Techniques pour l'évolution de la levure robuste Pentose-fermentation pour la bioconversion de lignocellulose en éthanol

Résumé

Techniques d'évolution et d' isolement adaptatifs sont décrits et démontrés pour produire des dérivés de la souche Scheffersomyces de NRRL Y-7124 qui sont en mesure de consommer rapidement hexose et les sucres mixtes pentoses en enzyme saccharifiées hydrolysats undetoxified et d'accumuler plus de 40 g / L d' éthanol.

Résumé

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Introduction

On estime à 1,3 milliards de tonnes sèches annuelles de la biomasse lignocellulosique pourraient soutenir la production d'éthanol et de permettre aux États - Unis de réduire sa consommation de pétrole de 30%. ¹ Bien que la biomasse végétale mélanges rendements d'hydrolyse de sucre riches en glucose et xylose, des inhibiteurs de fermentation sont générés par le prétraitement chimique nécessaire pour briser l'hémicellulose et d'exposer la cellulose pour l'attaque enzymatique. L'acide acétique, furfural et hydroxyméthylfurfural (HMF) sont considérés comme des éléments clés parmi beaucoup d'inhibiteurs qui se forment pendant le prétraitement. Afin de déplacer l'industrie de l'éthanol lignocellulosique avant, la recherche et les procédures pour permettre l'évolution des souches de levures capables de survivre et efficacement fonctionner à utiliser à la fois hexose et les sucres pentoses en présence de ces composés inhibiteurs sont nécessaires. Une faiblesse supplémentaire significative des souches de levures industrielles traditionnelles, telles que Saccharomyces cerevisiae, est l'incapacité de Fermen efficacementt le xylose disponible en hydrolysats de la biomasse végétale.

La souche de type de Pichia NRRL Y-7124 (CBS 5773), récemment rebaptisé stipitis Scheffersomyces, est une levure de fermentation des pentoses native qui est bien connu pour fermenter le xylose en éthanol. ^2,3 L'évolution de la souche NRRL Y-7124 a été poursuivi ici parce qu'il a été documenté pour ont le plus grand potentiel de souches de levures indigènes d'accumuler l' éthanol économiquement récupérables supérieure à 40 g / l avec peu de sous - produits de xylitol. ^4,5,6 Dans les médias optimal, S. souche stipitis NRRL Y-7124 produit 70 g / L d' éthanol dans 40 heures (1,75 g / l / h) à un rendement de 0,41 ± 0,06 g / g dans des cultures de haute densité cellulaire (cellules 6 g / L). ^7,8 Résistance à des inhibiteurs de fermentation de l' éthanol, le furfural, et HMF a également été rapportée, ⁹ et S. stipitis a été classé parmi les levures pentoses fermentant indigènes les plus prometteurs disponibles pour productio d'éthanol à l'échelle commercialen à partir de lignocellulose. ¹⁰ Notre objectif était d'appliquer divers hydrolysats lignocellulosiques undetoxified et des pressions de sélection de l' éthanol pour forcer l' évolution vers un dérivé plus robuste de la souche NRRL Y-7124 adapté aux applications industrielles. Key parmi les fonctionnalités améliorées recherchées étaient plus rapides taux de sucre d'absorption dans les hydrolysats concentrés, réduite diauxy pour une utilisation plus efficace mixte de sucre, et des tolérances plus élevées d'éthanol et d'inhibiteurs. L'application de S. stipitis à hydrolysats undetoxified était un élément clé de la recherche pour éliminer les charges d'exploitation ajoutée associés aux processus de désintoxication hydrolysats, tels que surchaulage.

Deux hydrolysats industriellement prometteuses ont été appliquées pour forcer l' évolution:. Enzyme saccharifié fibres d'ammoniac tiges de maïs hydrolysat d'expansion prétraité (AFEX CSH) et diluer l' acide prétraité panic hydrolysat liqueur (PSGHL) ^11,12 technologie de prétraitement AFEX est développé àminimiser la production d'inhibiteurs de fermentation, alors que le prétraitement de l'acide dilué représente la technologie actuelle la plus économique la plus couramment pratiquée pour exposer la biomasse cellulosique pour la saccharification enzymatique. PSGHL peut être séparée de la cellulose restant après le prétraitement, et est typiquement riche en xylose à partir de l'hémicellulose hydrolysée, mais pauvre en glucose. AFEX CSH et compositions PSGHL diffèrent les unes des autres aspects clés qui ont été exploitées pour gérer le processus d'évolution. AFEX HCS est plus faible dans les aldéhydes furaniques et des inhibiteurs de l' acide acétique , mais plus élevé en acides aminés et des sources d'azote ammoniacal par rapport PSGHL (tableau 1). PSGHL présente le défi supplémentaire de xylose étant le sucre prédominant disponible. Ainsi PSGHL convient d'enrichir spécifiquement pour une meilleure utilisation de xylose dans hydrolysats, une faiblesse empêchant l'utilisation commerciale de la disposition de la levure. Même parmi les levures de fermentation de pentoses indigènes, le recours à la xylo du sucre suboptimalese pour soutenir la croissance cellulaire et la réparation devient encore plus difficile dans les hydrolysats en raison d'une variété de raisons:. carences en éléments nutritifs, les inhibiteurs causant des dommages étendus à la cellule intégrité structurelle, et la perturbation du métabolisme en raison de déséquilibres redox ⁹ azote supplémentation, en particulier sous la forme de les acides aminés, peuvent représenter un coût d'exploitation important pour fermentations. L'impact de la supplémentation en azote sur le dépistage isolat et le classement a été exploré avec hydrolysats panic.

