Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Résumé

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introduction

Dissémination des cellules tumorales de la tumeur mammaire primaire a été montré que des cellules tumorales implique non seulement, mais les cellules hôtes stromales, y compris les macrophages et les cellules endothéliales. En outre, le système vasculaire tumoral est anormale avec ^une augmentation de la perméabilité. Ainsi, la détermination de la façon dont les cellules tumorales, les macrophages et les cellules endotheliales interagissent pour médier la perméabilité vasculaire et intravasculaire de cellules tumorales dans le microenvironnement de la tumeur primaire est importante pour la compréhension des métastases. La compréhension de la cinétique de la perméabilité vasculaire, intravasculaire de cellules tumorales et le mécanisme de signalisation sous-jacente des interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peut fournir des informations cruciales dans le développement et l'administration des traitements anti-cancéreux.

Le moyen principal de l' étude de la perméabilité vasculaire tumorale in vivo a été la mesure des colorants extravasculaires tels que le bleu d' Evans ^2, les dextrans de haut poids moléculaire (155 kDa)³ et fluorophore ou des protéines de radiotraceurs conjugués (y compris l' albumine) ⁴ en des points fixes de temps après l' injection du colorant. Les progrès de la microscopie, des modèles animaux et des colorants fluorescents ont permis la visualisation des processus cellulaires et la perméabilité vasculaire chez les animaux vivants par microscopie intravitale ^5.

Imagerie animale en direct avec l'acquisition d'images statiques ou de courtes séquences time-lapse sur plusieurs points de temps ne permet pas à la compréhension complète des événements dynamiques dans le microenvironnement de la tumeur ^6,7. En effet, l' acquisition d'image statique au cours de 24 heures a montré que le système vasculaire tumoral est non étanche, mais la dynamique de la perméabilité vasculaire n'a pas été observée ^6. Ainsi, l'imagerie en continu prolongé le temps écoulé jusqu'à 12 heures capture la cinétique d'événements dynamiques dans le microenvironnement tumoral.

Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotla microscopie intravitale pour étudier les événements dynamiques multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral sont marquées avec des colorants injectables ou en utilisant des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes. Au moyen d'un cathéter veine de la queue des colorants ou des protéines vasculaires peuvent être injectées après le début de formation d'image pour acquérir des données d'événements cinétique multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. Pour l'imagerie des cellules vivantes de la tumeur mammaire est exposée à travers la préparation chirurgicale d'un lambeau de peau. Les images sont acquises jusqu'à 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé de tubes photomultiplicateurs multiples (PMT) détecteurs ^8. À l'aide de filtres appropriés, un algorithme de soustraction permet de 4 détecteurs pour acquérir PMT 5 signaux fluorescents dans le microenvironnement tumoral simultanément ^9. La microscopie à haute résolution multiphotonique intravitale capture seule résolution cellulaire imagerie des interactions tumeur-stroma dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui conduit à une meilleure uCOMPRENDRE de la perméabilité vasculaire et des cellules tumorales intravasation ^10-13. Plus précisément, l' imagerie intravitale révélés très localisés, les accidents vasculaires transitoires étendues de perméabilité sélective qui se produisent au niveau des sites d'interaction entre une cellule tumorale, un macrophage et une cellule endothéliale (défini comme le microenvironnement tumoral des métastases, TMEM ^{14) 13.} En outre, intravasculaire de cellules tumorales se produit uniquement à TMEM et est spatialement et temporellement corrélée avec la perméabilité vasculaire ^13. résolution cellulaire unique de la dynamique de ces événements a été rendue possible grâce à l'utilisation de longue time-lapse multiphoton microscopique des cellules marquées par fluorescence dans le microenvironnement de la tumeur.

