Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Résumé

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Résumé

Augmentant la preuve indique que l’hématopoïèse normale est régulée par des signaux micro-environnementales distinctes dans le BM, incluent des niches cellulaires spécialisés modulant critique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) fonctions^1,2. En effet, un tableau plus détaillé du microenvironnement hématopoïétique est maintenant émergents, où les endostéale et les niches endothéliales forment des unités fonctionnelles pour la réglementation des HSC normale et leurs descendants^3,,^4,5 . De nouvelles études ont révélé l’importance des cellules périvasculaires, les adipocytes et les cellules neuronales dans le maintien et la régulation HSC fonction^6,7,8. En outre, il y a des preuves que les cellules de lignées différentes, c'est-à-dire des cellules myéloïdes et lymphoïdes, accueil et résident dans des créneaux précis dans le microenvironnement de la BM. Toutefois, une cartographie complète du microenvironnement de la BM et de ses occupants est toujours en cours.

Des lignées de souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques de lignée ou des souris génétiquement modifiées pour manque de molécules sélectionnées dans des cellules spécifiques de la niche de la BM sont maintenant disponibles. Knock out et lignée suivi de modèles, en combinaison avec des approches de transplantation, fournissent l’occasion d’affiner les connaissances sur le rôle particulier « niche » cellules pour des populations hématopoïétiques définies, telles que HSC, lymphocytes B, lymphocytes T, cellules myéloïdes et cellules érythroïdes. Cette stratégie peut encore être potentialisée par la fusion de l’utilisation de la microscopie biphotonique de la voûte crânienne. En fournissant en vivo imagerie à haute résolution et rendu 3D de la voûte crânienne BM, nous pouvons maintenant déterminer précisément l’emplacement où des sous-ensembles spécifiques hématopoïétiques maison dans le BM et évaluer la cinétique de leur expansion au fil du temps. Ici, Lys-GFP souris transgéniques (marquage des cellules myéloïdes)⁹ et RBPJ souris knock out (manque de signalisation canonique de Notch)¹⁰ sont utilisés en association avec IVFM pour déterminer la prise de la greffe des cellules myéloïdes à un micro-environnement encoche de la BM défectueux.

Introduction

La microscopie intravitale fluorescence multiphotonique (IVFM) est une puissante technique d’imagerie qui permet l’imagerie haute résolution, en temps réel de tissus avec la profondeur jusqu'à 1mm, selon le tissu. Lorsqu’elle est appliquée à la voûte crânienne de souris, il permet d’observer le comportement des cellules hématopoïétiques au sein de la BM de manière non invasive vers le haut à 60-100 μm¹¹. Cette approche est utilisée ici pour déterminer la cinétique de prise de greffe des progéniteurs myéloïdes normales dans les souris knock-out BM de RBPJ manque de signalisation canonique de Notch.

Des travaux récents de notre groupe a démontré cette signalisation Notch canonique défectueux dans le microenvironnement BM entraîne une maladie myéloproliférative semblable ๲. Perte de la signalisation Notch a été obtenu par suppression conditionnelle de la domaine obligatoire d’ADN de RBPJ, le facteur de transcription critique en aval de la protéine Notch canonique, de signalisation, à l’aide de Mx1-Cre induite par recombinaison¹⁰. Dans cette étude, on a utilisé le modèle de souris de^lox/lox de Mx1-Cre/RBPJ. Suppression conditionnelle du motif de liaison à l’ADN de RBPJ entraîne la perte de la signalisation de tous les récepteurs Notch. Dans le modèle de Mx1-Cre, Cre expression est entraînée par le promoteur de Mx1 activé par voie de c résultant dans l’induction de la délétion de gène ciblé en cellules de sang ainsi que dans composants stromales d’organes multiples, y compris les BM, rate et le foie.