Individus améliorés ont été enrichies dans une population en évolution en utilisant de multiples pressions de sélection dépendent de la diversité génétique naturelle du S. la population et des mutations induites par une exposition stipitis deux divers hydrolysats, l' éthanol ou le rayonnement UV. Des pressions de sélection sont appliqués en parallèle et en série pour étudier la progression de l' évolution de S. stipitis vers les dérivés souhaités capables de croître et de fermenter efficacement des hydrolysats(Figure 1). La mise en culture des populations répétitives fonctionnelles dans les hydrolysats de plus en plus difficiles a été réalisée en microplaques en utilisant une série de dilutions de 12%, soit glucane HCS AFEX ou bien PGSHL préparé à 20% de solides chargement. L'application de la croissance de l'éthanol-contestée sur xylose en culture continue d'améliorer encore les populations de CSH adaptée AFEX en enrichissant des phénotypes démontrant moins de sensibilité à l'éthanol répression de l'utilisation de xylose. Cette dernière caractéristique a été récemment montré problématique à l' utilisation des pentoses par la souche NRRL Y-7124 après la fermentation du glucose. ⁸ Enrichissement sur PSGHL a ensuite été explorée pour élargir la fonctionnalité hydrolysat.

Des dérivés améliorés putatifs de S. stipitis NRRL Y-7124 ont été isolés à partir de chaque phase du processus d'évolution en utilisant l' enrichissement ciblé dans des conditions de stress et dilution placage pour prélever des colonies de populations les plus répandues. Dimensionless par rapportindices de performance (RPI) ont été utilisés pour classer les souches en fonction de la performance globale, où le comportement cinétique a été évaluée sur les différents types d'hydrolysat et suppléments nutritifs appliqués. Bien que les succès de diverses procédures d'adaptation pour améliorer la fonctionnalité de S. stipitis dans hydrolysats lignocellulosiques ont déjà été documentés, les souches démontrant la production d'éthanol économique sur hydrolysats undetoxified ont pas été signalés précédemment. ^13-17 En utilisant les procédures d'évolution à visualiser plus en détail ici, Slininger et al. ¹⁸ souches qui sont significativement améliorées par rapport élaboré la souche mère NRRL Y-7124 et sont en mesure de produire> 40 g / l d'éthanol dans AFEX CSH et hydrolysat enzymatique de panic saccharifié (SGH) complété de manière appropriée avec des sources d'azote. Ces nouvelles souches sont des intérêts futurs à la lignocellulose en développement à l'industrie de l'éthanol et en tant que sujets de la génomique supplémentaires d'études bâtimentsur ceux de souche séquencées précédemment NRRL Y-11545. ¹⁹ Une étude de la génomique des meilleures souches produites au cours des différentes phases de l' évolution schématisé à la figure 1 serait d' élucider l'historique des modifications génétiques qui ont eu lieu au cours du développement en tant que prélude à d' autres recherches sur l'amélioration de la souche.

Protocole

1. Préparer à partir de matériaux et de l'équipement pour des essais

1. Préparer des hydrolysats à l'aide de 18 à 20% en poids sec de la biomasse initiale dans la réaction de pré-traitement destiné à être utilisé dans l'évolution, l'isolement et les procédures de classement. Voir Slininger et al. 2015 ¹⁸ pour les méthodes détaillées pour préparer AFEX CSH, PSGHL et SGH avec des suppléments d'azote N1 ou N2 utilisés dans l' évolution, l' isolement ou le classement. Voir le tableau 1 pour la composition de chaque type hydrolysat.
   REMARQUE: fortification d'azote du SGH ont été désignés comme SGH-N1 ou SGH-N2 défini comme suit: SGH-N1 = SGH enrichi à 42: Carbone 1 molaire au rapport de l'azote (C: N) avec des sources d'azote, y compris l'urée, un groupe amino libre de vitamine Les acides de caséine, de D, L-tryptophane, la L-cystéine et de vitamines à partir de sources définies (telle que ~ 15% molaire de l'azote N est l'azote amino primaire (PAN) et ~ 85% de l'azote est de l'urée); SGH-N2 = SGH enrichi à 37: 1 C: N avec de l'urée et de la farine de soja comme le plus faible coût source commerciale of acides aminés et des vitamines, fournissant environ 12% de N à partir de PAN et de 88% sous forme d'urée.
2. Acquérir une culture lyophilisée de la souche mère, NRRL Y-7124 de de Scheffersomyces (CBS 5773) de la Culture Collection ARS (Centre national de la recherche agronomique d'utilisation, Peoria, Illinois), et préparer les cultures de glycérol d'achat d'actions selon les directives. Maintenir cultures stock de la levure mère et de ses dérivés dans 10% de glycérol à -80 ° C.
   1. les stocks Streak de glycérol à la levure de malt peptone dextrose (YM) gélose (3 g / L extrait de levure, 3 g / L d'extrait de malt, 5 g / L de peptone, 10 g / L de dextrose, 20 g / L d'agar) et incuber 48- 72 h à 25 ° C. ⁸ plaques développés peut être stocké jusqu'à une semaine à 4 ° C avant l'utilisation en tant que liquide inoculum pré-culture.
3. Préparer Optimal Défini Medium (ODM), un milieu synthétique compatible avec les procédures de formulation industrielle ²⁰ qui a déjà été mis au point pour la conversion optimale de xylose en éthanol par la str mèreain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Utilisez le milieu défini dans toutes les précultures et cultures pour la fermentation bioessais de performance et aussi pour l' éthanol en cause, l' évolution de la culture continue xylose nourris. Composition ODM est répertorié pour référence dans le tableau 2.
4. Comme décrit précédemment, ¹⁸ analyser la biomasse cellulaire à l' aide d' un spectrophotomètre de lecture cuvette- ou micro-plaque, le cas échéant, pour mesurer la culture de l' absorbance à 620 nm (A _620). Quantifier les sucres, l'éthanol, le furfural, l'hydroxyméthylfurfural (HMF) et de l'acide acétique dans des échantillons de culture en utilisant une Chromatographie haute performance en liquide (HPLC) ou la détermination enzymatique du glucose robotique et le xylose pour un débit plus élevé.