Protocole

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Génération de fluorescence Tumeurs Labellisées et Macrophages associés aux tumeurs

1. Générer des cellules tumorales marquées par fluorescence en traversant le autochthonous modèle spontané, une souris transgénique mammaire cancer , où le virus de la tumeur longue répétition terminale mammaire de la souris entraîne l'antigène polyome du milieu T (MMTV PyMT) avec des souris transgéniques avec des rapporteurs fluorescents [ à savoir, une meilleure fluorescente verte protéines (EGFP), amélioré la protéine fluorescente cyan (ECFP) ou Dendra2] ^8,9.
2. Macrophages de l' étiquette par fluorescence chez les animaux PyMT avec marquées par fluorescence des cellules tumorales par le croisement des modèles de souris génétiquement modifiées avec des journalistes fluorescents spécifiques myeloid- et macrophages [ie, MacGreen ¹⁵ ou souris MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. En variante, de générer des tumeurs marquées par fluorescence par la transplantation orthotopique de cellules marquées par fluorescence (PyMT tumorales syngéniques), de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de tumeurs primaires patient humain dérivées ^(11,17) xénogreffes.
   1. Implant marqué par fluorescence des cellules tumorales dans des souris syngéniques PyMT avec des cellules myéloïdes de la protéine marquée par fluorescence pour générer des animaux avec des cellules tumorales marquées par fluorescence et les cellules myéloïdes ^13.
4. Injecter 100 ul de 10 mg / kg fluorescent 70 kDa dextran par voie intraveineuse (iv) veine de la queue des souris déficit immunitaire combiné sévère (SCID) avec des tumeurs de xénogreffes de lignées cellulaires humaines ou de tumeurs primaires provenant de patients à macrophages d'étiquettes par fluorescence 2 heures avant le début de l'imagerie intravitale.

2. Installation de Microscope et imagerie Préparation

Remarque: Cette procédure décrit la mise en placepour l' imagerie intravitale sur un microscope multiphoton ^8.

1. Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs.
2. Mettre en marche le moteur de chauffage à 30 ° C pour préchauffer la scène. Cette étape est essentielle pour le maintien de la température physiologique de l'animal.
3. Pour une utilisation sur un microscope inversé lieu l'insert de scène sur mesure sur la platine du microscope. L'insert personnalisé est une feuille de 1/8 "aluminium épais usiné pour tenir dans l'espace d'insertion de la scène et avec un diamètre de 1" trou traversant dans le centre d'imagerie.
   1. Essuyez la platine du microscope et l'insert de scène avec 70% d'éthanol et de l'air sec.
   2. Placez une grosse goutte d'eau sur le NA objectif 20X, 1,05 microscope pour maintenir le contact optique avec le verre de protection.
   3. verre Lieu de couverture (# 1.5 d'épaisseur) sur le port d'imagerie sur l'insert de platine du microscope. Fixez en place avec du ruban adhésif de laboratoire.
   4. Utilisez un poinçon pour percer un trou x 2 cm 2 cmdans un tampon de caoutchouc flexible et placez le coussin en caoutchouc sur la platine du microscope avec le trou dans le tampon aligné avec le trou dans l'insert de scène personnalisée.

3. Préparation de la veine de la queue Catheter et réactifs pour injection lors de l'imagerie

1. Couper une longueur de 30 cm de polyéthylène (PE) tubes.
2. En utilisant des pinces, déplacer l'aiguille métallique d'un G aiguille 31 avant et en arrière jusqu'à ce qu'il se détache du raccord en plastique.
3. En utilisant des pinces, insérer l'extrémité émoussée de l'aiguille détaché dans le tube PE.
4. Insérer une aiguille de calibre 31 dans l'autre extrémité du tuyau en PE.
5. Remplir une seringue de 1 cc avec du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) et l'insérer dans le G aiguille 31 et rincer tout l'air du tube et de l'aiguille avec du PBS. PBS est utilisé pour maintenir l' hydratation et l' osmolarité du sang ^9,18, une solution saline isotonique , mais peut également être utilisé.
6. Remplir une seringue de 1 ml avec 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrane tétraméthylrhodamine (TMR) Ou des points quantiques pour l'étiquetage vasculaire.
7. Préparer toutes les autres protéines injectables tel qu'un isoforme de 165 acides aminés de facteur de croissance de l' endothélium vasculaire A (VEGFA ₁₆₅₎ dans une seringue de 1 ml et placer sur de la glace. Injecter 0,2 mg / kg VEGFA ¹⁹ ₁₆₅ à une concentration de 0,05 mg / ml.

