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Résumé

Nous présentons un protocole pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation site unique mutagenèse complets de protéines en utilisant le séquençage à haut débit. Fait important, cette approche utilise des paires d'amorces orthogonales pour multiplexer la construction et le séquençage bibliothèque. Les résultats représentatifs en utilisant TEM-1 β-lactamase sélectionnée à une dose cliniquement pertinente de l'ampicilline sont fournis.

Résumé

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Introduction

Mutagenèse a longtemps été employé dans le laboratoire pour étudier les propriétés des systèmes biologiques et de leur évolution, et pour produire des protéines ou des organismes mutants avec des fonctions améliorées ou nouvelles. Alors que les premières approches comptaient sur ​​les méthodes qui produisent des mutations aléatoires dans les organismes, l'avènement de la technologie de l' ADN recombinant a permis aux chercheurs d'introduire certains changements à l' ADN d'une manière spécifique au site, ie., La mutagenèse dirigée 1,2. Avec les techniques actuelles, typiquement en utilisant des oligonucléotides mutagènes dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR), il est relativement facile de créer et d' évaluer de petits nombres de mutations (par ex., Mutations ponctuelles) dans un gène donné 3,4. Il est beaucoup plus difficile mais quand les approches de but, par exemple, la création et l'évaluation de tous à un seul site possible (ou d'ordre supérieur) mutations.

Alors que beaucoup a été appris par les premières études qui tentent d'évaluer un grand nombre de mutations dans les gènes, les techniques utilisées étaient souvent laborieux, nécessitant par exemple l'évaluation de chaque mutation en utilisant indépendamment un non - sens suppresseur souches 5-7, ou ont été limités dans leur capacité quantitative en raison de la faible profondeur de Sanger séquençage 8 de séquençage. Les techniques utilisées dans ces études ont été largement supplanté par des procédés utilisant à haut débit la technologie de séquençage 9-12. Ces approches conceptuellement simples impliquent la création d' une bibliothèque comprenant un grand nombre de mutations, en soumettant la bibliothèque à un écran ou à la sélection pour la fonction, puis profonde séquençage (ie., De l'ordre de> 10 6 séquençage lit) la bibliothèque obtenue avant et après la sélection. De cette manière, les effets phénotypiques ou en forme d'un grand nombre de mutations représentées par la variation de fréquence de population de chaque mutant, peut être évalué simultanément, et de manière plus quantitative.

Nous avons déjà mis en place un simp(. -à- dire, protéine entière bibliothèques saturation de mutagenèse) approche le pour évaluer les bibliothèques de tous les possibles mutations d'acides aminés simples dans les protéines, applicable à des gènes d'une longueur plus longue que le séquençage lu longueur 11,13: Tout d' abord, chaque position d'acide aminé est randomisée par site dirigé PCR mutagène. Pendant ce processus, le gène est divisé en groupes composés de positions contiguës d'une longueur totale reçue par la plateforme de séquençage. Les produits de PCR mutagenes pour chaque groupe sont ensuite combinées et soumises à chaque groupe indépendamment de la sélection et le séquençage à haut débit. En maintenant une correspondance entre la localisation des mutations dans la séquence et la longueur séquençage de lecture, cette approche présente l'avantage de maximiser la profondeur de séquençage: alors que l' on pourrait tout simplement la séquence de ces bibliothèques dans les fenêtres courtes sans se diviser en groupes (par exemple, par un fusil standard. approche de séquençage), la plupart se lit obtenu serait de type sauvage et donc la majorité de séquençage débit gaspillé (par exemple, pour une bibliothèque mutagenèse à saturation protéine entière d'une protéine d'acide 500 aminé séquencé dans 100 acides aminés (300 pb) de fenêtres, au minimum 80% de lit sera la séquence de type sauvage).