2. Enrichir Dérivés robustes lors du transfert de série sur AFEX CSH

1. Inoculer une préculture de la souche NRRL Y-7124. Transfert des cellules de gélose YM à 75 ml ODM + 150 g / L de xylose pour maintenir la capacité de croître sous ole stress smotic. Incuber précultures dans 125 ml des flacons fermés avec une éponge de silicium bouchons 24 h à 25 ° C sous agitation (150 tours par minute, 1 orbite ").
2. aliquotes Décongeler de 6-12% glucane CSH AFEX dans l'eau froide pour l'utilisation. Ajuster le pH à 5 en cas de besoin et stériliser par filtration avant de préparer une série de dilutions dans 96 puits.
3. Remplissez microplaques avec 50 pi par puits et 8 puits par dilution hydrolysat, puis ensemencer avec quelques microlitres de préculture par puits pour permettre une absorption initiale (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incuber plaques statiquement 24-48 h à 25 ° C dans une boîte en plastique avec une serviette en papier humide pour l'humidité.
4. Utilisation de la dilution hydrolysat la plus concentrée qui visiblement a grandi à A _620> 1, le transfert 1-5 ul à chaque puits d'une nouvelle série de dilution hydrolysat pour atteindre initiale A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Surveiller la croissance de la culture de ₆₂₀ A en microplaques avec un spectrophotomètre. Une série de dilution non ensemencé serfs comme un contrôle et vierge. couvercles de plaques sont laissés sur pendant la surveillance pour prévenir la contamination, et les lectures ajustées en conséquence.
6. Préparer des stocks de glycerol de cultures d'adaptation régulière pour l'isolement subséquent de souches améliorées ou pour une utilisation dans reinoculating la série de dilutions hydrolysat continue. Pour préparer les stocks, piscine quatre puits (200 pi) de la plus grande concentration d'hydrolysat colonisé. Mélanger 1: 1 avec 20% de glycérol stérile dans cryotubes, de geler les cellules dans 10% de glycérol à -80 ° C.
7. Répétez les étapes 2.3-2.6 jusqu'à la croissance de 12% glucane CSH AFEX est toujours visible à 24 h.

3. Isoler seule cellule Dérivés tolérantes après enrichissement sur AFEX CSH

1. Streak choisi stocks de glycérol de cultures d'adaptation à la gélose YM, et l' utilisation des stries pour inoculer 50 pi de 3% ou 6% glucane AFEX CSH (pH 5) dans chacun des trois puits de microplaques (initiale A ₆₂₀ ~ 0,1). Incuber microplaques 24 heures comme à l'étape 2.3. Piscine répliquete colonisée puits à la plus grande force hydrolysat avec une forte croissance, et la plaque de dilution à YM ou 6% glucane CSH agar AFEX. Préparer celui-ci comme un mélange 1: 1 de 12% stérilisé par filtration glucane HCS AFEX avec une solution chaude / L d'agar-agar 30 g autoclavée.
2. Choisissez 5 colonies isolées de la plus haute plaque de dilution montrant la croissance après 24-48 heures d'incubation à 25 ° C pour congeler sous forme de cultures de glycérol d'actions. Streak chaque colonie à une plaque de YM. Incuber 24 h. Avec une boucle stérile, transférer une série développée de cellules à un petit volume de 10% de glycérol, mélanger de suspendre les cellules, et distribuer à 2-3 cryovials pour la congélation à -80 ° C.