4. Insertion de la queue Indwelling Vein Catheter

1. Placer l'animal sous anesthésie à l' aide d' une chambre d'induction avec 5% d' isoflurane avec O ₂ en tant que gaz porteur.
2. Transférer la souris pour la plate-forme chirurgicale une fois qu'il est complètement anesthésié et ne répond pas à une pincée d'orteil.
3. Ligne ouverte de l'isoflurane à la plate-forme chirurgicale, fermer la ligne d'anesthésie à la chambre d'induction et placez le cône de nez sur le museau de l'animal. Réduire l'isoflurane de 5% à 2,5%.
4. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
5. Chauffer l'animal sous la lampe chauffantependant 2 min pour augmenter la circulation dans la queue que la circulation ralentit avec l'anesthésie profonde.
6. Stériliser la souris veine de la queue avec 70% d'éthanol.
7. Insérer la pointe du G aiguille du cathéter construit dans la section 3 dans la veine caudale latérale de l'animal 31 et pousser l'aiguille dans 2-3 mm.
8. Tirez sur la seringue pour voir le sang, assurant le cathéter est placé dans la veine de la queue.
9. Utilisez une longueur de 1 cm de ruban de laboratoire placé sur l'aiguille pour maintenir l'aiguille en place parallèlement à la veine le long de la longueur de la queue.

5. Flap de la peau Procédure chirurgicale pour exposer la tumeur mammaire

1. Avec l'animal sur la plate-forme chirurgicale tamponner la tumeur et la surface ventrale avec 70% d'éthanol. Remarque: Comme indiqué, ce procédé n'a pas été complètement exécutée de manière aseptique. Pour les sessions d'imagerie longues où l'infection peut devenir un facteur de confusion, il est recommandé d'utiliser une technique aseptique appropriée.
2. Utilisation de steriLe forceps, soulever la peau ventrale et avec des ciseaux stériles faire une incision sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale d'environ 1 cm de longueur. Évitez de perforer le péritoine lors de l'incision.
3. couper en douceur le tissu conjonctif fixation de la glande mammaire et la tumeur loin du péritoine pour exposer la tumeur mammaire.
4. Avec des ciseaux et des pinces, retirez délicatement et couper le fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur tout en préservant l'intégrité de la vascularisation de la tumeur et de minimiser les saignements. Cette étape est essentielle pour le maintien de l'architecture de la tumeur et le système vasculaire d'alimentation de la tumeur.

6. Préparation des animaux pour Microscopie

1. Transférer l'animal au stade d'imagerie préchauffée avec la tumeur exposée placée sur la lamelle couvre-objet sur l'insert de phase au-dessus de l'objectif du microscope pour l'imagerie. Prenez soin de transférer le cathéter dans la veine caudale doucement avec l'animal afin de ne pas déloger l'aiguille.
2. La place enez e anesthésie cône sur le museau de l'animal pour maintenir ensemble l'anesthésie à 3% d'isoflurane.
3. Positionner l'animal de telle sorte que la tumeur repose dans le trou de la garniture en caoutchouc et en contact avec la lamelle couvre-objet en verre.
4. Utilisez deux tampons en caoutchouc pour tenir doucement la tumeur en place et les fixer à la platine du microscope avec du ruban de laboratoire pour réduire le mouvement lors de l'acquisition d'image.
5. Remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS pour maintenir le tissu hydraté et maintenir le contact optique avec la lamelle.
6. Commencez à surveiller les signes vitaux de l'animal avec une sonde d'oxymètre de pouls. Fixer un capteur à pince à la cuisse de l'animal. En variante, un collier qui est configuré pour s'adapter autour du cou peut être utilisé.
7. Placer la boîte de chauffage au- dessus de l'animal pour maintenir 30 ° C ^20.
8. diminuer progressivement le niveau de l'isoflurane à 0,5-1% pour maintenir l'anesthésie et de maintenir le flux sanguin.

Acquisition et Injection de Fluoresc 7. imageent Colorants et protéines injectables

