In Vitro perméation de ferritines FITC-chargés sur un Rat barrière hémato-encéphalique: un modèle pour l' étude de la prestation de Nanoformulated Molecules

Résumé

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Résumé

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Introduction

La résistance du système nerveux central (SNC) , des maladies ( par exemple. Le cancer, l' épilepsie, la dépression, la schizophrénie et le trouble neurologique associée au VIH) à des thérapies pharmacologiques est due à divers mécanismes, y compris la perméation du médicament difficile à travers la barrière hémato-encéphalique (BBB) . La BHE est la limite qui permet d'isoler les tissus cérébraux des substances qui circulent dans le sang. Au sein de cette barrière, une couche de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMECs), soutenus par péricytes et astrocytes endfeet, est responsable de la grande sélectivité de la BHE à ces médicaments hydrosolubles avec un poids moléculaire supérieur à 400 Da ^1. Un autre mécanisme de résistance liée à la drogue est liée à la présence sur BMECs des transporteurs à efflux (protéines P-glycoprotéine et de résistance multidrogue), qui coopèrent pour réduire la pénétration du médicament dans le système nerveux central et faciliter leur extrusion du cerveau ^2.

Dans la dernière décennie, Un grand nombre d'approches nanotechnologiques ont été développés pour relever le défi clinique et biologique de fournir des médicaments à travers le ^3-6 BBB. Dans ce contexte, nanosphères ferritine (FNN) représentent une solution totalement innovante et prometteuse. FNN sont des sphères 12 nm de 24 ferritine auto-assemblage (Fn) des monomères qui sont disposés dans une structure sphérique creuse de diamètre intérieur 8 nm. les sous-unités de ferritine peuvent être démontées à pH acide et réassemblés de façon à mémoire de forme en amenant le pH à la neutralité, ce qui permet diverses molécules organiques à encapsuler. Par conséquent, FNN représente un modèle intéressant pour le développement de l' administration de médicaments multifonctionnels systèmes ^7,8. En outre, FNN peut interagir avec BMECs grâce à la reconnaissance spécifique du récepteur de la transferrine (TfR) 1, qui est exprimé sur la membrane luminale de ces cellules ^9.

Jusqu'à présent, différents modèles in vitro du BBB ont été développés en order pour élucider trans-BBB perméabilité à divers médicaments, toxicité vers le BBB, ou l'interaction des molécules avec des transporteurs d'efflux. En effet, ces modèles sont considérés comme valides des approches in vitro pour un dépistage rapide de molécules actives avant de procéder à des études in vivo. Ces modèles sont constitués d'une seule couche endothéliale de BMECs ou BMECs et astrocytes co-culture (plus rarement péricytes), obtenu à partir d' animaux (rat, souris, porcs et bovins) ou des lignées cellulaires humaines ^10,11,12. La résistance électrique transendothéliale (TEER) et la perméabilité apparente (P _app) des traceurs avec un poids moléculaire défini représentent deux paramètres critiques qui sont utilisés pour déterminer la qualité du modèle in vitro. Ici , nous décrivons l'emploi d'un modèle BBB in vitro, sur la base d' une co-culture de rat BMECs (RBMECs) et le rat astrocytes corticales (OIEC) pour étudier la pénétration trans-BBB de nanocages ferritine encapsuler isothi fluorescéineocyanate (FITC).

Protocole

1. Mise en place du modèle BBB

Remarque: Pour établir le modèle BBB, nous vous suggérons d'utiliser RBMECs primaires disponibles dans le commerce et RCAs. Toutes les étapes doivent être effectuées avec des réactifs et consommables stériles, manipulés dans une hotte à flux laminaire.

