Une approche pour améliorer l'alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Résumé

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Résumé

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

Dans les lésions nerveuses, les proximale et distale nerveuses souches sont souvent empêchés de réalignement direct des faisceaux nerveux en raison du site de la lésion ^1-2. Normalement, les secteurs de l'axone sont composés de faisceaux hautement ordonnés et alignés d'axones qui forment des réseaux complexes de connectivité. Cependant, la régénération nerveuse est un processus chaotique due à l' alignement de l' axone mal organisé ^3-4. Par conséquent, afin de générer un nombre suffisant de régénération d'axones qui relient le site de la lésion, il est nécessaire d'induire un alignement axonale bien organisé. En outre, la....

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Protocole

Toutes les procédures pour l'isolement des cellules ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à Michigan State University.

1. Préparation des pré-étiré Surface anisotrope

1. Mélanger 10: 1 solution de base et l'agent de durcissement et de verser le mélange dans une boîte de culture tissulaire (12 cm de diamètre). Utilisez 4,900 mg de base et 490 mg d'agent de durcissement pour le mélange de réticulation totale.
2. Maintenir le mélange de gel sous vide pendant 20 minutes pour éliminer les bulles d'air.
3. Placer le mélange de gel dans le four pour un durcissement pendant un....

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Résultats

Le système de culture de cellules pré-étiré promu l' alignement de l' axone ¹⁰ DRG. neurones DRG ont été cultivées sur des surfaces pré-étirées et non étirées pendant 12 jours. Les axones ont été colorées pour β-III-tubuline pour démontrer leur alignement. La figure 2 compare l' orientation des axones sur les PDMS pré-étirées et non étirées substrats après 12 jours de culture. Les axones DRG alignés parallèlement à la dire.......

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Discussion

Pour induire l'alignement axone sur la surface pré-étiré, il y a deux étapes essentielles: 1) la membrane PDMS doit être plat et d'épaisseur homogène; et 2) les cellules gliales doivent être retirés de la DRG. Après le mélange des PDMS et réticulant et le durcissement dans un four, le gel de PDMS réticulé doit être conservé sur un dessus de banc plat et manipulé avec précaution pour éviter tout basculement. Le traitement par plasma d'oxygène de la membrane PDMS doit être suivie dans les .......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.