1. Mise au point à l'aide du microscope oculaire sur les cellules tumorales fluorescentes sur la surface de la tumeur.
2. Sélectionnez une zone d'intérêt en trouvant des zones où affluent les vaisseaux sanguins. La sélection d'une zone d'intérêt avec écoulement des vaisseaux sanguins est essentielle pour l'évaluation de la vascularisation tumorale.
3. Une fois qu'une région d'intérêt a été sélectionné commuter le microscope en mode multiphotonique d'imagerie.
4. Fixer les limites supérieure et inférieure d'une série Z. Régler la limite supérieure de la z-série en utilisant le réglage de mise au point pour déplacer l'objectif à l'emplacement de départ souhaité et en cliquant sur le bouton de position Z "Top". Déterminer la limite supérieure de la série Z en visualisant le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de second harmonique (SHG) et en observant en l'absence de cellules, mais seules les fibres de collagène sont visibles.
   1. Réglez la limite inférieure de la z-série en déplaçant l'objectif à la profondeur d'imagerie désirée (typically 50-150 um) et en cliquant sur la position Z bouton "Bas".
   2. Définissez la taille de l'étape en tapant la valeur souhaitée dans le champ de taille de pas. Déterminer la taille de l'étape fondée sur des considérations de résolution et le temps d'acquisition (généralement de 2 pm est utilisé pour la reconstruction 3D de haute résolution et 5 um autrement).
5. Définissez l'intervalle time-lapse par le passage à l'écran Time-Lapse et en entrant le temps écoulé désiré dans le champ Time-Lapse. Pour une résolution temporelle optimale définir l'intervalle de temps de 0 sec pour l'imagerie en continu. Remarque: Pour une longue imagerie time-lapse il est recommandé de définir l'intervalle de temps de 10 secondes entre les acquisitions pour reconstituer le liquide d'immersion objectif.
6. Une fois les paramètres pour l'imagerie ont été déterminés, injecter lentement 155 kDa dextran-TMR.
   1. Retirez la seringue avec du PBS dans le cathéter veine de la queue et le remplacer par la seringue contenant 155 kDa dextran-TMR en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans le line.
   2. Lentement injecter 155 kDa dextran-TMR dans la souris, avec un volume maximum de 200 pi, et remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS. ÉTAPE CRITIQUE: Effectuer l'injection lentement et prendre des précautions pour éviter d'avoir une solution en dehors de la veine.
7. Démarrer l'acquisition de la Z-stack imagerie time-lapse en cliquant sur les boutons Time-Lapse Z-Stack et de les appuyer et puis en cliquant sur le bouton d'enregistrement.
8. Si d' autres dextranes fluorescents, à savoir, isothiocyanate 10 kDa dextran-fluorescéine (FITC), ou des protéines, à savoir, VEGFA _165, ont été préparés à l' avance, les injecter après le début de l' acquisition d'images pour au = 0 min début.
   1. Retirez la seringue avec du PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant 10 kDa dextran-FITC ou VEGFA ₁₆₅ en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne.
   2. Injecter lentement injectables dans la souris à travers le cathéter dans la veine caudaleet remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS.
9. Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l'hydratation de l'animal.

8. euthanasie

1. A la fin de l'acquisition d'images, euthanasier l'animal.
   1. Augmenter le isoflurane à 5%.
   2. Gardez l'animal de moins de 5% d'isoflurane jusqu'au 30 sec après qu'il cesse de respirer et enlever l'animal de la scène.
   3. Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.

Traitement 9. Image

1. Acquérir des images à des fichiers TIFF 16 bits pour chaque canal individuel à chaque point de temps et économiser de manière séquentielle.
2. Effectuer la séparation de chevauchement spectral (c. -à- GFP et PCP), l' élimination de la dérive xy et la génération de films à partir de séquences de time-lapse en utilisant des méthodes établies dans ImageJ ^9. Effectuer 3D reconstructions de surface des images à haute résolution ¹³.

Résultats

La microscopie Extended time-lapse intravitale permet seule résolution cellulaire imagerie des processus multicellulaires dans le microenvironnement de la tumeur. Par les cellules tumorales marquage par fluorescence, les macrophages, l'espace vasculaire et de visualiser le réseau de fibres de collagène en utilisant le deuxième signal de génération d'harmoniques, de multiples compartiments dans le microenvironnement tumoral sont simultanément suivis au cours de l'imager...

Discussion

les interactions cellulaires qui se produisent spontanément dans le microenvironnement tumoral peut conduire à des modifications de la motilité des cellules tumorales et intravasculaire. Haute résolution intravitale imagerie du tissu tumoral en temps réel permet de visualiser la dynamique multicellulaire qui peut être très ^10,13,24 transitoire. Point final dans des essais in vivo ou images time-lapse acquises avec des points de temps discrets peuvent fournir des informations essentiel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch