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Résumé

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

Résumé

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

Introduction

La barrière hémato-céphalorachidien (BCSFB) est l' un des trois sites de barrière entre le sang et le cerveau 1. Corrélat morphologique sont les cellules epitheliales du plexus choroïde (CP) 2,3, une spire endothéliale épithéliale, qui est fortement vascularisée et situé dans les ventricules du cerveau. Le CP sert à produire le liquide céphalorachidien (LCR), ainsi que pour séparer celui-ci du sang. Afin d'obtenir la fonction de barrière, les cellules épithéliales CP présentent une activité faible pinocytose, expriment des transporteurs spécifiques, et sont fortement connectés par un réseau continu de jonctions serrées (TJS) 2,3.

Human papilloma du plexus choroïde (HIBCPP) cellules, dérivées d'une maligne plexus choroïde papillome d'une femme japonaise 4, ont été utilisés pour construire une fonctionnelle dans le modèle in vitro de l'BCSFB. HIBCPP cellules présentent quelques caractéristiques d'une BCSFB fonctionnelle que la formation de TJbrins, le développement d'un potentiel de membrane transépithélial élevée qui peut être déterminé que la résistance électrique transépithélial (TEER), et des perméabilités mineures pour macromolécules. En outre, les cellules HIBCPP expriment les transporteurs caractéristiques, qui peuvent servir à réguler le microenvironnement ionique, et de montrer apical / basolateral 5,6,7 de polarité.

Le BCSFB a été montré pour fonctionner comme un site d'entrée pour les agents pathogènes (bactéries, virus et champignons) dans le système nerveux central (SNC) 8. L'invasion de pathogènes, y compris Neisseria meningitidis (meningitidis N.), une bactérie à Gram négatif, peut provoquer des maladies graves comme la méningite. Preuve qu'il surmonte la barrière épithéliale protectrice du CP est pris en charge par des observations histopathologiques chez les patients avec une maladie méningococcique présentant des quantités accrues de méningocoques dans les vaisseaux et les cellules CP épithéliales 9,10. Pour gagner l'entrée dans des cellules hôtes bacteria détournent souvent des mécanismes d'endocytose, qui sont médiées par des récepteurs ou déclenchées de surface spécifiques situés sur les cellules hôtes. Depuis les interactions des agents pathogènes avec ces récepteurs peuvent être des espèces modèles spécifiques 11, animaux ne peuvent être consultés dans une mesure restreinte. La lignée cellulaire HIBCPP offre la possibilité d'étudier le processus d'invasion, ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents dans un système de modèle humain. En utilisant des inserts de culture cellulaire permet d'analyser les interactions des agents pathogènes avec les cellules hôtes à partir de deux côtés de cellule distincts. Beaucoup de bactéries, y compris N. meningitidis, sont fortement soumis à l'impact de la gravité au cours des essais d'infection. Pour une interaction optimale des agents pathogènes avec les cellules HIBCPP au cours des essais, les bactéries sont tout d'abord ajoutés dans le compartiment supérieur du système d'insertion de filtre de culture cellulaire. Pour permettre l' infection de la apical ou du côté de la cellule basolatérale, respectivement, deux variantes du système in vitro ont été established: Dans le système standard de cellules HIBCPP sont ensemencés dans le compartiment supérieur de l'insert filtrant, mimant la situation dans laquelle les micro - organismes sont situés sur le CSF-côté et entrer en contact avec le côté apical des cellules (Figure 1A, C). En revanche, en utilisant les cellules HIBCPP dans un système d'insertion de filtre de culture cellulaire inversée reflète les conditions lorsque les bactéries ont pénétré dans le flux sanguin. Microorganismes diffusent dans le sang et la rencontre CP cellules épithéliales du côté basolatéral (Figure 1B, D). Il convient de noter qu'il a été démontré que , dans ce système de modèle que les bactéries envahissent les cellules d'une manière HIBCPP polaire spécifiquement du côté basolatéral de 5,7 cellulaire.

Par la suite à l'infection du CP, les agents pathogènes envahis peuvent être reconnus par le système immunitaire innée par ligature à des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). membres bien décrits des PRR appartiennent à la famille des récepteurs Toll-like (TLR). TLR peut bind à des structures caractéristiques des micro-organismes infectieux, qui sont des modèles de Appelés associés à des pathogènes moléculaires (PAMP). Ligation des récepteurs conduit à l' activation de la cellule hôte en cascade de signalisation qui déclenchent l' expression de cytokines et de chimiokines 12, qui à leur tour stimulent la transmigration des cellules du système immunitaire à travers la BCSFB 13,14. Il a été démontré que les cellules expriment HIBCPP plusieurs TLR au niveau de l' ARNm et que l' infection par N. meningitidis entraîne la sécrétion de plusieurs cytokines et de chimiokines, y compris CXCL1-3, IL6, IL8 et TNFa 15,16.

