JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.

Résumé

Étant donné que les cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel ont le potentiel pour combler de nombreuses lacunes de culture cellulaire dans des milieux 2-D (par ex., Des flacons ou des boîtes). En fait, il est largement reconnu que les cellules cultivées dans des flacons ou des plats ont tendance à dé-différencier et de perdre des fonctions spécialisées des tissus à partir de laquelle ils ont été dérivés. À l'heure actuelle, il existe principalement deux types de systèmes de culture 3-D où les cellules sont ensemencées dans des échafauds mimant la matrice native extracellulaire (ECM): (a) les modèles statiques et (b) les modèles utilisant des bioréacteurs. La première percée a été les modèles statiques 3-D. modèles 3-D en utilisant des bioréacteurs tels que le mur-récipient rotatif (RWV) bioréacteurs sont un développement plus récent. Le concept original des bioréacteurs RWV a été développé au Centre spatial Johnson de la NASA au début des années 1990 et est censé pour surmonter les limitations des modèles statiques tels que le développement des hypoxiques, des noyaux nécrotiques. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner thest le problème en fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l'oxygène. Ces bioréacteurs sont constitués d'une base de la coiffe qui sert à supporter et faire tourner deux formats différents de récipients de culture qui diffèrent par leur type de source d'aération: (1) Lent Turning navires latéraux (STLVs) avec un oxygénateur de co-axiale dans le centre, ou (2 ) rapport d'aspect élevé des navires (Harvs) avec l'oxygénation via une membrane de transfert de gaz en caoutchouc de silicone plat. Ces navires permettent le transfert de gaz efficace tout en évitant la formation de bulles et de la turbulence conséquente. Ces conditions se traduisent par un écoulement laminaire et de la force de cisaillement minimale que les modèles réduits gravité (microgravité) à l'intérieur du récipient de culture. Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes cultivés en microgravité fourni par le bioréacteur RWV. </ P>

Introduction

La première percée dans la construction d' un modèle 3-D a été signalé au début des années 1980 , lorsque les scientifiques ont commencé à étudier les différents types de l'échafaudage (par exemple., La laminine, le collagène de type I, le collagène IV, et la fibronectine) et des cocktails de facteurs de croissance pour améliorer cellule à cellule interactions ECM de modèles 3-D "statique" et 1-7. Depuis lors, le principal problème avec ces modèles a été limitations dans le transfert des nutriments et de l' oxygène dans les moyennes et les tissus des constructions 8. Contrairement aux cellules dans l'environnement in vivo , qui reçoit un flux continu de nutriments et de l' oxygène à partir de réseaux de vaisseaux sanguins environnants, la nature statique de ces modèles entrave la distribution effective d'entre eux aux cellules. Par exemple, des agrégats de cellules générées dans des modèles in vitro statiques qui dépassent de quelques millimètres de taille invariablement développer hypoxiques, des noyaux nécrotiques 9. Les bioréacteurs RWV pourraient contourner ce problèmeen fournissant la dynamique des fluides qui permettent la diffusion efficace des nutriments et de l' oxygène 12/10. Cependant, à ce jour, le travail en utilisant bioréacteurs RWV ont été limités à l'inclusion d'un ou de deux types de cellules 13-17. En outre, au lieu d'une orientation spatiale similaire aux tissus natifs, ces cellules forment des agrégats cellulaires. La principale raison de ces limitations a été l'absence d'un échafaudage en mesure d'intégrer des cellules d'une manière intégrée. Les échafaudages utilisés dans les bioréacteurs RWV à ce jour consistent, à quelques exceptions près 16-18, principalement des microbilles synthétiques, des cylindres tubulaires ou petites feuilles 13-15,19-23. Ce sont des matériaux rigides dont la composition et la flexibilité ne peut être manipulé et auquel les cellules sont attachées à leur surface. Par conséquent, il est peu probable que ces modèles vont fournir un système permettant d'évaluer, de façon intégrée, les différents composants cellulaires tels que des cellules stromales (par ex., Des fibroblastes, des cellules immunitaires et endothéliales) qui should être dispersé dans l'échafaudage pour imiter étroitement le tissu humain.

Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine composée d'une ligne intestinale des cellules épithéliales et les lymphocytes humains primaires, les cellules endothéliales et les fibroblastes 24. Ces cellules ont été cultivées en microgravité fournir par le bioréacteur RWV 13,25-30. Dans notre modèle 3-D, l'ECM possède plusieurs propriétés distinctes, comme une osmolalité similaire à celle du milieu de culture (par ex., Des contraintes diffusionnelles négligeables au cours de la culture) et la capacité d'incorporer des cellules et d' autres protéines de la matrice extracellulaire concernées, ainsi que de la la rigidité appropriée pour être utilisée dans des bioréacteurs 24. Les systèmes biologiques sont très complexes, et au cours des dernières années, il y a eu un changement d'orientation de la recherche de la muqueuse vers l'examen des interactions cellulaires avec leur environnement plutôt que de les étudier dans isolation. En particulier, l'importance des interactions entre les cellules en influençant la survie des cellules intestinales et la différenciation est bien documentée 31-34. Plus précisément, la communication entre les cellules épithéliales et leur niche a une profonde influence sur l'expansion des cellules épithéliales et la différenciation 35. En effet, il est largement admis que non seulement la cellule à cellule, mais aussi des interactions cellule-ECM sont essentiels pour le maintien et la différenciation des cellules épithéliales dans des modèles de culture 3-D. Des études antérieures ont démontré que les protéines d'ECM intestin telles que le collagène I 24,36,37, 38 laminine et la fibronectine 39 jouent un rôle décisif pour influencer les cellules épithéliales intestinales d'acquérir une orientation spatiale similaire à la muqueuse naturelle. Ainsi, le développement de nouvelles technologies, comme notre modèle 3-D 24, qui peut imiter la diversité phénotypique de l'intestin est nécessaire si les chercheurs ont l' intention de recréer l'architecture cellulaire et structurale complexeet le fonctionnement du micro-environnement intestinal. Ces modèles représentent un outil important dans le développement et l'évaluation des nouveaux médicaments par voie orale et des vaccins candidats.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Déclaration éthique: Tous les échantillons de sang ont été prélevés sur des volontaires qui ont participé au numéro de protocole HP-00040025-1. L'Université du Maryland Institutional Review Board a approuvé ce protocole et a autorisé le prélèvement d'échantillons de sang provenant de volontaires sains pour les études incluses dans ce manuscrit. Le but de cette étude a été expliqué aux volontaires, et tous les bénévoles ont informé, signé le consentement avant la prise de sang.

Note: Voir le tableau 1 pour la préparation du supplément de milieu. Voir le tableau 2 pour la préparation des milieux de culture en 3-D.

1. Préparation des navires Culture

  1. Dévissez le bouchon de l'orifice de remplissage de la cuve 50 ml-et remplir avec 50 ml de milieu de culture stérile (par exemple., RPMI). Effectuer toutes les procédures dans des conditions stériles dans une hotte laminaire.
  2. Replacer le capuchon et essuyez tout support déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.
  3. Laisser le navire Incubmangé pendant au moins 15 min à O / N à la température ambiante.
  4. Utiliser le port de remplissage pour éliminer le milieu de culture et ajouter 30 ml de 3-D du milieu de culture.
  5. Essuyer tout moyen déversé sur toute surface avec 70% d'éthanol.

2. Préparation des cellules

  1. Line humaine des cellules épithéliales (HCT-8) 24,40.
    1. les cellules de la culture dans un milieu RPMI supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, HEPES 10 mM tampon et du sérum inactivé à la chaleur 10% de fœtus bovin (FBS ) (supplément 1). À 70% de confluence, les cellules divisées en une proportion de 1: 5.
  2. Fibroblastes colique humaines (cellules CCD-18Co) 24,41.
    1. Les cellules de la culture dans le milieu de Basal Aigle enrichi avec supplément 1 à confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 3..
  3. Human Umbilical Vein Endothelial (HUVEC) cellules 24,42.
    1. Les cellules de culture en Endothelial Basal Medium (EBM) milieu enrichi avec 100 pg / ml d' héparine, 3 pg / ml Endothelial Cell Growth Supplément (ECGS), et de compléter 1 à 70% de confluence, les cellules fractionnées à un rapport de 1: 2..
  4. Les lymphocytes / monocytes
    1. Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) à partir du sang par centrifugation en gradient de densité en utilisant des techniques standard 43.
      1. En bref, en utilisant une pipette de 10 ml, ajouter avec précaution 30 ml de sang dilué (1: 1 de sang: tampon phosphate salin (PBS)) dans un tube de 50 ml conique contenant 10 ml de milieu de centrifugation de densité. Après l'étape de centrifugation, les lymphocytes et les monocytes résident dans la couche de "blanc" entre le milieu de centrifugation de densité et des couches de plasma.
      2. Recueillir la couche blanche en utilisant une pipette de transfert. Éviter la contamination des granulocytes en limitant la collecte des supports de centrifugation de densité. Après le lavage de 43, use PBMC cryoconservées tel quel ou dans N2 liquide.
        Note: Il est important de souligner que les PBMC se compose essentiellement de lymphocytes et de monocytes, avec une petite proportion de cellules dendritiques et d'autres types de cellules.
  5. Cultivez toutes les cellules dans des conditions standard de culture à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO 2.