1. Culture de cellules
   1. Manteau des flacons de culture cellulaire avec poly-L-lysine 100 pg / ml (1 h à température ambiante) ou fibronectine 50 pg / ml (1 heure à 37 ° C) afin de promouvoir l'attachement des RCAs ou RBMECs, respectivement. Ensuite, décongeler 1 x 10 ⁶ et 5 x CR 10 ⁵ RBMECs dans des cellules endothéliales supplémenté avec 5% de sérum de fœtus bovin, le supplément de croissance cellulaire endothélial à 1% et 1% de pénicilline / streptomycine (SecM). RCAs de semences dans un flacon T175 dans 20 ml SECM et RBMECs dans un flacon T75 dans 10 ml SECM.
      Note: La décongélation et passages d'ensemencement de RCAs et RBMECs doivent être ajustés, en termes de densité et de temps dans la culture cellulaire, en fonction du nombre de conditions expérimentales à tester avec le modèle du Bureau. En débutment avec une fiole de 1 x 10 ⁶ et CR 1 flacon de 5 x 10 ⁵ RBMECs, il est possible d'obtenir jusqu'à 20 plaquettes BBB roulement.
   2. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de _CO2 dans une atmosphère humidifiée pendant environ 6 jours, jusqu'à environ 80% de confluence pour RCAs et plus de 90% de confluence pour RBMECs. Détacher les cellules en utilisant une solution de trypsine-EDTA (trypsine 1: 250) pendant 5 min (1 ml de trypsine pour les flacons T75 et de 2 ml pour les flacons T175). Arrêtez l'activité de la trypsine avec SECM (2: 1), les suspensions cellulaires de centrifugation à 750 g pendant 5 min et remettre les pastilles dans 60 ml SECM.
   3. Divisez les RBMECs dans 3 flacons T175 et la culture en SECM pendant encore 3 jours avant le semis sur inserts. Compter le nombre total de la vie RCAs, en observant une suspension cellulaire diluée 1: 1 avec le bleu trypan sous un microscope optique dans une chambre Burker.
2. Cellule Semis sur Inserts
   1. Traiter un côté du polyéthylène téréphtalate (PET) membrane de transpa 6 multi-puitsinserts ent de poly-L-lysine 100 pg / ml et de l'autre côté de fibronectine à 50 ug / ml, pour permettre la fixation de RCAs et BMECs. Manipuler les inserts avec des pinces afin d'éviter tout contact avec la membrane PET.
      1. Placez les inserts dans une plaque à 6 puits et ajouter la solution de fibronectine (minimum 500 pi) dans la chambre supérieure. Après 1 heure d'incubation à 37 ° C, retirer la solution de fibronectine, prendre les inserts au large de la plaque multi-puits et mettez - les à l' envers sur le fond d'un 150 cm plat ² Petri, qui est utilisé ici comme un support stérile pour la déjà revêtu des inserts.
      2. Ajouter doucement 800 ul de poly-L-lysine sur la face inférieure de l'insert (comme représenté sur la figure 1A, dénommé CR ensemencement), et maintenir la solution sur les inserts pendant 1 heure à température ambiante.
      3. Aspirer la solution et laisser les inserts sécher à température ambiante pendant 15-30 min. Les inserts sont maintenant prêts pour l'ensemencement des cellules, mais ils peuvent également être stockés dans la plaque multi-puits pour plusieursjours à 4 ° C, avant de procéder à la construction BBB.
         Note: Rappelez-vous de garder au moins 3 inserts enrobés exempts de cellules, pour être utilisés comme témoins pour valider BBB établissement par FD40 mesures de flux.
   2. RCAs graines (35 000 / cm ²⁾ sur le côté inférieur des plaquettes de poly-L-lysine, en déposant 800 pl de suspension cellulaire sur la plaquette à l' envers (figure 1A). Laisser la suspension RCA sur les inserts pendant 4 heures à la température ambiante, afin de permettre la fixation efficace des cellules à la membrane.
   3. Aspirer la solution résiduelle, on place les inserts dans les puits contenant 2 ml de SecM et de maintenir la plaque multi-puits à 37 ° C et 5% de _CO2 dans une atmosphère humidifiée, en changeant la SecM tous les 2 jours.
   4. Après 3 jours, lorsque les RCAs ont revêtu la face inférieure de l'insert, RBMECs de semences sur la face supérieure de l'insert, suivant ces étapes:
      1. Détachez RBMECs de flacons T175 et compter leles cellules vivantes totales, tel que rapporté dans les étapes 1.1.2 et 1.1.3.
      2. RBMECs de graines (60,000 / cm ²⁾ sur la surface supérieure de l'insert dans SECM (1000 pi) (figure 1B), laissant 3 inserts avec seulement les astrocytes, à utiliser comme TEER fond. Placer la plaque multi-puits dans des conditions de culture standard. Maintenir le système à la culture pendant au moins 3 jours, en changeant la SecM dans la chambre intérieure inférieure et tous les 2 jours.