Ici, un protocole est présenté qui utilise le séquençage à haut débit pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation mutagenèse-protéine entière, en utilisant l'approche ci - dessus (présenté sur la figure 1). Surtout, nous introduisons l'utilisation d'amorces orthogonales dans le processus de clonage bibliothèque à code-barres de chaque groupe de séquences, ce qui leur permet d'être multiplexés dans une bibliothèque, soumis simultanément à un dépistage ou à la sélection, puis démultiplexé pour le séquençage en profondeur. Etant donné que les groupes de séquences ne sont pas soumises à une sélection de façon indépendante, ce qui réduit la charge de travail et veille à ce que chaque mutation subit le même niveau de sélection. TEM-1 β-lactamase, une enzyme qui confère une résistance de haut niveau pourles antibiotiques β-lactames (par ex., à l' ampicilline) dans des bactéries est utilisé comme système modèle 14-16. Un protocole est décrit pour l'évaluation d'une saturation de banque de mutagenèse, la protéine entière TEM-1 dans E. coli sous sélection à un niveau sérique approximatif d'une dose clinique de l' ampicilline (50 pg / ml) 17,18.

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Protocole

Note: Voir la Figure 1 pour les grandes lignes du protocole. Plusieurs étapes et des réactifs dans le protocole nécessitent des mesures de sécurité (indiquées par «ATTENTION»). Consulter les fiches de données de sécurité avant utilisation. Toutes les étapes du protocole sont effectuées à la température ambiante, sauf si d'autres ont indiqué.

1. Préparer la culture des médias et plaques

  1. Et stériliser par autoclavage 1 L d' eau purifiée, 100 ml de Super Broth optimale (SOB; Tableau 1), 1 L de bouillon de Luria-Bertani (LB; tableau 2) et 1 L de LB-agar (Tableau 3). Préparer séparément et stériliser trois flacons de culture contenant chacun 1 L LB.
    Remarque: Dans le protocole «eau» se réfère à l'autoclave stérilisé l'eau purifiée; SOB, LB et LB-agar se réfèrent aux solutions de l'autoclave stérilisé.
  2. Préparer un 12 mg / stock ml de Tet en dissolvant 0,12 g de chlorhydrate de tétracycline dans 10 ml d'éthanol à 70%. Stériliser en utilisant un filtre de 0,2 um et magasinà 4 ° C à l'abri de la lumière.
  3. LB-agar Refroidir à 50 ° C puis ajouter 1 ml de Tet stocks (concentration finale de 12 pg / ml Tet). Verser dans des boîtes de Pétri et laisser refroidir à la température ambiante à l'abri de la lumière. Conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière.

2. Construction du Tout-gène Saturation mutagenèse Bibliothèque

Note: Amorces; RFP terminée, les digestions de restriction et ligatures; et les échantillons d'ADN purifiés peuvent être conservés à -20 ° C.