Ici, nous décrivons la culture et l'infection de la lignée cellulaire humaine HIBCPP dans un système d'insert de culture cellulaire inversée qui imite la BCSFB. Ce système modèle permet d'étudier les interactions des agents pathogènes avec la partie pertinente in vivo basolatérale des cellules ainsi que la réponse cellulaire ultérieure.

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Protocole

1. Préparer Culture cellulaire Filter Inserts pour cellules Semis HIBCPP dans un système Inverted Modèle

  1. Préchauffer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml d'insuline, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de sérum de foetus de veau (FCS).
  2. Utiliser des pinces stériles pour placer la zone de croissance des inserts de filtres de culture cellulaire 0,33 cm² avec une taille de pores de 3 um à l' envers dans une plaque à 12 puits (figure 1E).
  3. Remplissage moyen dans le compartiment inférieur de la culture cellulaire élément filtrant (environ 3 ml) et 100 ul sur le dessus de la cartouche filtrante. Inonder la plaque ainsi que le compartiment inférieur avec le milieu. Aspirer le milieu en excès de telle manière que le compartiment inférieur de la garniture de filtre reste rempli (figure 1E).
    Note: Il est recommandé d'utiliser une pipette sérologique pour cette étape.
  4. Couverture plaque de 12 puits avec le couvercle et transférer les inserts filtrants disposés de culture de cellules dans l'incubateur à 37 ° C,5% de CO 2 jusqu'à ce que l' addition de cellules.

2. La culture et repiquage des cellules HIBCPP

  1. Préparer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de FCS.
  2. moyen pré-chaud et PBS dans un bain d'eau C 37 °. milieu de Aspirer de flacon. Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon et tourbillonnement. Répétez cette étape une fois.
  3. Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le flacon et tourbillonnement. Placer dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2.
  4. Après environ 20 minutes enlever le ballon de l'incubateur. Faire en sorte que les cellules se détachent du fond du flacon et présentent une forme ronde au moment du sondage au moyen du microscope.
    Remarque: Les cellules ne se détachent pas complètement l'une de l'autre et sont souvent trouvés dans les agglomérats. Il est recommandé d'utiliser les cellules jusqu'à passage 38.
  5. Pour arrêter trypsinisation ajouter 17 ml de milieu. Resuspendre les cellules par pipetage de haut en bas et de transférer la suspensiondans un tube de 50 ml. Centrifuger à 50 xg pendant 10 min à température ambiante.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de milieu et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
    Remarque: La concentration des cellules remises en suspension HIBCPP doit être de 1 x 10 6 cellules / ml. Pour le maintien de cellules HIBCPP il est proposé de transférer une quantité de 1-6 x 10 6 cellules dans 10 ml de milieu dans un flacon T75,. Changer le milieu tous les deux jours.

3. Semis cellulaire Inversé Culture Filter Inserts avec cellules HIBCPP

  1. Au - dessus de chaque cartouche de filtre inversé ( à savoir le côté inférieur du filtre) , ajouter 80 pl de suspension cellulaire (p. 8 x 10 4 cellules) (figure 1E).
    Remarque: Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans la suspension en inversant le tube avant l'ensemencement.
  2. Couvrir les inserts de filtre de culture ensemencé des cellules avec le couvercle de la plaque de 12 puits et transfert à l'incubateur, 37 ° C, 5% CO 2.
  3. Le premier jour, remplir 1 ml de milieu dans les puits d'une plaque de 24 puits. Soulever la culture cellulaire inserts de filtre en utilisant une pince sur la plaque de 12 puits, jeter le milieu à l' intérieur, tourner les inserts de filtre et les placer dans l'orientation standard dans la plaque 24 puits préparée (figure 1E).
  4. Placez les cellules dans un milieu frais tous les deux jours. Préparer 24 puits avec du milieu frais et transférer les inserts de filtre à elle. Remplissez inserts avec 0,5 ml de milieu frais. Vérifiez TEER tous les jours, comme décrit dans la section 4.
  5. Lorsque les valeurs TEER des cellules ensemencées sur HIBCPP inserts de culture cellulaire est supérieure à 70 Ω x cm (environ 4 jours après le semis), puis continuer la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d'insuline. Préparer des plaques à 24 puits avec 1 ml de milieu pour chaque puits. Transfert inserts de filtre pour les puits préparés et moyen d'échange dans le compartiment supérieur.
    Remarque: Ce retrait de sérum après la confluence conduit à la formation deun potentiel de membrane supérieur.
  6. milieu Aspirer du compartiment de filtration, transfert au bien préparé et remplir avec 500 ul de milieu. Répétez cette étape une fois. Mettez les cellules pendant la nuit dans l'incubateur, 37 ° C, 5% de CO 2.

