, ne pas utiliser la molette de réglage grossier sur le microscope que l'abaissement de l'objectif trop peut écraser la tranche ou même briser la lamelle recouvrant le fond de la chambre, ce qui peut provoquer ACSF renverser sur le condenseur et endommager.
    7. Lorsque l'accent est mis au niveau des tissus, observer les cellules dans la région ciblée pour la forme. Les cellules mortes sont facilement identifiables par leur membrane plasmique gonflé et le noyau ( Figure 1E). Les cellules saines devraient apparaître comme ronde, ovoïde ou structures homogènes elliptiques (Figure 1E).
    8. Recherchez une cellule cible. Marquez-le sur l'écran d'ordinateur afin d'aider à guider le micropipette d'enregistrement. Si vous utilisez des logiciels tels que QCapture, dessiner un carré autour de la cellule cible en maintenant le clic gauche.
    9. Augmenter la lentille d'objectif de sorte qu'il y aura suffisamment d'espace dans le cône formé par la lentille d'objectif étant en contact avec l'ACSF pour placer et déplacer la micropipette d'enregistrement.
  7. Micropipette Placement et positionnement
    1. En utilisant une seringue de 1 ml, une aiguille de microseringue non métallique, et un filtre dédié, remplir une micropipette avec la solution interne préparé à l' avance selon l'expérience prévue (K + à base ou Cs + à base de solution interne, voir les étapes 1.1., 1.2 et Matériaux pour la composition). Utilisez suffisamment de solution pour l'internela solution entre en contact avec l'électrode en fil revêtu de chlorure d'argent dans le porte-micropipette.
      Remarque: L'électrode de fil d'argent peut être chlorée par trempage dans l'eau de Javel. triphosphates nucléosidiques (ATP et GTP) peuvent être ajoutés à la solution interne avant utilisation. Conserver la seringue contenant la solution sur la glace pour empêcher la dégradation de l'ATP / GTP.
    2. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la micropipette car ils peuvent sortir pendant que le micropipette est dans le tissu et obscurcissent la tranche.
    3. Placer le micro-pipette dans le porte-électrode de sorte que la solution est en contact avec l'électrode en fil revêtu de chlorure d'argent.
    4. Serrer le bouchon de la pipette de sorte que la rondelle de cône forme un joint autour de la micropipette.
    5. Appliquer une pression positive avant l'immersion de la micropipette dans le ACSF pour empêcher les débris de pénétrer dans la pipette.
    6. Placer le headstage dans la position verrouillée (tournée vers la chambre), et à l'aide du micromanipulateur guide vers le bas vers la chambre de sorte qu'il est à peu près sous le centre de l'objectif immergé.
    7. Tout en se déplaçant la micropipette avec le micromanipulateur (fixé à moyen et à grande vitesse), utilisez l'écran d'ordinateur pour localiser le micropipette et la guider vers l'emplacement de la cellule sur l'axe XY.
    8. Mesurer la résistance de micropipette en appliquant une étape de tension (par exemple, 4 mV pour 100 msec), qui peut être accompli manuellement ou automatiquement via un logiciel spécifique tel que le mode 'bain' si vous utilisez "Membrane Test" dans le logiciel Clampex (voir étape aussi 4) . Afin de faire en sorte qu'aucune bulle d'air ou d'autres objets étrangers bloquent la micropipette, appliquer une pression positive en utilisant la seringue remplie d'air (par exemple, 30 cc seringue) relié au support de micropipette avec des tuyaux en polyéthylène.
    9. Après avoir supprimé la micropipette, effectuer un décalage de tension pour réduire le courant de pipette à zéro, ce qui peut être réalisé manuellement ou par l'intermédiaire d'un logiciel spécifique tel que & #39; décalage 'sur l'amplificateur commandant commandé par ordinateur pipette.
      Remarque: Cette fonction va compenser toute tension provoquée par les différences de concentration entre le bain et les solutions de micropipette (c. -à- liquide potentiel de jonction 20).

4. Membrane test

Remarque: Cette étape est à l'amplificateur mentionné dans les matériaux.