  1. La conception d' amorces de mutagénèse
    1. Pour mutagenèse chaque position d'acide aminé à tous les acides aminés possibles, concevoir une paire d'amorces de mutagenèse complémentaires (sens / antisens avant et / arrière) pour chaque position d'acide aminé avec les lignes directrices suivantes:
      1. Replacer le codon correspondant à l'acide aminé devant être soumis à une mutagenèse par NNS (où N est un mélange de quatre bases nucléotidiques et S est un mélange de cytosine (C) et guanine (G)) et le centre de la primer, flanqué d'environ 15 nucléotides de chaque côté.
      2. Faire en sorte que l'extrémité 5 'et 3' se terminent par C ou G , et que la température de fusion (Tm) est d' environ 70 ° C 3. Utilisez le NNS_PrimerDesign.m script de calcul (voir le fichier de code supplémentaire) pour concevoir NNS amorces de mutagenèse selon ces directives.
    2. Ordre des amorces provenant d'une source commerciale. Pour faciliter l'utilisation, les ont synthétisés sous forme de plaque de 96 puits et pré-dilué dans l'eau à 50 uM, avec un ensemble de plaques contenant les amorces de mutagénèse sens et une autre, les amorces antisens.
    3. Remplir un bassin de pipette à l'eau et utiliser une pipette multicanaux pour transférer 95 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits. Diluer les amorces 20 fois à 2,5 pM en utilisant une pipette à canaux multiples pour transférer 5 pi à partir des plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse sens dans les puits des plaques parentes contenant de l'eau.
    4. Répéterprotocole étape 2.1.3 pour diluer les amorces antisens de mutagenèse.
  2. Synthèse du NNS sous-bibliothèques pour chaque position d'acides aminés par PCR en deux étapes mutagenèse dirigée
    1. Effectuer la première ronde PCR mutagène. Pour chaque amorce de mutagenèse, préparer une réaction PCR de 25 ul en utilisant pBR322_AvrII plasmidique comme matrice et des amorces AatII_F ou AvrII_R (amorces sens de mutagenèse appariés avec l'amorce AvrII_R, et antisens amorces de mutagenèse appariés avec l'amorce AatII_F; total de 526 RFP). Voir le tableau des matériaux pour les séquences AatII_F et AvrII_R.
      1. Préparer une PCR "mélange maître" en ajoutant les réactifs du tableau 4 dans un tube conique de 15 ml. Transférer vers un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 15 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits PCR. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 10 pi à partir des plaques à 96 puits contenant les amorces sens de mutagenèse dilué dans les puits parentes in les plaques PCR.
      2. Couvrir chaque plaque PCR avec un joint de plaque de 96 puits. Centrifuger à 200 g pendant 2 min.
      3. Transférer les plaques PCR pour thermocycleur et exécuter le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 20 cycles: 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C.
      4. Protocole répéter les étapes 2.2.1.1 - 2.2.1.3 pour les plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse antisens dilué.
    2. Procédez de second tour RFP mutagène. Pour chaque position d'acides aminés, de préparer une 25 ul de réaction PCR en utilisant des amorces et AatII_F AvrII_R et le mélange et on dilue les produits de PCR mutagenes du premier tour comme matrice (un total de 263 RAP).
      1. Remplir un bassin de pipette à l'eau et utiliser une pipette multicanaux pour transférer 198 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits.
      2. Combiner et diluer 100 fois les produits de PCR mutagenes pour chaque position d'acides aminés à l'aide d'une pipette multicanaux pour1 ul premier transfert à partir des plaques à 96 puits de PCR contenant les produits de PCR obtenus à partir des amorces de mutagénèse sens dans les puits des plaques parentes contenant de l'eau. Ensuite, répétez le transfert pour les produits de PCR obtenus à partir des amorces antisens de mutagenèse.
      3. Préparer une PCR "mélange maître" en ajoutant les réactifs du tableau 5 dans un tube conique de 15 ml. Transférer vers un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 24 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits PCR. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 1 pi des plaques à 96 puits contenant le mélange et dilué au premier tour des produits de PCR mutagène dans les puits parentes dans les plaques PCR.
      4. Couvrir chaque plaque PCR avec un joint de plaque de 96 puits. Centrifuger à environ 200 g pendant 2 min. plaques de transfert à thermocycleur et exécuter le même programme que dans le protocole étape 2.2.1.3.
    3. Analyser les résultats du second tour RFP mutagène par électrophorèse sur gel.Veiller à ce que tous les produits sont de la bonne taille et l'absence de contamination des produits.
      1. Ajouter 2 ml de 2x gel colorant de charge à un bassin de pipette, puis utiliser une pipette multicanaux pour transférer 6 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 6 pi des plaques à 96 puits PCR contenant les produits de PCR mutagène de second tour dans les puits parentes des plaques à 96 puits contenant un colorant.
      2. Préparer un gel d'agarose à 1,5% avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
      3. Charge échelle d'ADN en premier et dernier voies de chaque rangée. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour charger 10 pi d'échantillons de protocole étape 2.2.3.1.
      4. Exécutez le gel à 100 V pendant 40 min et de l'image sur un transilluminateur UV.
      5. protocole Répétez les étapes 2.2.3.2 - 2.2.3.4 jusqu'à ce que tous les échantillons sont analysés.
    4. Mesurer avec précision la concentration de chaque produit PCR sous-bibliothèque NNS utilisant un réactif de quantification dsDNA.
      1. Transfertenviron 15 ml de tampon EB à un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 49 pi à 263 puits sur trois 96 puits, des plaques noires à paroi essai fond transparent.
      2. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 1 pl de chaque produit de PCR de la seconde étape (protocole étape 2.2.2) dans les puits des plaques parentes de dosage à 96 puits.
      3. Préparer une courbe standard de la concentration d'ADN par dilution de l'ADN de phage lambda à 2 ng / ul dans du tampon EB 300 ul, puis faire dix dilutions de deux fois (pour un total de 11 concentrations). Transférer 50 ul à onze premières colonnes d'une ligne de l'une des plaques d'essai de 96 puits à partir de l'étape précédente qui ne contient aucun échantillon; à la douzième colonne ajouter 50 pi de tampon EB (réactif à blanc).
      4. Préparer dsDNA réactif de quantification en ajoutant 75 pi de réactif (voir le tableau des matériaux) à un tube conique de 15 ml, puis ajouter 15 ml de tampon EB. Mélanger en retournant le tube, puis transfert à un bassin de pipette. Protéger le réactif de la lumière.
      5. Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 50 pi de réactif préparé ADNdb de quantification à chaque puits des plaques de dosage. Mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber les plaques à température ambiante pendant 5 min à l'abri de la lumière.
      6. Mesurer la fluorescence de chaque échantillon en utilisant un lecteur de microplaques et des longueurs d'onde de fluorescéine standard (excitation 485 nm, émission 520 nm; 0,1 sec).
      7. Soustraire la valeur de la fluorescence du réactif à blanc de tous les échantillons. Générer une courbe d'étalonnage à partir des mesures de fluorescence d'échantillons de phage lambda. Calculer la concentration de chaque échantillon en utilisant les mesures de fluorescence respectifs et la courbe standard.
  3. Le clonage des bibliothèques de sous-NNS dans des vecteurs de sélection
    1. Mélanger 100 ng de chaque produit de PCR de la sous-bibliothèque NNS en cinq sous-groupes de bibliothèque NNS. En suivant les instructions du fabricant, nettoyer les échantillons en utilisant un kit de purification d'ADN et ensuite mesurer la concentration en utilisant un dsle réactif de quantification d'ADN.
      Remarque: chaque groupe est constitué des acides aminés d'environ 53 contigus des positions espacées le long de la séquence TEM-1 (groupes NNS la sous-bibliothèque: 1 - 5 sont constitués de positions 26-78, 79-132, 133-183, 184-236 et 237-290, respectivement; numérotation selon Ambler et al 19)..
    2. Créer des vecteurs de clonage pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS.
      1. Préparer cinq 100 ul PCR selon le tableau 6, en utilisant des amorces et AvrII_F AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, et les plasmides pBR322_OP1-5 comme matrice (AatII_OP1_R couplé à pBR322_OP1, etc.).
      2. Transfert à thermocycleur et exécuter le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 25 cycles: 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1,5 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C. Voir T able des matériaux pour des séquences de AatII_R et AvrII_F.
      3. Préparer un gel d'agarose à 1%, avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
      4. Ajouter 20 pi de 6x gel colorant de charge à chaque échantillon PCR. Chargez la première piste du gel avec l'échelle de l'ADN; charger volume entier de chaque échantillon, en sautant au moins un puits entre les échantillons.
      5. Exécutez gel à 100 V pendant 50 min.
      6. Visualisez gel en utilisant un illuminateur UV longueur d'onde (ATTENTION). tranches d'accise contenant le produit PCR à ~ 3500 pb; transférer à séparer des tubes de microcentrifugation. Des tranches de gel peuvent être conservés à -20 ° C.
      7. En suivant les instructions du fabricant, de purifier les échantillons en utilisant un kit d'extraction de gel et de la concentration de mesure en utilisant un réactif de quantification dsDNA.
    3. Pour les deux groupes NNS sous-bibliothèque (protocole étape 2.3.1) et des vecteurs de clonage (protocole étape 2.3.2), mis en place avec des enzymes de restriction digère Aatll et AvrII selon la T ableau 7. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. En suivant les instructions du fabricant, nettoyer les échantillons en utilisant un kit de purification d'ADN et ensuite mesurer la concentration en utilisant un quantita dsDNARéactif tion.
    4. Mettre en place des réactions de ligature suivant le tableau 8 pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS restriction digéré avec le vecteur de restriction digéré le clonage apparenté (sous-bibliothèque groupe NNS 1 avec pBR322_OP1, etc.). Incubation à température ambiante pendant 1 heure. Nettoyer les réactions utilisant un kit de purification d'ADN selon les instructions du fabricant; éluer l'ADN avec 20 pi d'eau.
    5. Transformer l'ensemble des réactions de ligature purifiés dans la bibliothèque efficace E. cellules coli par électroporation.
      1. Thaw électrocompétentes E. cellules coli, puis les cellules de lieu et des réactions de ligature purifiés sur la glace.
      2. Transférer 10 ul décongelés cellules à chaque réaction de ligature purifié, puis transfert à cuvette d'électroporation. Électroporation à 1,8 kV.
      3. Récupérer les cellules par remise en suspension dans 1 ml SOB. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
      4. Resuspendre 10 pi de chaque culture de récupération dans 990 ul LB; étaler 100 pi sur LB-gélose contenant 12 pg / ml Tet. Incuber les plaques O / N (~ 16 h) à 37 ° C.
      5. Pour chaque culture de récupération, préparer un flacon de culture de 250 ml avec 50 ml de LB et 50 pl Tet stock. Transfert dans le ballon les ~ 1 ml restants de la culture de récupération. Incuber O / N (~ 16 h) à 37 ° C avec agitation vigoureuse (~ 200 rpm).
    6. Compter le nombre de colonies sur chaque plaque. Calculer le nombre de transformants réussis que figure-protocol-14165 , où figure-protocol-14244 est le nombre de colonies, figure-protocol-14339 est le volume de culture de récupération (1000 pi), et figure-protocol-14468 est le volume de la culture de recouvrement en métal (1 ul).
      Remarque: Pour assurer une couverture complète de toutes les mutations, en règle générale le nombre de transformants devrait être ≥100 fois par rapport au nombre de mutations attendues. Chaque sous-bibliothèque NNS a ~ 53 positions, de sorte que le nombre attendu de mutations est de 53 positions x 32 codons / position de ≈ 1,7 × 10 3; pour donner une taille de bibliothèque ≥100 fois (≥1.7 × 10 5) il devrait y avoir ≥170 colonies sur chaque plaque.
    7. Selon les instructions du fabricant, isoler l'ADN plasmidique à partir de cultures en utilisant un kit de purification de plasmide puis de mesurer la concentration en utilisant un réactif de quantification ADNdb. Mélanger 100 ng de chaque plasmide. Cela crée la bibliothèque finale la protéine entière mutagenèse à saturation.

3. Sélection du TEM-1 entier protéines Saturation mutagenèse Library pour la résistance aux antibiotiques

  1. Préparation de la culture pré-sélection.
    1. Diluer le plasmide de protocole 2.3.7 à 0,5 ng / ul dans l'eau et transférer 20 pi à un tube de microcentrifugeuse. Effectuer la transformation, redécouverte, le placage et O / N croissance comme décrit précédemment dans le protocole de l'étape 2.3.5, à l'exception de transfert 1 ul de la culture de récupération SOB à 999 ul LB.
    2. Compter le nombre de colonies. Pour assurer une couverture complète de toutes les mutations qu'il devrait y avoir ≥100 colonies, indiquant ≥10 6 transformants réussis (100 × 263 × 32 positions codons / Position ≈ 10 6).
    3. Mesurer la concentration de 50 ml d'O / N culture.
      1. Préparer une ébauche de LB en ajoutant 1 ml de LB dans une cuvette de spectrophotomètre. Mesurer la DO600 sur un spectrophotomètre.
      2. Diluer le / N culture 10 fois O par remise en suspension 100 pi dans 900 LB. ul Mesurer la DO600. Soustraire la lecture de DO600 de l'ébauche et multiplier par 10 pour donner la DO600 de la culture O / N.
    4. Préchauffer les trois flacons de culture de protocole étape 1.1 pour ~ 30 min à 37 ° C. Diluer la culture O / N à DO600 = 0,1 et ajouter 1 ml d'une fiole (DO600 finale = 0,001). Tla sienne est la «culture pré-sélection".
    5. Incuber la "culture pré-sélection" à 37 ° C avec agitation vigoureuse (200 rpm). Périodiquement surveiller la croissance en mesurant DO600 que dans le protocole étape 3.1.3 (il est nécessaire de diluer la culture 10 fois) jusqu'à DO600 = 0,1 (~ 2,5 h).
    6. Transférer 100 ml de la culture pré-sélection à deux 50 ml tubes coniques. Centrifuger à 4000 g pendant 6 min à 4 ° C. Retirer le plus de surnageant et de combiner en un seul 15 tube conique. Répéter centrifugation et enlever tout surnageant. Conserver à -20 ° C.
  2. La sélection pour la résistance à l'ampicilline.
    1. Bien que la culture pré-sélection est en phase d'incubation, préparer un 50 mg / ml stock d'Amp dans l'eau par dissolution de 0,5 g d'ampicilline de sodium dans 10 ml d'eau. Stériliser à l'aide d'un filtre et un magasin de 0,2 um à 4 ° C.
    2. Les deux autres flacons, ajouter Tet à une concentration finale de 12 pg / ml et un volume de pré-culture telle sélection tha t la DO600 finale = 0,001. Pour un flacon, ajouter 1 ml Amp, pour une concentration finale de 50 pg / ml - ce qui est la «culture de sélection".
    3. Incuber les cultures à 37 ° C avec agitation vigoureuse (200 rpm). Surveiller la croissance de la culture pour laquelle aucune ampicilline a été ajoutée à l'étape précédente, jusqu'à DO600 = 0,1 (~ 2,5 h). A ce moment, mesurer également la DO600 de la culture de sélection.
    4. Divisez la DO600 de la culture de sélection dans 0,1 et multiplier par 100 ml. Transférer ce volume (~ 400 ml) à 50 ml tubes et centrifuger coniques à 4000 g pendant 6 min à 4 ° C. Retirer le plus de surnageant et de combiner en un seul 15 tube conique. Répéter centrifugation et enlever tout surnageant.
    5. Selon les instructions du fabricant, isoler l'ADN plasmidique de la pré-sélection (protocole étape 3.1.6) et de sélection (protocole étape 3.2.4) des culots de cellules de culture et ensuite mesurer les concentrations en utilisant un réactif de quantification dsDNA.
tle "> 4. à haut débit de séquençage pour déterminer les effets de remise en forme de mutations