4. Évaluer le rendement des AFEX CSH Derivatives tolérantes par rapport au parent

1. Test de Isole en simples Cultures 6% glucane AFEX CSH Batch.
   1. Cellules de transfert de 48 plaques h striés de stocks de glycérol à pH tampon phosphate 7 de potassium (0,4 mM) pour préparer des suspensions cellulaires avec A ₆₂₀ = 10. Utiliser 1 pl dechaque suspension pour inoculer chacun des quatre puits de 50 ul 3% hydrolysat glucane initiale A ₆₂₀ = 0,2. Incuber microplaques 24 heures comme à l'étape 2.3. Préparer le glucane CSH 3% AFEX à pH 5 par dilution de 12% glucane CSH AFEX 1: 3 avec de l'eau stérile.
   2. Transfert deux puits 24 heures de microplaques pour inoculer 25 ml précultures de pH 5 à 12% glucane CSH AFEX utilisés à 50% de la pleine puissance. Incuber précultures dans 50 ml flacons avec silicium fermetures d'éponge pour 24 heures à 25 ° C, ~ 150 rpm (1 orbite ") Préparer la demi-force 12% glucane CSH AFEX en diluant l'hydrolysat 1: 1. Avec de l'eau stérile.
   3. Utilisez demi-force précultures hydrolysat pour inoculer 25 ml de cultures de croissance similaires à initiale A ₆₂₀ = 0,1. Incuber les cultures en croissance comme ci-dessus (4.1.2) et l'échantillon par jour (0,2 ml). Les accumulations de moniteur de biomasse (A ₆₂₀₎ et les concentrations des sucres et des produits de fermentation (HPLC).
2. Alternativement, repitch (ie, la récolte et reuse) populations de 6% glucane AFEX levure CSH cultivées pour les tests dans 8% glucane cultures par lots hydrolysat, comme décrit précédemment. ¹⁸
3. En variante, d' autres populations d'essai de 6% repitched glucane cultures de CSH AFEX en alimentant avec 12% d' hydrolysat glucane, comme décrit précédemment. ¹⁸
4. Testez lag diauxic des isolats dans des cultures discontinues de ODM avec des sucres mixtes.
   1. Inoculer 75 ml précultures de l'ODM avec 150 g / L de xylose dans des flacons de 125 ml avec des fermetures en silicone éponge par transfert en boucle à partir YM stries de glycérol. Incuber 24 h comme dans l'étape 2.1.
   2. Utiliser précultures pour inoculer des cultures de 75 ml d'essais similaires avec l'ODM contenant 75 g / L de glucose et 75 g / L de xylose à un pH de 6,5. Agiter les flacons à 25 ° C, 150 tours par minute. Exemple de tous les jours.
   3. En variante, tester l'impact de 0-15 g / acide acétique à L diauxy lors de la fermentation du glucose et du xylose en utilisant un protocole similaire, à l'exception du pH initial est réglé à 6,0 ± 0,2 dans des cultures d'essai pour maintenir le pH du 7/6sonner la consommation d'acide acétique, comme décrit précédemment. ¹⁸