2. BBB Validation

1. TEER mesure
   1. Sur le 3 ^ème jour de co-culture, vérifiez la TEER en insérant les inserts BBB portant dans une chambre appropriée (qui a une casquette et où à la fois la chambre et le bouchon contiennent une paire de tension de détection et électrodes de courant), rempli de 4 ml de SECM. Se connecter à un épithéliale volts de tissu / ohmmètre.
   2. Ensemble avec les mesures de TEER des cellules BBB-systèmes, enregistrer les valeurs TEER des 3 inserts portant les RCAs eà sera soustrait des valeurs obtenues avec le BBBs. Multipliez les valeurs TEER résultant par la surface de l'insert (4,2 cm ²⁾ afin d'exprimer les résultats sous forme de Ω x cm ^2.
   3. De la 3 ^ème jour de co-culture, mesurer la TEER chaque jour. Remarque: Après une première période où le TEER augmente, les valeurs enregistrées devraient rester stables pendant au moins deux jours consécutifs (généralement entre le 5 ^e et le 7 ^e jour de co-culture). À ce stade, le BBB est prêt pour la deuxième étape de validation (section 2.2) et / ou pour les expériences trans-BBB.
      Remarque: La procédure décrite dans la section 2.1 peut être effectuée sur les mêmes BBB-systèmes dédiés aux expériences de perméabilité suivantes (section 3). Faire fonctionner dans des conditions stériles.
2. Trans-BBB Flux de FITC-dextran 40 (FD40)
   1. Mesurer le flux FD40 de la partie supérieure à la chambre inférieure des modèles BBB par rapport à celle sur 3 inserts vides(Voir la note de la section 1.2.1) selon les étapes suivantes:
      1. Ajouter 1 mg / ml FD40 (dilué dans SECM) dans le compartiment supérieur du BBBs, et après 1, 2 et 3 h retirer 200 pi SECM de la chambre inférieure et de mesurer l'intensité de fluorescence par spectrofluorimètre (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, fente 5).
      2. Obtenir les valeurs de SECM fond fluorescenceby mesurant 500 pi de milieu vierge en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la SECM fluorescence de fond de toutes les valeurs de fluorescence FD40.
      3. Déterminer la quantité de FD40 pénétrée par comparaison des valeurs de fluorescence observée avec une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues (p. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 pg / ml) du traceur fluorescent dissous dans 500 ul de SecM.
      4. Calculer le coefficient de perméabilité apparente (P _APP) à partir des valeurs moyennes de flux selon l' équation :
         P _app = J / AC
         Où J est le flux de la molécule (mole / s), A est la surface de perméation (cm ²⁾ et C est la concentration de la molécule dans le compartiment supérieur (mole / cm ^3).
         Note: Trois ou plus BBB-systèmes qui ont atteint des valeurs TEER appropriées, doivent être exclusivement consacrés à cette procédure de validation, et ne doivent pas être utilisés pour les expériences de perméabilité suivantes (section 3). Stérilité est pas obligatoire.

3. Trans-BBB perméation de FITC-chargé ferritines (FNN)

Remarque: Une variante recombinante de ferritine humaine (Fn), produite dans Escherichia coli et assemblé en nanocages (FNN) pour l'encapsulation de différentes molécules fluorescentes, est disponible à partir du NanoBioLab du Prof. Prosperi (Université de Milan-Bicocca, Italie). FNN sont chargés avec FITC, selon un protocole décrit précédemment ¹³ et les concentrations des deux Fn et les molécules chargées sont exactement détermined.