  1. Préparation des échantillons pour le séquençage à haut débit
    1. Préparer 25 RFP pi à dé-multiplexer les groupes NNS sous-bibliothèque avec des amorces orthogonales
      1. Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9; transférer 23 pi à dix tubes PCR.
      2. Ajouter 1 pi de 0,5 ng d'ADN plasmidique / ul purifié à partir de la culture pré-sélection de tubes PCR 1 - 5 et de la culture de sélection de tubes 6 - 10.
      3. Mélanger 50 pi de 50 uM avant amorces orthogonales OP1_F - OP5_F avec le respectif inverse amorces orthogonales OP1_R - OP5_R. Dans le même ordre, le transfert 1 pi à tubes PCR 1 - 5 et 6 - 10. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de OP1_F - OP5_F et OP1_R - OP5_R.
      4. Transfert tubes PCR pour thermocycleur. Exécutez le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 20 cycles: 98 ° C pendant 10 sec, 55 °; C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1,5 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C.
    2. Préparer 25 pi PCR pour isoler chacun des groupes de sous-bibliothèques NNS
      1. Diluer 100 fois les RFP dix de protocole étape 4.1.1.4 en transférant 1 pi de chacun pour séparer les tubes de PCR et en ajoutant 99 pi d'eau. Mix, puis pipetez sur 99 pi et jeter.
      2. Mélanger 50 pi de 50 uM amorces sens Group1_F - Group5_F avec les amorces respectives inverse Group1_R - Group5_R. Dans le même ordre, transfert 1 pl de PCR tubes 1 - 5 et 6 - 10. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de Group1_F - Group5_F et Group1_R - Group5_R.
      3. Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9, transférer 23 pi à chaque tube PCR. Transfert tubes PCR pour thermocycleur; exécuter le même programme que dans le protocole étape 2.2.1.3.
    3. Effectuer les 25 derniers RFP ul d'ajouter des séquences d'indexation
      1. Diluth 100 fois les RFP dix de protocole étape 4.1.2.3 en transférant 1 pi de chacun pour séparer les tubes de PCR et en ajoutant 99 pi d'eau. Mix, puis pipetez sur 99 pi et jeter.
      2. Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9, transférer 23 pi à chaque tube PCR.
      3. Pour les tubes avec la matrice provenant de sous-groupes bibliothèque NNS 1-5, transférer 501_F 0,5 pl par tube amorces sens - 505_F respectivement. Pour les tubes avec la matrice résultant de la présélection et de sélection des cultures, transférer 0,5 pl par tube inverse amorces 701_R et 702_R, respectivement. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de 501_F - 505_F et 701_R et 702_R.
      4. Transfert tubes PCR pour le thermocycleur et exécuter le programme de l'étape 2.2.1.3.
    4. Mélanger et purifier des échantillons
      1. Les concentrations de Mesure à l'aide d'un réactif de quantification ADNdb selon les instructions du fabricant. Mélanger 100 ng de chaque produit int PCRoa seul tube à centrifuger.
      2. Préparer un gel d'agarose à 2% avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
      3. Ajouter 6x colorant de chargement de gel au mélange PCR produits échantillon. Chargez la première piste du gel avec l'échelle de l'ADN; charger tout le volume de l'échantillon.
      4. Exécutez gel à 100 V pendant 50 min. Visualisez gel en utilisant un illuminateur UV longueur d'onde (ATTENTION). tranche d'accise contenant le produit PCR à ~ 360 pb; transfert à microcentrifugation tube. Gel tranche peut être conservé à -20 ° C.
      5. En suivant les instructions du fabricant, de purifier l'échantillon en utilisant un kit d'extraction de gel et de mesurer la concentration en utilisant un réactif de quantification dsDNA. Ceci est l'échantillon final pour le séquençage à haut débit.
    5. Séquence sur une plate - forme de séquençage à haut débit (voir le tableau des matériaux pour la plate - forme utilisés dans ce protocole).
      1. Calculer la concentration de l'échantillon en nM comme figure-protocol-23271, Où figure-protocol-23348 est la concentration de l'échantillon en ng / pl et figure-protocol-23478 est la longueur de la séquence de l'échantillon d'ADN (~ 360 pb). Diluer l'échantillon à 4 nM dans un tampon EB.
      2. Suivez les instructions du fabricant pour dénaturer l'échantillon et diluer à 21 heures dans un tampon d'hybridation.
      3. Charge à 600 pi d'échantillon dans la cartouche de réactif. Séquence suivant les instructions du fabricant et les invites à l'écran.
  2. L' analyse des données de séquençage
    1. Téléchargez Flash (Fast Réglage de la longueur du court lit) 20, placer dans le dossier ainsi que les fichiers fastq.gz obtenus à partir de séquençage.
    2. Utilisez le flash pour joindre les fichiers fastq.gz correspondant à la fin appariés lit pour chaque paire d'indices (avant et arrière lectures pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS pour les pré-sélection et de sélection des cultures).
      1. Ouvrez l'invite de commandes et modifiez le répertoire dossier dans le protocole étape 4.2.1. Joignez-vous à chaque paire de lectures en utilisant la commande: Flash , où mates1.fastq.gz et mates2.fastq.gz sont les fichiers contenant l'avant et arrière se lit, respectivement.
    3. Après avoir rejoint chaque paire de lectures, placez le fichier de sortie out.extendedFrags.fastq dans des dossiers séparés pour les résultats de la présélection ou de sélection des cultures. Renommez le fichier de sortie out.extendedFrags.fastq selon le sous-groupe de la bibliothèque NNS à laquelle elle correspond (ie., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
    4. Exécutez le NNS_DataAnalyzer.m script de calcul (voir le fichier de code supplémentaire) de chaque dossier pour calculer les chiffres pour chaque mutation d'acide aminé unique, et les chiffres pour le type sauvage, pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS.
    5. Calculer l'effet de remise en forme figure-protocol-25511 de chaque mutation figure-protocol-25604 à chaque position figure-protocol-25701 comme le logarithme de base dix du rapport des comptages obtenus lors de la sélection ( figure-protocol-25859 ) En fonction de la pré-sélection ( figure-protocol-25965 ) État, par rapport au type sauvage:
      figure-protocol-26078 .