MX1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox et Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox souris induite avec c (indiqué sur le connaissement comme RBPJKO et RBPJWT, respectivement) ont été mortellement irradiés et transplantées avec cellules hématopoïétiques normales, type sauvage. À partir de la semaine 4 après la transplantation, destinataires RBPJKO développé leucocytose importante suivie d’une splénomégalie. Bien que souris RBPJKO présenté augmentation du pourcentage des progéniteurs myéloïdes dans le BM en semaine 8 après la transplantation et à des moments plus tard, analyse de la BM aux semaines 4 et 6 n’ont pas révélé de différences marquantes dans leur contenu cellulaire myéloïde par rapport au contrôle RBPJWT bénéficiaires. Cette observation, combinée au fait que Mx1-Cre est exprimé dans les différents organes hématopoïétiques, a demandé si le microenvironnement de la BM avait un impact direct sur l’initiation du phénotype syndromes myéloprolifératif.

Pour déterminer si la BM a un site critique initial du développement de la maladie, IVFM de la voûte crânienne de souris a été utilisé en combinaison avec la BM transplantation (BMT), le modèle de knock out RBPJ et une lignée de système de suivi. Des souris transgéniques exprimant EGFP sous le contrôle du promoteur (Lys-GFP) lysozyme spécifique⁹ ont été utilisés pour obtenir des cellules du donneur qui pourraient être visualisés au cours de la BM d’imagerie après BMT. Expression de lysozyme est spécifique aux cellules myéloïdes et Lys-GFP marque cellules du progéniteur myéloïde commun (CMP) pour les granulocytes mature¹³.

IVFM de la BM à des moments différents a démontré que les cellules de Lys-GFP Hébergement de la même façon aux destinataires BM de RBPJWT et RBPJKO, mais développé et implanté plus rapidement chez les receveurs de BM de RBPJKO. Cette différence a été dramatique au point antérieur dans le temps (semaine 2) et diminuait avec le temps (semaines 4 et 6). Cependant, à ces moments plus tard, évaluation du compartiment hématopoïétique chez le receveur même a montré une augmentation constante du nombre de cellules myéloïdes circulant dans le PB et localisée dans la rate des souris RBPJKO, indiquant une augmentation de la production de cellules de la BM dans la circulation. Analyse de la localisation de cellules Lys-GFP dans le BM de souris transplantées à 6 semaines a révélé que les cellules myéloïdes résidaient plus éloigné de la vascularisation dans le microenvironnement de la RBPJKO que dans le contrôle.

Collectivement, la combinaison de IVFM avec ces modèles animaux spécifiques fournies aperçus dans la dynamique de la prise de greffe de cellules myéloïdes dans le microenvironnement RBPJKO BM. La conception expérimentale et l’approche quantitative décrit ici est proposé comme un paradigme qui peut être appliqué pour répondre à des questions similaires. Par exemple, l’utilisation d’une autre lignée de cellule spécifique suivi de modèles, tels que RAG1-GFP¹⁴ ou¹⁵ souris Gata1-GFP peut permettre à la suite du comportement de lymphoïdes ou progéniteurs érythroïdes, respectivement, à la BM.

Protocole

Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été effectuées avec l’autorisation des utiliser Comité d’Indiana University School of Medicine et animalier. S’assurer qu’elle respecte la législation sur l’expérimentation animale du pays où le travail est exécuté.

1. préparation des Mx1CreRBPJ^{- / -} souris destinataire

1. Traverser la souris Mx1-Cre⁺ avec RBPJ^lox/lox souris¹⁰ pour obtenir Mx1-Crepositive ^RBPJlox/lox souris¹² et Mx1-Cre négatif même^lox/lox RBPJ à utiliser en tant que contrôles. Vérifiez le génotype par PCR¹⁰.
2. Utiliser 6-8 semaines-vieux Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox et Mx1Cre^–/RBPJ^lox/lox souris pour effectuer l’induction c.
3. Injecter c 200 µg i.p. Cre⁺ et Cre^– souris. Donner une injection c tous les deux jours pendant 3 jours la première semaine. Donner une injection c la deuxième semaine, 7 jours après l’injection précédente (quatre injections au total).
   1. Utilisez RBPJKO (induite par Mx1Cre⁺/RBPJ^lox/lox) et RBPJWT (induit Mx1Cre^–/RBPJ^lox/lox) souris comme bénéficiaires 3 semaines après la dernière injection de c.
      Remarque : Il est recommandé d’utiliser des souris induites par pI : pC 3 semaines après l’injection. La réponse de l’IFNα déclenchée par c induit des changements importants dans le BM, ayant pour résultat l’expansion immunophénotypiques des HSC et diminution du débit des progéniteurs matures dans le sang périphérique^16,17. Représentation des sous-ensembles hématopoïétiques est normalisé à 3 semaines après que l’injection et les souris peuvent être utilisés sans les effets confondants de l’inflammation. Ce protocole d’induction a été optimisé pour RBPJ. Si la suppression d’un gène différent, le protocole d’induction peut varier en fonction de la construction, et la suppression doit être validée. Nous avons validé la suppression de ~ 100 % de la région RBPJ entre les sites loxP par RT-PCR après un total de quatre injections de c.

2. préparation des cellules de moelle osseuse pour le donateur Lys-EGFP destinés à la Transplantation

1. Euthanasier un souris Lys-EGFP (dioxyde de carbone suivie par dislocation cervicale) 1 ou 2 h avant la transplantation.
2. Vaporiser sur la surface du corps animal avec l’éthanol à 70 %.
3. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à faire une incision de la peau sur les deux jambes autour de la cheville avec une pince chirurgicale arracher la peau et fourrure pour exposer le tissu musculaire propre.
4. Utiliser des ciseaux chirurgicaux pour retirer les jambes autant musculaire que possible. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper les os (au genou et articulation de la cheville) et nettoyer n’importe quel tissu de muscle restants des fémurs et des tibias à l’aide de gaze éponges. Placer les os (deux fémurs et deux tibias) dans une plaque 6 puits contenant DMEM 10 % FBS.
5. Broyer les os dans un mortier avec 10 mL froid 2mM EDTA PBS et pipette les cellules de la moelle osseuse pour mettre les cellules en suspension monocellulaire. Vous pouvez également rincer les os avec des temps de 2 mM EDTA PBS 3 de chaque côté avec une seringue de 1 mL.
6. Filtrer les cellules de la moelle osseuse en utilisant un filtre de 70 µm dans un tube à centrifuger 15 mL. Rincer le filtre avec 2-3 mL de PBS. Tourner les cellules vers le bas de 10 min à 460 x g, remettre en suspension les cellules dans 10 mL de DMEM frais 10 % FBS.
7. Compter les cellules de moelle osseuse sur un hémocytomètre et ajuster la concentration de 1,5 x 10⁷ cellules/mL dans IMDM sans sérum. Utiliser 3 x 10⁶ cellules / animal ayant un volume de 200 µL. Cellules d’environ 1/3 du total BM sont GFP + cellules myéloïdes. Laissez les cellules sur la glace jusqu’au moment de l’injection. Utilisation de 0,5 x 10⁵ cellules afin de déterminer l’expression de la GFP par FACS⁹.

3. moelle osseuse Transplantation de cellules de Lys-GFP dans des souris RBPJKO

1. Retenir le destinataires souris dans une cage de la tarte. Irradier la souris avec une dose mortelle de rayonnement gamma (1 200 Rad) sur un irradiateur Cs 137. Utiliser un protocole de dose de split : 900 rads le soir suivi par 300 rads le lendemain matin (16 h d’intervalle).
2. Transplanter les mortellement irradiés souris destinataires, RBPJWT et RBPJKO 5-6 h après la deuxième dose de rayonnement. Injecter la BM cellules prélevées chez des souris de Lys-EGFP à une concentration de 3 x 10⁶ cellules / animaux via queue injection dans la veine (voir détails pour la récolte des cellules à l’article 2).
3. Cohortes indépendantes des souris transplantées par IVFM à des moments différents de l’image : 24 h et à la semaine 2, 4 et 6, comme décrit ci-dessous (voir la section 4 & 5 pour in vivo procédure d’imagerie).