5. Appliquer la culture continue à sélectionner pour l'éthanol contesté xylose Utilisation

1. ODM préparer le milieu d'alimentation de culture en continu avec de 60 à 100 g / L de xylose, de 20 à 50 g / l d'éthanol à un pH de 6,3 ± 0,2. Choisir des combinaisons de xylose et de l' éthanol pour simuler la fermentation partielle de 150 g / L de xylose, en supposant un rendement potentiel de ~ 0,5 g d' éthanol / g de xylose et pour tenir compte du potentiel de 50 à 70 g / l d' éthanol à se produire. ⁸
2. Afin de préparer l'inoculum de culture en continu, le transfert d' un représentant colonie HCS tolérant AFEX (analogue à la colonie 5 dans l' exemple, la figure 1) en boucle d'une plaque de YM 48 h à 75 ml de l'ODM exempt d' éthanol (100 g / L de xylose, dans ce cas) dans 125 ml flacons. Incuber à 25 ° C, 150 tours par minute (1 "orbite) pendant 24 heures. Choisissez la concentration de xylose ODM préculture pour correspondre à celle du volume de maintien de la culture continue initiale.
3. Inoculer une culture en continu du volume de maintien de l' ODM à un pH de 6,3 ± 0,2 avec 100 g / L de xylose + 20 g / L d' éthanol avec ~ 5 à 10 ml d'un concentré de pré - culture d'un isolât AFEX tolérant HCS (analogue à Colony 5, la Figure 1 ) pour obtenir 100 ml lors de la première A ₆₂₀ ~ 0,5. Maintenir la culture de maintien du volume (V _R), à 25 ° C dans une centrifugeuse chemisé 100 ml ballon agité à 200 tours par minute , et équipé d' une électrode de pH stérilisable, régulateur de pH et de faire circuler le bain d'eau à température contrôlée.
4. Dans un premier temps, étant donné que la croissance des cellules sera lente en raison de l'exposition à l'éthanol, mis en place le moyen d'alimentation à la dose en utilisant une pompe à pH actionné. Régler la pompe pour alimenter pH 6,3 ODM avec 100 g / L de xylose et 50 g / L d'éthanol lorsque la fermentation de la culture chute du pH à 5,4, ce qui arrête en outre la chute du pH. Maintenir le volume à 100 ml avec une pompe d'effluent en continu d'écrémage de la surface de culture. Par conséquent, la concentration en éthanol augmente avec le métabolisme et la poursuite de l'alimentation.
5. Mesurer l' effluent et prélever des échantillons (1-2 ml) à partir de cultures en continu toutes les 48-72 heures pour l' analyse de la concentration de cellules viables, des produits et des substrats, comme décrit précédemment. ¹⁸ Pour trouver la concentration de cellules viables, faire des dilutions en série 1:10 d'échantillons dans tampon (voir 4.1.1) et la plaque de propagation des dilutions à la gélose YM (voir 1.2.1). Sur la base des taux de collecte des effluents (Q), calculer le taux de dilution (D) (Q / V _R), et, dans l'exemple de S. stipitis, elle varie de 0 à 0,01 h ^-1.
6. Enregistrer les stocks de glycérol régulièrement en isolant à partir de plaques de viabilité des dilutions d'échantillons tamponnés formant 30-100 colonies, ce qui représente les colons robustes les plus répandues à l'époque de l'enrichissement. plaques d'inondation avec ~ 5 ml de glycérol à 10% pour permettre la préparation des cryotubes en double. Pour l'entretien ou un répit, arrêter la culture continue et redémarrez au besoin en utilisant la plus récente (résistant) stock de glycérol (s).
7. Pour redémarrer, série du stock de glycérol (s) de la plupartpopulations résistantes à la gélose YM et transférer 24-48 cellules h par boucle à une pré-culture de l'ODM exempt d'éthanol pour l'incubation comme ci-dessus. Inoculer les 100 ml de maintien du volume d'ODM initiale A ₆₂₀ 0,5 en utilisant un concentré de la levure précultivé, et permettre à la culture de se développer en discontinu jusqu'à la phase stationnaire avant que le flux de milieu d'alimentation est redémarré.
8. Si les cultures peuvent croître de façon constante à> 0,01 h ^-1 sur xylose en présence de> 25 g / L d' éthanol, commencer l'alimentation continue de la culture (ODM + 60 g / L xylose + éthanol allant de 30 à 50 g / L) à un faible taux de dilution ~ 0,01 h ^-1 à 100 ml de volume de retenue (initialement ODM + 60 g / L de xylose + 20 g / l d' éthanol). Au fil du temps, augmenter l'éthanol dans l'alimentation vers 50 g / L. Capturez populations avancées dans les stocks de glycérol.
   NOTE: Le maintien du taux de dilution faible permet la formation d'une concentration cellulaire suffisamment élevée pour réduire la disponibilité de l'oxygène et le soutien fermentation.
9. Eventuellement, appliquer ultra-violet (UV) irradiation mensuelle de glycérol populations d'actions utilisées pour reinoculate cultures continues.
   1. colonies Resuspendre de glycérol disponible stries dans 10 ml d'ODM (comme dans précultures) avec 60 g / L de xylose, et mettre en commun tous les stocks dans un seul flacon stérile. Appliquer la suspension de cellules regroupées à ~ 5 x 10 ⁸ cellules viables / ml pour couvrir tout le fond des boîtes de Pétri 4-5 avec 6 ml / plaque. Pour obtenir 6 ml couverture d'une plaque de Pétri jetable standard, passer de 15 ml pour surmonter la tension de surface, puis retirez 9 ml.
   2. Exposer chaque plaque de culture ouverte aux UV de la source lumineuse dans une enceinte de sécurité biologique. Réglez le temps d'exposition aux UV ou de distance pour obtenir le taux de destruction souhaité> 90%. Ici, exposer pendant 45 min à environ 56 cm de la source.
   3. Diluer des suspensions cellulaires de la plaque avant et après irradiation. taux de destruction d'estimation basée sur les unités formant colonie. Pour le S. stipitis exemple, le taux de destruction était ~ 97%.
   4. Transférez les cultures exposées aux UV (24-30 ml) à une feuille-covEred ballon de 50 ml, et incuber à 25 ° C et 150 rpm pendant 24 heures pour permettre le faible pourcentage de cellules viables à repeupler à ~ 1 x 10 ⁸ S. viable stipitis cellules / ml. En empêchant les réactivations de photos, le couvercle de la feuille conserve les mutations alors que les cultures sont incubées.
   5. Utiliser la culture mutagénisé repeuplée pour inoculer des cultures en continu à 1 x 10 ~ ⁷ cellules viables / ml. Redémarrez l'ODM + 60 g / L milieu xylose alimentation en éthanol enrichi pour poursuivre le processus de sélection.

6. Évaluer Glycerol Stock populations et identifier ceux qui ont amélioré xylose Fermentation en présence d'éthanol

1. Streak sélectionné cultures glycérol sur actions à l'agar YM comme la première étape dans l'écran pour une meilleure croissance et la fermentation de xylose en présence d'éthanol.
2. Transfert chaque population a évolué à cribler de stries de gélose à 75 ml précultures dans ODM avec 150 g / L de glucose, et incuber dans 125 ml flacons 96h avant l'utilisation comme inoculum pour des cultures d'essai. Les grandes populations de glucose cultivées nécessiteront l'induction d'enzymes pour l'utilisation de xylose.
   1. Pour tester l' induction, la récolte de chaque culture, de suspendre les cellules à 30 ml, initiale A ₆₂₀ de 40 ODM +60 g / L xylose + 30-45 g / L d' éthanol, et incuber à 25 ° C, 150 rpm (1 orbite ") dans des flacons de 50 ml avec du silicium fermetures d'éponges. prélever des échantillons deux fois par jour pour le suivi de l'absorption du xylose par analyse HPLC.
3. En variante, comme décrit dans Slininger et al., ¹⁸ pour évaluer la croissance sur du xylose en présence d'éthanol, de préparer précultures de chaque population élaborée par transfert en boucle à 75 ml d'ODM avec 150 g / L de xylose dans 125 ml en flacons, et incuber 96 h à 25 ° C, 150 tours par minute (1 "orbite). inoculer des cultures d'essai à une première basse _A620 de 0,1 dans 25 ml d'ODM + 60 g / L de xylose + 30 à 45 g / L d' éthanol dans des flacons de 125 ml. On incube flacons à 25 ° C, 300 rpm, 1 orbite "et de l'échantillon.

7. Isoler Colonies de cellules uniques qui utilisent le xylose en PSGHL Lorsque l'éthanol est présent

1. Sur la base des résultats de l'étape 6, sélectionnez glycérol populations d'actions montrant une capacité supérieure à croître sur et fermenter le xylose en présence d'éthanol. Utilisez-les pour plaques streak. Les plaques de balayage sont utilisées pour préparer des suspensions denses de cellules mises en tampon de A = ₆₂₀ 5. Ensuite les suspensions de cellules sont utilisées pour inoculer des précultures dans des plaques de 96 puits profonds à A ₆₂₀ = 0,5. Inoculer 1 ml précultures sur PSGHL mélangés 1: 1 avec de l'ODM + 50 g / L de xylose (pas d'éthanol). Incuber précultures dans 96 puits, des plaques à puits profonds avec faible évaporation ventilée couvre pendant 48 heures à 25 ° C, 400 rpm, 1 orbite ". Différentes séparées populations de glycérol d'actions par puits vides.
2. En utilisant chaque préculture, inoculer seize 1 ml répliquent cultures initiale A ₆₂₀ ~ 0,5 à 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L de xylose avec 20, 30 ou 40 g / L d' éthanol pour enrichir les colons tolérantes. Incuber cultu enrichissementres est similaire à précultures.
3. Pour chaque glycérol stock différent, récolter les puits de culture avec une concentration d'éthanol plus élevée permettant l'utilisation de la croissance et le xylose. Plate chaque lignée cellulaire à la gélose YM pour obtenir des colonies isolées prévalentes pour préserver dans le glycérol. Choisissez dix colonies par lignée cellulaire et chaque série à une plaque de gélose YM pour la préparation de glycérol stock.

8. Enrichissez plus robuste Evolved Souches lors du transfert de série sur PSGHL, comme pour AFEX CSH

1. Préparer des pré-cultures de NRRL Y-7124 (parent), AFEX tolérant HCS a évolué d'isoler et de culture en continu évolué population ayant une capacité accrue à utiliser le xylose en présence d'éthanol. Inoculer 75 ml d'ODM + 150 g / L de xylose par boucle à partir de glycérol disponible stries comme décrit ci-dessus (étape 2.1) pour le processus d'adaptation hydrolysat AFEX CSH.
2. PSGHL diluer avec de l'eau pour fournir une série de concentrations croissantes. Préparer un 96 puits de micro-plaques pour chacune des trois lignées cellulaires en utilisant chaquedilution PSGHL pour remplir 8 puits avec 50 ul. Utiliser chaque préculture pour inoculer 50 ul de micro-culture de la série de dilution initiale A ₆₂₀ ~ 0,1 à 0,5.
   1. Continuer l'évolution de la levure dans l' augmentation des forces de PSGHL en utilisant la même procédure que l'adaptation hydrolysat AFEX CSH détaillé ci - dessus (étape 2) jusqu'à ce que les cultures sont capables de croître dans l'hydrolysat pleine puissance à un niveau stable ratio moyen 14-d de AA ₆₂₀ par Δtime que les transferts en série se poursuivent quatre mois supplémentaires.

9. Isoler colonies de cellules uniques Utilisation PSGHL Dégradés avec ou sans éthanol Défi

1. Obtenir une seule cellule isole directement de pleine PSGHL résistance finale plaques d'adaptation par dilution et étalement de gélose YM. Choisissez dix grandes colonies pour chacune des trois lignées cellulaires et bar série à plaques YM pour préparer des stocks de glycérol comme décrit précédemment (étape 3.2).
2. Eventuellement, explorer des points de temps plus tôt dans leprocessus d'évolution, en isolant à partir des stocks de glycerol stockées des trois lignées cellulaires.
   1. Inoculer une préculture pour chaque lignée cellulaire par boucle à partir du stock de glycérol stries et incuber 24 h sur 30 ml ODM + 50 g / L de xylose (50 ml flacons, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Les cellules du Défi de précultures à la croissance en hydrolysat par inoculer 50 ul de 50% PSGHL dans les puits de microplaques à une première A ₆₂₀ ~ 0,2 et incubation statiquement 48 h.
   3. Étaler 0,1 ml de chaque culture enrichi sur des plaques de gélose de gradient de PSGHL allant de 0 à 50% d'hydrolysat de force (délivrant ~ 300-400 cellules viables par plaque), et ramasser 10 colonies isolées par la lignée cellulaire de la possible zone la plus élevée de concentration hydrolysat du gradient . ²¹ Streak choisi colonies à YM pour la préparation du glycérol boursier comme dans l' étape 3.2.
   4. Comme une alternative à l' étape 9.2.3, au lieu d'inoculer des plaques de gélose à gradient, inoculer des puits de 96 puits de micro-plaques initiale A ₆₂₀ ~ 0,2, WHEre les puits sont conçus pour contenir une gamme de concentrations d'hydrolysat de 50 à 100% Résistance à l'éthanol et entre 10 et 40 g / l. Dans ce cas, développer des micro-plaques 72-96 h et autrement que dans l'étape 2.3. Isoler dix colonies isolées dans des puits les plus difficiles combinaisons hydrolysat-éthanol montrant la croissance par dilution et étalement, et de préparer des stocks de glycérol comme dans l'étape 3.2.