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Résultats

La carte de plasmide pour les cinq plasmides pBR322 modifié contenant des sites d'amorçage orthogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) est représentée sur la figure 2A. Pour tester si les amorces sont spécifiques orthogonales, PCR ont été réalisées en utilisant des amorces de chaque paire individuellement orthogonaux, ainsi que l'ensemble des cinq plasmides pBR322_OP1-5 ou avec tous les plasmides moins le plasmide correspondant à la paire d'amorces ortho...

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Discussion

Ici, un protocole est décrit pour effectuer l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques de mutagenèse à saturation de protéine entière, en utilisant la technologie de séquençage à haut débit. Un aspect important du procédé est l'utilisation d'amorces orthogonales au cours du processus de clonage. En bref, chaque position d'acide aminé est aléatoire par PCR mutagène et mélangés ensemble dans des groupes de positions dont la longueur séquence combinée est reçue par séquençage à hau...

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Déclarations de divulgation

The authors declare they have no competing financial interests

Remerciements

R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
TyptoneResearch Products Intl. Corp.T60060-1000.0
Yeast extractResearch Products Intl. Corp.Y20020-500.0
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333-500G
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506-500G
AgarFisher ScientificBP1423-500
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660-5G
Petri platesCorning351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrIIavailable upon requestpBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5available upon requestfive modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0491Lincludes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tubeCorning430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
PCR plate, 96 wellFisher Scientific14230232
96 well plate sealExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well thermal cyclerApplied Biosystems4375786
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
Ethidium bromideBio-Rad161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96-well black-walled, clear bottom assay platesCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA reagentInvitrogenP7581dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate readerPerkinElmer
DNA purification kitZymo ResearchD4003
Microcentrifuge tubesCorning3621
Long-wavelength UV illuminatorFisher ScientificFBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction bufferZymo ResearchD4001-1-100
AatIINew England BiolabsR0117S
AvrIINew England BiolabsR0174L
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
EVB100 electrocompetent E. coliAvidityEVB100
Electroporator (E. coli Pulser)Bio-Rad1652102
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
50 ml conical tubesCorning430828
Plasmid purification kitMacherey-Nagel740588.25
8 well PCR strip tubesAxygen321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32854dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Qubit fluorometerInvitrogenQ32866
Ampicillin sodium saltAkron Biotechnology50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
MiSeq desktop sequencerIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlalternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh softwareJohn Hopkins University - open sourcehttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

Références

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