4. Mesure de la résistance électrique transépithélial (TEER)

  1. Immerger les pointes d'électrodes de voltohmmeter de tissu épithélial pendant 15 min dans 80% d'éthanol. Transfert voltohmmeter sous le capot et laisser électrode sèche pendant un moment. Placer l'électrode dans un milieu de culture respectif utilisé pour les cellules pendant encore 15 minutes pour atteindre l'équilibre.
  2. Effectuer des mesures en positionnant le bras le plus long de l'électrode, de façon à ce qu'elle touche le fond du compartiment inférieur à chaque fois, placer le bras le plus court dans le compartiment de cartouche de filtre.
    Note: Les valeurs de résistance de culture cellulaire inserts filtrants sans cellules dans le milieu doit être utilisé en tant que valeurs vides ((valeur mesurée (Ω) - valeur à blanc (Ω)) x filtrela surface ( à savoir 0,33 cm)).
  3. Après avoir mesuré lieu l'électrode arrière dans 80% d'éthanol pendant 15 min. Conserver dans un tube sec.

5. Détermination de la perméabilité paracellulaire

  1. Dissoudre 1 g de FITC-inuline dans 200 ml de milieu de culture supplémenté avec 5 pg / ml d'insuline à 1% de FCS. Appliquer 50 pg / ml de la solution dans le compartiment supérieur du filtre avant l'infection des cellules.
  2. Après l'infection de prélever des échantillons de la moyenne inférieure et de déterminer combien inuline passé du compartiment du filtre à travers la couche cellulaire.
  3. Préparer une solution standard FITC Inuline et effectuer des dilutions 1: 2, 10 fois (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% et 0%) . Déterminer la fluorescence par la mesure de tous les échantillons dans un lecteur de microplaques.

6. Préparation des bactéries pour l'infection de cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts

  1. Un jour avant l'expérience, scrape til N. congelé meningitidis souches hors glycérol-stock et strie sur Chocolate Agar avec Vitox. Croître pendant une nuit dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  2. Extraire 20-30 colonies de la culture pendant une nuit et transférer dans un tube contenant 8 ml Proteose Peptone milieu additionné de 0,042% de NaHCO 3, de 0,01 M de MgCl2 et 1% Polyvitex.
  3. Agiter les bactéries pendant 1,25 heure à 220 tours par minute, 37 ° C. Sédimenter les bactéries par centrifugation à 2684 g pendant 10 min à température ambiante. Rejeter le surnageant et resuspendre le culot bactérien avec un milieu sans sérum 8 ml. Vortex pour assurer une suspension uniforme.
  4. Pour déterminer la densité de la culture, mesurer une dilution de 1:10 à une densité optique (DO) de 600 nm. Ajuster la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,1.
    Remarque: Cette suspension contient environ. 1 x 10 8 CFU / ml.
  5. Pour confirmer que la concentration de cellules bactériennes, on dilue la suspension par étapes (1:10) jusqu'à unedilution de 10 -5 et plaque sur des plaques de gélose chocolat.
    Remarque: des dilutions en série similaires doivent être effectuées pour calculer les courbes de croissance bactérienne.

7. Infection des cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts et détermination de bactéries Invasion par Double immunofluorescence

  1. Après avoir poursuivi la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d'insuline, de mesurer les cellules chaque jour en utilisant un voltohmmeter de tissu épithélial. Si les cellules ont atteint un TEER d'environ 500 Ω x cm², effectuer l'infection.
  2. Infecter les cellules avec la suspension bactérienne préparée à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Stockez les cellules infectées dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant la période de temps indiquée.
    Remarque: Le MOI peut être calculé en prenant en compte le nombre de cellules par culture cellulaire élément filtrant à confluence (1.21 x 10 6 cellules / cm 2).
  3. Arrêtez le infections en lavant trois fois avec du milieu sans sérum 500 ul (SFM) contenant de l'albumine de sérum bovin à 1% (BSA) appliquée sur le compartiment du filtre, 1 ml dans le compartiment inférieur.
  4. Poulie à 500 pi contenant un tampon GFD BSA à 1% dans le compartiment du filtre et 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante pour empêcher l'adhérence des anticorps dirigés contre des sites de liaison non spécifiques.
  5. Incuber avec 100 ul anticorps primaire anti- N. meningtidis α-OMP (1: 200) dans le compartiment du filtre et à 500 pi dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante.
    Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée.
  6. Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un GFD puits avec 1 ml préparée contenant 1% de BSA et de remplir le compartiment du filtre à vide SFM 500 ul contenant 1% de BSA. Répéter deux fois cette étape.
  7. Fixer les cellules avec 500 pi 4% de formaldéhyde dans le compa filtrertement, 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 10 min à température ambiante.
  8. Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un puits préparé avec 1 ml de PBS et remplir le compartiment du filtre vide avec 500 ul de PBS. Répétez cette étape une fois.
    Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit dans du PBS à 4 ° C.
  9. Coupe la culture cellulaire fixe filtre des inserts et laver avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante avec 250 ul fluorescent marqué (longueur d'onde d'excitation 594 nm) de poulet anticorps secondaire anti-lapin (1: 500) pour colorer les bactéries extracellulaires.
    Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée.
  10. Perméabiliser les cellules avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA et 0,5% de Triton X-100 pendant 1 heure à température ambiante. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA.
  11. Incuber avec 250 pi de l' anticorps primaire anti- N. meningitidis α-OMP (1: 200) pendant 30 minutes pour colorer les bactéries extra- et intracellulaires. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA.
  12. Appliquer 250 pi de marquage fluorescent (excitation de longueur d'onde 488 nm) d'anticorps secondaire (1: 500), marqué par fluorescence (excitation de longueur d'onde 660 nm) phalloïdine (1: 250) et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ( 1: 50 000) pendant 1 h à température ambiante pour colorer les bactéries extra- et intracellulaires, et les noyaux cytosquelette d'actine.
    Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée.
  13. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA. Incluez les cellules dans un milieu et conserver à 4 ° C de montage jusqu'à l'examen par microscope.
  14. Déterminer le nombre de bactéries envahies par champ prédéfini. Pour ce faire, en comptant 20 champs par membrane filtrante. Calculer le pourcentage de bactéries envahies.
    Remarque: Multipliez le nombre de bactéries moyenne des 20 champs microscopiques avec une Coeffic zoneient. Le résultat exprime la quantité de bactéries totales présentes dans un 0,33 cm² culture cellulaire élément filtrant. Diviser cette valeur par la quantité de bactéries cultivées dans un milieu pendant la durée de l'infection.

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Résultats

Nous décrivons ici la culture et l'infection des cellules HIBCPP dans un système d'insert de culture cellulaire inversée. Ce modèle nous permet d'étudier les mécanismes d'invasion et les voies de signalisation moléculaire sous - jacents du côté de la cellule basolatérale, reproduisant une situation physiologique des bactéries diffusant et entrant dans les cellules épithéliales via le flux sanguin (Figure 1).

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Discussion

Les cellules épithéliales du CP forment le BCSFB qui sépare le LCR de 2,3 sanguin. Nous avons récemment établi la lignée cellulaire HIBCPP comme un modèle humain fonctionnel du BCSFB. Les cellules présentent des fonctions de barrière importantes du BCSFB in vitro, y compris le développement d'un potentiel de membrane élevé, une faible perméabilité pour les macromolécules, ainsi que la présence de fils continus de TJs 5. Les protéines TJ contribuent à une polarité api...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD1306
12-well platesStarlabCC7682-7512
24-well platesStarlabCC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMPThis antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany)
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit)InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 PhalloidinInvitrogenA22285
Bovine serum albumine (BSA)Calbiochem12659
Chocolate agar platesBiomerieux43109
Cytochalasin DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o PhenolredGibco11039-047
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies10270106
FITC-InulinSigmaF3272
InsulinSigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
Penicillin/StreptomycinMP Biomedicals1670049
PolyvitexBiomerieux55651
Proteose peptoneBD211684
Serum-free mediumGibco10902-096
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µmGreiner662630
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterileGreiner658175
Triton X-100SigmaT8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrodeMilliporeMERSSTX00

Références

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