4. chirurgie préparation pour l’imagerie intravitale

1. Stériliser les instruments chirurgicaux. Deux fines pinces (une Quinte, un angle), une paire de ciseaux fines et une paire de porte-aiguilles. Préparez la zone opératoire avec toutes les fournitures nécessaires à la procédure.
2. Donnez la souris une injection Intrapéritonéale de kétamine anesthésique cocktail (Xylazine 2,5 à 5 mg/kg + acépromazine 1,0 à 2,5 mg/kg + kétamine 90-100 mg/kg) à l’aide d’une seringue à aiguille 26-28 G.  Animal se fera toutes les 15 min pendant la procédure et anesthésique sera complété si nécessaire à un quart de la dose originale.
3. Placez la souris sur une source de chaleur appropriée (coussin chauffant de 37 ° C, animal protégé contre les contacts directs avec le coussin chauffant) et surveiller visuellement la fréquence respiratoire.
4. Vérifier la réponse de pincement de réflexes à l’aide de l’orteil. Veiller à ce que l’animal est complètement sous anesthésie avant d’entamer toute procédure chirurgicale.
5. Utilisez un 26-28 calibre aiguille seringue pour donner des souris une injection dans la veine queue d’un marqueur fluorescent vasculaire (Dextran, 100 μL de solution de 20 mg/mL).
6. Appliquer pommade ophtalmique vétérinaire sur les deux yeux. Inciser la surface dorsale de la tête de l’animal avec une petite tondeuse électrique. Appliquer une épilation crème pour 5 min. utilisation gaze éponges pour enlever la crème et ensuite rincer avec du sérum physiologique. Préparer le cuir chevelu propre avec de l’alcool 70 % à l’aide d’un coton-tige.
7. Utilisez fines pinces et ciseaux à faire une incision de la peau de petites médiane (10-20 mm) sur le cuir chevelu pour exposer la surface dorsale crâne sous-jacente. 5-0 soie chirurgicale permet de placer deux sutures de séjour dans la peau de chaque côté de l’incision, créant un lambeau pour exposer la voûte crânienne pour l’imagerie.
8. Positionnez les souris sur leur dos et submerger l’exposés du cuir chevelu dans un fond plat en verre rempli d’huile de microscope. Le transport de l’animal à la mutiphoton salle d’imagerie.
9. Placez l’animal sur la platine du microscope avec la voûte crânienne positionné sur le plat de verre au-dessus de l’objectif et puis couvrir avec un 37coussin chauffant ° C (les animaux doit être protégé contre un contact direct avec la chaleur).