  1. Lors de l'utilisation d'un amplificateur commandant contrôlé par ordinateur, réglez toujours sur le mode voltage-clamp pour effectuer le test de la membrane.
    Note: Lorsque le test de la membrane est définie en mode «bain», le test de la membrane permet la mesure de la résistance à la micropipette et la résistance d'étanchéité lorsque le joint est formé.
  2. Une fois que la membrane est rompue (voir étape 5.8), passer le test de la membrane en mode "Cell" de telle sorte que la résistance série (R s) (résistance aussi appelé d'accès, R a), R i et de la capacité de la membrane (C p) peutêtre obtenu.

5. Approche finale, Formation Seal, et l'obtention de la configuration à cellules entières

  1. Utilisation de la roue mise au point fine, commencer à se concentrer vers le bas tout en abaissant la micropipette progressivement. Toujours se concentrer en premier, puis abaisser la micropipette vers le plan de mise au point. Cela permettra d'assurer que la pointe de micropipette ne pénètre brusquement dans la tranche.
  2. Lorsque le micropipette vient en contact avec la surface de la tranche, ralentir la vitesse de micromanipulateur en mode moyen-bas.
  3. Appliquer doucement la pression légère positive avec la seringue remplie d'air relié au porte-pipette pour effacer tous les débris de la trajectoire d'approche.
  4. Approcher la cellule, soit en alternance avec les boutons de commande XYZ, en se rapprochant ou en diagonale (si le modèle lui permet micromanipulateur) où les deux axes X, Z sont modifiés par la rotation du bouton de l'axe Z. Cette dernière méthode permet d'éviter la compression verticale des tissus.
    Note: Ici, le but estd'approcher la cellule en infligeant des dégâts minimes à la tranche. Lorsque la micropipette est assez proche de la cellule affiche une fossette (un tour de décolorer la surface cellulaire provoquée par la pression positive appliquée à travers la pointe de la micropipette) (figure 2).
  5. Lorsque la fossette apparaît (Figure 2-1), appliquer une aspiration faible et de courte durée à travers le tube qui est relié au tube d'aspiration du porte-pipette afin de créer le joint d' étanchéité (figure 2-2). Gardez le contrôle de l'essai de la membrane.
    Remarque: si un joint d'étanchéité partielle est formée (<1 GQ), l'injection de courants négatifs en abaissant le potentiel de maintien (sur l'amplificateur commandant commandé par ordinateur) peut faciliter la formation du joint d'étanchéité et la portée gigaohms résistance ( "joint gigaohm" ou "gigaseal"> 1 - 5 GQ). La haute résistance du joint d'étanchéité (> 1 GQ) sera à la fois le bruit limite la contamination du signal enregistré et contribuer à la stabilité mécanique de lapièce.
  6. Alors qu'un gigaseal se forme, utiliser l'amplificateur commandant commandé par ordinateur pour amener le potentiel de maintien de la cellule aussi proche que possible de physiologique potentiel de repos (V repos) afin d'éviter des changements brusques une fois que la membrane est rompue. Par exemple, MSNs sont généralement tension serrée à -70 ou -80 mV (physiologique V repos: -70 à -90 mV).
  7. Après la gigaseal est formée, pour compenser la capacité rapide et lente manuellement ou automatiquement. Si vous utilisez un amplificateur commandant contrôlé par ordinateur tels que Multiclamp commandant, appuyez sur 'Auto' pour 'rapide Cp' et 'Cp lent ".
  8. Si le joint reste stable et supérieure à 1 GQ (ou injecter moins de 10 - 20 pA pour maintenir la cellule au potentiel de membrane désiré), appliquer une mémoire et une forte aspiration à travers le même tube que dans 5,5 à la rupture de la membrane plasmique (figure 2 -3).
    Remarque: Cela peut prendre plusieurs essais. Une bonne rupture de la membrane est réalisée wpoule aspiration est effectuée assez fort de sorte que la membrane rompue ne bouche pas la micropipette ( ce qui peut conduire à une augmentation de R s pendant l' enregistrement), mais assez faiblement pour ne pas dessiner dans une grande partie de la membrane ou de la cellule.
  9. Après avoir obtenu une configuration de cellule entière réussie, surveiller régulièrement l'emplacement de micropipette pour évaluer et corriger la dérive importante car elle peut conduire à la perte du patch. Drift amplitude peut varier en fonction de plusieurs facteurs, par exemple, la qualité de l'installation de forage et des forces de traction sur le headstage. Idéalement, la dérive devrait être presque inexistante.
  10. En passant en mode "Cell" dans le test de la membrane, voir les différents paramètres de la cellule tels que R i, R s et C p. Surveiller ces paramètres lors de l'enregistrement.
    Remarque: Tous ces paramètres peuvent aider à évaluer l'état de santé initial des cellules et types de cellules (voir la section «test de la membrane", étape 4).
  11. Une fois the étapes ci - dessus sont terminées, restent en mode voltage-clamp pour mesurer les courants (par exemple, EPSCs, CISP), ou passer en mode courant-clamp si la planification de mesurer les variations de tension de la membrane (par exemple, l' action tir potentiel). Pour ce dernier, l'injection de courant positif ou négatif pour maintenir la cellule à la tension de la membrane désirée (pour effectuer cette étape, reportez-vous à l'amplificateur manuel d'utilisation).

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Résultats

La température, un facteur qui est facilement contrôlée par l'expérimentateur, influe sur les propriétés biophysiques des canaux ioniques et des récepteurs, et ainsi la forme d' onde des courants postsynaptiques (PSC) (RPEC et CISP) et la capacité des neurones à susciter des pics. Figure 3 et la figure 4 montrent l'effet de la température sur la décharge neuronale et la pente de EPSCs évoqués (les eEPSCs) , respectivement. Le mot...

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Discussion

Ce protocole décrit la procédure de base pour effectuer des cellules entières expériences de patch-clamp sur les neurones dans des tranches de cerveau. Cependant, la complexité, le potentiel et la sensibilité de cette technique ne peuvent pas être décrits en détail dans cet article. Ici, nous avons essayé de définir les étapes les plus élémentaires et de souligner les paramètres importants qui doivent être contrôlés pour réaliser des enregistrements de cellules entières avec succès et rigoureux. Pou...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs ont des intérêts concurrents ou des intérêts contradictoires.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par des fonds de démarrage UT Southwestern (SK).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Isolated pulse stimulus generatorA.M.P.IMaster-8
Isolation unit (ISO-Flex)A.M.P.IISO-Flex
Computer controlled Amplifier Molecular DevicesMulticlamp 700B
Digital Acquisition systemMolecular DevicesDigidata 1500
MicroscopeOlympusBX-51
MicromanipulatorSutter InstrumentsMPC-200
Chamber and in-line HeaterWarner InstrumentsTC-344B
Vibratome SlicerLeica VT1000 S
Micropipette PullerNarishigePC-10
Imaging CameraQ ImagingQIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10NarishigePC-10
Glass capillariesWPITW150F-3
Slice hold-down (harp)Warner Instruments64-0255
Slice ChamberWarner InstrumentsRC-26
Nonmetallic syringe needleWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Syringe filtersNalgene176-0045
Glue GunHome Depotvarious
Gas dispersion tubeAce Glass Inc.various
Decapitation scissorsHome Depot100649198
Scalpel Handle #3World Precision Instruments500236
Small straight sharp tips scissorsWorld Precision Instruments14218
Vessel canulation forceps World Precision Instruments500453
Curved hemostatic forcepsWorld Precision Instruments501288
Economy Tweezers #3World Precision Instruments501976-6
SpatulaFisher Scientific14357Q
Scooping spatulaFisher Scientific14-357Q
Petri dishFisher Scientific08-747B
Filter paperLab DepotCFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50% Sigma Aldrich/variousG1951
Cesium-OH (CsOH) 50% Sigma Aldrich/various232041
NaCl, 2.8 mMSigma Aldrich/variousS7653
HEPES, 20 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.4 mMSigma Aldrich/variousE4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mMSigma Aldrich/variousT2265
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mMSigma Aldrich/variousG4500
KCl, 20 mMSigma Aldrich/variousP3911
HEPES, 10 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.2 mMSigma Aldrich/variousE4378
MgCl2Sigma Aldrich/variousM8266
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mMSigma Aldrich/variousP3911
NaCl, 119 mMSigma Aldrich/variousS7653
NaH2PO4•H2O, 1 mMSigma Aldrich/variousS9638
NaHCO3, 26.2 mMSigma Aldrich/variousS8875
Glucose, 11 mMSigma Aldrich/variousG8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mMSigma Aldrich/various230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mMSigma Aldrich/variousC3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOHvarious
Kynurenic acidSigma Aldrich/variousK3375

Références

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