10. Dans un écran primaire, Eliminate isolements Inferior en comparant et classement Performances sur PSGHL à deux conditions nutritives

1. Appliquer un puits profond écran de plaque à haut débit de performances PSGHL à l' écran cinq ensembles de trente isolats avec NRRL Y-7124 parent et isolat AFEX CSH tolérantes (analogue à Colony 5 de l'exemple de la figure 1 de l' évolution) en tant que témoins de choisir six premières souches (20%) à partir de chaque jeu pour passer au niveau de criblage secondaire (étape 12).
2. Effectuer l'écran dans des plaques de puits profonds remplis 1 ml par puits et wi couvertse couvercles en acier inoxydable avec silicone noir bas joints par évaporation. Fixer toutes les plaques à la carte de l'incubateur / agitateur et fonctionner à 25 ° C et 400 tours par minute (1 "orbite shaker). Conception tout puits profond assiette de remplissage des modèles pour permettre la séparation des différents isolats par des puits ouverts.
3. Pour commencer les cultures, choisir un cordon de cellules de stries de glycérol préparées à partir de 30 isolats obtenu comme ci-dessus (dans les étapes 3, 7 et 9) pour doubler les puits des ODM + 50 g / L de xylose et incuber 48 h.
4. En tant que moyen pour préculture isolats de défi, préparer 50% PSGHL en mélangeant PSGHL 1: 1 avec ODM + 10 g / L de glucose + 50 g / L xylose. Pour le dépistage de 30 isolats et deux souches de contrôle, 2 plaques avec 2 puits par chacun des 16 isolats sont remplis, laissant des puits vides entre les différents isolats.
5. Pour les cultures de provocation, de transfert, d' un volume de 50 ul d'ODM précultures (A ₆₂₀ ~ 10) à chacune des deux 50% des puits de culture de provocation PSGHL pour chacun des isolats et des contrôles afin d' obtenir un initial A ₆₂₀ ~ 0,5 et incuber 72 h.
6. Utilisez deux milieux d'essai de différentes richesse nutritionnelle pour le dépistage des isolats: 60% PSGHL + ODM nutriments; et 75% PSGHL + nutriments ODM + YM. Ajouter les éléments nutritifs ODM (à l'exclusion des sucres) à la moitié de la force en tant que norme pour les ODM utiliser avec 50 g / L de sucre (étape 1.3). Désigné, ajouter des éléments nutritifs YM (à l'exclusion des sucres) à la moitié de la dose standard de 3 g / l d'extrait de levure, 3 g / l d'extrait de malt, 5 g / l de peptone.
7. Inoculer cultures d'essai en transférant 50 ul de 72 h 50% challenge PSGHL pré-cultures pour inoculer 1000 pi à initiale A ₆₂₀ ~ 0,5 dans cinq puits profonds pour chacun des deux milieux de test.
8. Échantillon chaque isolat quotidienne. Pipeter le contenu d'un puits dans un tube microfuge et centrifugeuse (5533 x g, 15 min) pour obtenir le surnageant pour l'éthanol, le glucose et le xylose analyse à haut débit. Mesurer la biomasse comme ₆₂₀ dans 96 puits de micro-plaques (200 pl / puits) avec un spectrophotomètre.
9. Au sein de chaque ensemble de 30 estolates testé (5 sets pour NRRL Y-7124 de S. évolué souches), calculer des indices de performance relatifs (RPI) , comme décrit dans l' étape 11 ci - dessous et utiliser pour classer chaque souche basée sur le rendement de l' éthanol (éthanol maximale cumulée par le sucre initial fourni) et taux d'absorption du xylose (concentration de xylose consommé par initial 96 h) sur les deux supports de test.

11. Rang Isole dans l'écran PSGHL primaire Utilisation Indice de Performance relative (RPI)

1. Après le dépistage primaire, calculer les indices de performance relatifs adimensionnels (RPI) afin de classer les 30 isolats dans chacune des cinq expériences différentes à l' écran isole sur PSGHL avec deux formulations différentes de nutriments par expérience, à savoir, 60% PSGHL et 75% PSGHL.
2. Calculer le paramètre statistique F pour une utilisation dans le classement des performances isolat au sein d' un groupe d'isolats testés dans une expérience donnée: F = (XX _moyenne) / s. Ici, X est le paramètre de performance, telles que le rendement (Y)ou le taux (R), observé pour chaque isolat individuel, tandis que X _avg et s sont l'écart moyen et standard, respectivement, de X observée pour tous les isolats dans une expérience donnée. Pour les distributions normales, -2
3. Pour chaque isolat dans une expérience, calculer la performance relative en fonction du taux, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, et calculer de la même performance relative en fonction du rendement, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . La valeur de RPI varie de ~ 0 à 100 percentile (plus bas au plus élevé). Ensuite , calculer les moyennes RPI pour chaque isolat au sein d' une expérience hydrolysat donnée comme suit: RPI = _avg (RPI _Y + RPI _R) / 2, où les contributions de rendement et de taux sont donnés pondération égale dans cette application.
   Notez que, en général, les paramètres de rendement et de taux peuvent être pondérés si elle est jugée inégale importance.
4. Calculer RPI _globale à travers les n types d'hydrolysats testés: RPI _globale = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Considérez chaque isolat dans un ensemble expérimental de 30 isolats et 2 contrôles. Au cours de classement primaire du ~ 150 unique colonie isolats adaptés aux xylose riches PSGHL, le RPI _global est calculé pour les taux et les rendements à travers les deux formulations de PSGHL appliquées dans l'écran, soit 60% PSGHL et 75% PSGHL, où n = 2.
5. Sur la base de RPI _globale dans chaque expérience, choisissez le pourcentage supérieure des isolats de passer à l'écran secondaire. Dans cet exemple, les 20% des souches sont choisies pour passer à travers (soit 30 de 150 testés).