1. Trans-BBB Flux de FITC et FITC-FNN
   1. Mesurer le flux FITC FNN de la partie supérieure à la chambre inférieure de modèles BBB validés (habituellement au 5 ^ème - 7 ^ème jour de co-culture), par rapport à celle du colorant libre après 7 et 24 heures d'incubation, selon les étapes suivantes:
      1. Ajouter FITC-FNN (50 pg / ml FNN, 1,1 uM FITC) ou un montant égal à la libre FITC dans la chambre supérieure d'au moins 6 systèmes BBB pour chaque formulation, afin de retirer 2 ml de solution SECM de la chambre basse du au moins 3 inserts après 7 h, et de la chambre basse du 3 autres inserts après 24 h.
      2. Mesurer l'intensité de la fluorescence de 500 ul des échantillons prélevés par spectrofluorimètre (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, fente 5).
      3. Obtenir la fluorescence de fond SECM en mesurant 500 pi de milieu en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustraire la fluorescence de fond SECMde toutes les valeurs de fluorescence FITC ou FITC FNN.
      4. Déterminer la concentration de FITC infiltrée ou FITC FNN en comparant les valeurs de fluorescence obtenues avec deux courbes d'étalonnage différentes produites avec des concentrations connues (p. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nm) du colorant libre ou nanoformulated dissous dans 500 SecM ul.
2. FITC-FNN Localisation dans RBMECs
   1. Retirer SECM de la chambre supérieure des systèmes BBB, se laver les inserts avec PBS et fixer les RBMECs sur au moins deux inserts pour chaque groupe expérimental en ajoutant 500 ul paraformaldéhyde (4% dans un tampon phosphate salin-PBS) dans le compartiment supérieur pour 10 min à température ambiante.
   2. Laver les inserts trois fois avec du PBS pour éliminer le paraformaldehyde résiduel.
      Remarque: A partir de ce point, la stérilité est pas nécessaire.
   3. Coupez des morceaux appropriés de la membrane PET, et procéder à la immunodecoration des cellules selon les étapes suivantes:
      1. PermeabiRBMECs liser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes. Effectuer une étape de blocage pendant 1 heure à température ambiante avec une solution contenant 2% d'albumine de sérum bovin (BSA), le sérum de chèvre à 2% dans du PBS. Incuber les échantillons avec un anticorps anti-facteur Von Willebrand (VWF), à une dilution 1:20, pendant 2 heures à la température ambiante.
      2. Après trois lavages avec du PBS, exposer les cellules pendant 2 heures à température ambiante à une BSA 2%, une solution de sérum de chèvre à 2% contenant un anticorps secondaire approprié à une dilution 1: 300 dans le but de mettre en évidence l'anticorps anti-REO, et DAPI à 1: 1500 dilution pour la détection des noyaux.
   4. Monter les pièces d'insertion sur des lames de microscope en utilisant une solution de antifade de montage (une goutte par fragment d'insert), puis fermez l'échantillon avec une lamelle. Analyser par microscopie confocale en utilisant une lentille à immersion d'huile à un grossissement de 40X, 1,5 zoom et 1,024 x 1,024 pixels de résolution.

Résultats

Au cours de la mise en place du modèle de BBB, l'attachement et la croissance cellulaire sur les inserts peuvent être surveillés à l'aide d'un microscope optique grâce à la nature transparente de la membrane en PET. RCAs, ensemencées à une densité de 35.000 cellules / ^cm2, fixer efficacement à la face inférieure de l'insert après 4 heures d'incubation à la température ambiante (figure 2A) et se développer pour couvrir la surf...

Discussion

La méthode in vitro décrite ici représente une approche validée utile d'étudier la livraison trans-BBB de molécules fluorescentes sur nanoformulation avec des nanoparticules. Ici, nous utilisons FNN, ce qui représente un bon candidat pour étudier la translocation de molécules de fret à travers la BHE. FNN est considéré comme le nanovecteur d'or trans-BBB fourniture de médicaments / agents puisqu'il est spécifiquement reconnu par le récepteur TfR1, qui est exprimé sur la membrane lumi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000