3. Préparation des cellules de collagène embarqués

  1. Déterminer le nombre d'insertions besoin en fonction du nombre de conditions expérimentales pour être mis en place. Placez le nombre approprié d'inserts dans les puits d'une plaque à 6 puits.
  2. Préparer une suspension de HUVEC et des fibroblastes:
    1. Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec 0,05% de trypsine-tétrasodique éthylènediaminetétraacétate (trypsine-EDTA). Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit généralement dans les 5 à 15 minutes,
    2. Collecteles cellules individuelles dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) -30% de FBS moyenne.
    3. Centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    5. Compter le nombre total de cellules viables en diluant 20 ul de cellules remises en suspension avec 20 pi de bleu trypan colorant. Charger le hémocytomètre avec le mélange de cellules. CMSP Viable sera blanche claire; inviable PBMC va acquérir le colorant et devenir bleu.
      1. Resuspendre chaque type de cellule dans un milieu DMEM-30% de FBS à une concentration de 5 - 8 x 10 7 cellules ml - 1.
  3. Préparer des gels de collagène contenant des cellules
    Note: Chaque navire nécessite la préparation de ~ 5 ml de gel de collagène contenant des cellules.
    1. Dans un tube de 50 ml conique préparer le mélange de collagène par addition de 1 x support DMEM, supplémenté avec 50 pg / ml de gentamicine, 2 mM de L-glutamine et 10% de la chaleur inactivated FBS plus 3 mg / ml de collagène bovin I, 10 pg / ml de laminine, 40 pg / ml de collagène IV, 10 pg / ml de fibronectine, 2 pg / ml de protéoglycanes de sulfate d'héparine et du NaOH 15 mM (pour atteindre le pH physiologique).
    2. Fermer le tube et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles.
      IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.
      1. Étape critique: Si le mélange développe une apparence acide (couleur jaunâtre), ajouter quelques gouttes de NaOH stérile 1 pour neutraliser le mélange.
    3. Ajouter HUVEC et de fibroblastes concentré à une densité de 1,0 - 1,2 et 1,5 - 2,0 x 10 6 cellules / ml, respectivement au collagène enrichi en mélange (décrit ci - dessus). Fermer les tubes et mélanger en retournant plusieurs fois jusqu'à ce que le mélange soit complètement homogénéisé. Eviter la formation de bulles. IMPORTANT: Gardez le mélange sur la glace pour empêcher la gélification.
    4. Ajouter 4 - 5 ml de collagène contenant des cellulesgel pour chaque insert, préalablement chargé dans un puits de plaque 6, et on laisse gélifier dans la hotte, avec peu ou pas de mouvement pendant 1 heure.
    5. Après 1 h, transférer la plaque de 6 puits à une 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour 1 - 2 heures additionnelles.
    6. Remettre la plaque de 6 puits à la hotte, et avec l'aide d'une pince stérile et aseptique scalpel de coupure de la membrane de l'insert de détacher le gel contenant des cellules de la membrane. Couper le gel détaché en petits carrés (~ 5 x 5 mm).
    7. Ajouter les petits carrés contenant des cellules dans un HARV de 50 ml en utilisant l'orifice de remplissage.
  4. Préparer une suspension de 8-HCT cellules épithéliales:
    1. Laver les flacons deux fois dans du PBS et détacher les cellules en utilisant la trypsine, 0,25% (1x) avec le traitement trypsine-EDTA. Ajouter une solution de trypsine suffisante pour couvrir la totalité de la surface de culture cellulaire. Le détachement se produit habituellement dans les 10 à 15 min.
    2. Collecter des cellules individuelles dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    3. centrifuge DMEM-30% FBS contenant le tube à 500 xg pendant 10 min.
    4. Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de DMEM-30% FBS.
    5. Compter le nombre total de cellules viables comme décrit dans 3.2.5.
    6. Remettre en suspension les cellules HCT-8 dans l' épithélium DMEM-30% de FBS à une concentration de 10 7 cellules ml - 1.
    7. Ajouter 1 ml de HCT-8 cellules épithéliales concentrées dans le 50-ml HARV en utilisant l'orifice de remplissage.
  5. En utilisant l'orifice de remplissage, ajouter d'autres milieu de culture 3-D jusqu'à ce que le navire est presque plein (~ 20 ml).
  6. Replacer le capuchon et essuyez la lèvre de l'orifice de remplissage avec 70% d'éthanol.
  7. Placer une seringue dans chaque orifice de seringue de la RWV: placer un 5 ml seringue contenant 3 - 4 ml de 3-D dans le milieu de culture, un port et une seringue de 5 ml de vide dans l'autre port.
  8. Éliminer les bulles visibles en tirant dans la seringue vide pendant approximativement le même volume de milieu est injecté à travers l'autre orifice de la seringue.
  9. Placez les VesSels dans le bioréacteur, mettre sous tension et régler la vitesse d'environ 13 à 14 rotations par minute.
    Remarque: l' étape critique: taux de rotation peut être nécessaire d'ajuster quelques fois au cours d' une expérience visant à maintenir les cellules en orbite autour de l' intérieur du récipient, ce qui évite le contact avec les parois des vaisseaux.
  10. Les cellules de la culture à 37 ° C, 5% de CO 2 sous microgravité, fourni par le bioréacteur RWV.
  11. Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.
  12. Après 4 jours (± 1 jour), retirez les navires du bioréacteur et ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire).
  13. Placez les vaisseaux de retour dans le bioréacteur à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 jours (± 1 jour).
  14. Après les 5 jours supplémentaires (jour 9 de la culture), ajouter des lymphocytes / monocytes aux vaisseaux (2 x 10 7 / navire) et continuer les cultures pour un maximum de 12 jours supplémentaires.
  15. Changement milieu de culture tous les 3 - 4 jours en remplaçant environ 30 ml avec du milieu frais de culture 3-D.