12. Dans un écran secondaire, Comparer les artistes interprètes ou exécutants d'écran primaire Top sur plusieurs hydrolysats complète (> 100 g / L de sucres mixtes) pour révéler le plus haut Fonctionnement Souches robustes

1. Comparez les plus performants de PSGHL sur 6% glucane CSH AFEX et SGH modifiée avec deux niveaux d'azote, SGH-N1 et SGH-N2 (compositions comme dans le tableau 1) pour le classement final. Tamiser les 30 isolats qui ont été les plus performants dans l'écran de plaque de puits profond primaire de PSGHL (étapes 10 et 11) et les deux contrôles (souche mère NRRL Y-7124 et isolat AFEX CSH tolérantes (analogue à Colony 5, Figure 1 exemple ).
2. Commencer les cultures en choisissant une bille de cellules à partir des stries de glycérol à reproduire des puits profonds de 1 mL ODM + 50 g / L de xylose comme précédemment et incuber pendant 48 heures dans le système de plaques à puits profonds (étape 10.2). Puis transférer 50 pi de précultures ODM à 50% des cultures de provocation SGH, et incuber dans le système de plaque de puits profond pendant 72 heures pour obtenir A ₆₂₀ à ~ 10). Préparer les 50% SGH en mélangeant SGH 1: 1 avec de l'ODM sans sucre + 50 g / L de xylose (pH 5,6).
3. Pour chacun des isolats inoculer une aliquote de SGH-N1 ou SGH-N2 16 ml avec le culot cellulaire (15 min, 2711 x g) à partir de trois puits de culture de provocation pour donner culture d'essai initiale A ₆₂₀ ~ 2,0. Incuber cultures d'essai à 25 ans & #176;. C, 180 rpm (1 «orbite) dans 25 ml flacons avec fermeture silicone éponge flacons exemples quotidiens et d'analyser par l'écran PSGHL.
4. De même, l'écran isole comme dans les étapes 12.2 et 12.3, mais cette fois substitut SGH-N1 et SGH-N2 avec 6% glucane CSH AFEX à pH 5,2 pour une utilisation dans la préparation du milieu de milieu de culture de défi et de la culture d'essai. Pour les cultures de provocation de la force 50%, utiliser 6% AFEX CSH dilué 1: 1 avec de l'eau, car il est suffisamment d'azote sans amendement.
5. Répétez les étapes de 12,1 à 12,4 pour reproduire les résultats.

13. Classement des performances des isolements dans l'écran secondaire Utilisation RPI _globale à taux d'utilisation multiple hydrolysats complète

1. Calculer les indices de performance relatifs (RPI) afin de classer chacun des 20% des isolats (~ 30 sur 150) à partir de l'écran principal qui ont été testés dans l'écran secondaire sur enzyme saccharifié formulations hydrolysat de différentes richesse nutritionnelle.
2. Note chaqueisolat testé dans l'écran secondaire sur la base du taux d'absorption du xylose et le rendement en éthanol effectué sur trois formulations d'hydrolysats enzymatiques-saccharifié prétraité exécuter en double exemplaire, y compris AFEX CSH (i = 1 et 2), SGH-N1 (i = 3 et 4) et SGH -N2- (i = 5 et 6).
3. Calculer le RPI _global pour chaque isolat, et appliquer ce paramètre classement pour vanner davantage la liste des isolats supérieurs: RPI _globale = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, où n = 6 .
   NOTE: Démontrer la cinétique d'isolats supérieurs dans hydrolysats SGH-N2 dans des cultures en flacons en suivant les procédures décrites dans Slininger et al ^18.

Résultats

S. stipitis a évolué en utilisant des combinaisons de trois cultures de sélection, qui comprenait AFEX CSH, PSGHL et culture continue xylose-fed éthanol contesté. La figure 1 montre le schéma des expériences d'évolution réalisées avec les isolats trouve soit d'effectuer le plus efficacement dans l' ensemble, ou plus efficacement sur l' un des hydrolysats testés. le tableau 3 présente les numéros d'accession NRRL de ces isolats supérieurs et ré...

Discussion

Plusieurs étapes ont été essentiels à la réussite du processus d'évolution. Tout d'abord, il est essentiel de choisir des pressions de sélection appropriés pour entraîner l'évolution de la population vers les phénotypes souhaités qui sont nécessaires pour une application réussie. Les contraintes sélectives suivantes ont été choisies pour S. stipitis développement et appliqué à des moments appropriés pour guider l' enrichissement pour les phénotypes souhaités: les forces cr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com