5. in Vivo imagerie à haute résolution de la voûte crânienne de souris

1. Utiliser un système confocal inversé modifié pour l’imagerie multiphoton (voir la Tablede matières ). Instructions du fabricant suivant tune un laser 2 photons à 830 nm, placez une 20 W X, NA 0,95 objectif dans le morceau de nez de microscope et vérifier l’alignement du faisceau laser.
   NOTE : Systèmes de microscope droit sont plus couramment utilisés pour ces études, mais un système multiphoton inversé peut également être utilisé. Dans cette étude, un appareil stéréotaxique atraumatique conçu personnalisé a été utilisé. Il existe plusieurs dispositifs stéréotaxiques commercialement disponibles pour les systèmes de microscope vertical, il n’y a aucun appareil stéréotaxique commercialement disponible pour un système de microscope inversé qui vise à assurer le crâne de souris. Comme alternative à un appareil stéréotaxique personnalisé, le crâne peut être fixé en position au-dessus de l’objectif en utilisant diverses méthodes de ruban ou de la colle pour la stabilité.
2. Ouvrez un logiciel d’acquisition image. Dans les « paramètres d’Acquisition » panneau de vérifier si un mode de balayage directionnel est sélectionné. Configurer la vitesse de balayage de 4 μs/pixel, cadence à 512 x 512 pixels et zoom à 1,5. Sélectionnez 20 objectif Na W X 0,95 dans la liste des objectifs disponibles pour assortir la lentille placée dans l’embout.
3. Accéder à la liste « colorant » de le « Image Acquisition » panneau de configuration et sélectionnez « Deux photons ». Ouvrez la fenêtre « Chemin de lumière & colorants », puis sélectionnez excitation DM690-980 DM. ouvrir l’obturateur de laser 2p en cochant la case à cocher dans l’appareil Laser 2. Dans la fenêtre de « Contrôleur de Microscope », sélectionnez RDM690 miroir.
4. Sélectionnez « EPI LAMP », choisissez cube epi-filtre B/G et concentrer l’objectif sur le spécimen de visualiser le flux vasculaire et le créneau de la moelle osseuse voûte crânienne, en utilisant comme référence la bifurcation de la veine centrale (a) et la suture coronaire (b) (Figure 2 a).
5. Recueillir les images en mode non-descanned. Sélectionnez les trois détecteurs externes : PMT detector1 de recueillir le signal SHG de collagène (filtre d’émission - 430/100 nm), GaAsP detector2 à frais virés GFP signal (filtre d’émission - 525/50) et detector3 GaAsP de recueillir le signal de TRITC-dextran (filtre d’émission - 605/90 nm).
   1. Effectuer la formation image à une vitesse de balayage de 4μs/pixel avec aucun étalement pour minimiser la phototoxicité. Recueillir les images à un gain de puissance et détecteur laser constant ajusté pour utiliser la plage dynamique complète du détecteur avec saturation minimale.
   2. Recueillir série des sections par le biais de la profondeur du tissu (60 x 1 μm Z-stacks) de 6 régions de moelle osseuse voûte crânienne. Utilisez les paramètres de taille d’étape de 1 μm, zoom 1,5 et taille d’image de 512 x 512 pixels (423 µm x 423 µm).
      Remarque : Dans l’ensemble temps total nécessaire à l’image d’une souris est 1 à 1,5 h.

6. Analyse Quantitative

1. Effectuer des reconstructions de quantification et 3D image en utilisant un logiciel de visualisation et d’analyse quantitative dédié image 3D/4D selon les instructions du fabricant (voir Table des matières). Visualiser interactivement Z-piles en 3D utilisant la Projection maximale d’intensité (MIP), alpha-blend ou algorithmes de rendu volume shadow projection.
2. Segmenter les cellules GFP en utilisant le "module de segmentation Spot objet ». Appliquer le traitement arithmétique de la pile (soustraction de canal) pour éliminer les faux positif compte de cellules GFP (cela élimine les signaux des cellules osseuses affichant forte fluorescence dans les canaux vert et rouge).
3. Effectuer la segmentation de surface système vasculaire et l’OS en utilisant le module de Surface de segmentation. Le cas échéant, calculer les distances des cellules à l’une des surfaces ci-dessus en appliquant des algorithmes de X-tension appelées « distance de spot à surface ».

Résultats

Cohortes de 2 RBPJKO et 2 RBPJWT bénéficiaires ont été photographiés dans une session individuelle d’imagerie à des moments différents : 24h et 2, 4 et 6 semaines après la transplantation de cellules BM Lys-GFP (flux de travail est illustré dans la Figure 1 a).

Dans chacune des souris, les images ont été acquises de 6 régions standards de la voûte crânienne BM, identifiées par leur position par...

Discussion

Ce protocole décrit un modèle expérimental optimisé pour étudier la cinétique de prise de greffe de cellules hématopoïétiques de la microscopie intravitale fluorescentes. Dans cette étude, l’expansion des cellules myéloïdes progénitrices dans un BM WT ou dans une encoche de signalisation défectueux BM a été suivie dans la voûte crânienne osseuse de cellules myéloïdes de Lys-GFP positives suivantes après les OGEC dans RBPJWT ou RBPJKO destinataires. Cette approche est proposée comme un modèle qui ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software