4. Récolte Cultures 3-D pour histologie

  1. À l'aide d'une récolte de pipette de transfert de chaque fragment de gel petit, maintenant appelé «construire» dans une plaque à six puits contenant 10 ml de tampon de formol à 10%. Laisser pendant 3 heures à la température ambiante ou pour les 12 - 16 heures à 4 ° C.
  2. Préparer le traitement des tissus et des cassettes d'enrobage par marquage et en ajoutant deux morceaux de blocs de mousse de biopsie dans chaque cassette.
  3. Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
  4. À l'aide d'une pince placer les constructions-fixes entre les deux tampons de mousse.
  5. Immerger les cassettes dans 10% de tampon formol.
  6. Procéder à des procédures standard pour l' intégration, sectionner et coloration 44.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Précédemment , nous avons conçu un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine constituée d'une lignée de cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes humains primaires, des cellules endothéliales et des fibroblastes en culture en conditions de microgravité 24 (figure 1). Les fibroblastes et les cellules endothéliales ont été noyées dans une matrice de collagène I enrichi avec intestin suppléme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons le développement d'un modèle transgénique de la muqueuse intestinale humaine composée de multiples types cellulaires incluant les lymphocytes humains primaires, des fibroblastes et des cellules endotheliales, ainsi que des lignées de cellules épithéliales intestinales 24. Dans ce modèle 3-D, les cellules sont cultivées dans une matrice extracellulaire riche en collagène dans des conditions de microgravité 24.

Comme préc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

Remerciements

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

Références

  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Bioengineeringnum ro 113l hommeen trois dimensions 3 Dmicrogravitrotation navire de paroi RWVde l intestinles cellules pith liales

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.