Novel Exploration de l'objet comme un test potentiel pour ordre supérieur Comportements répétitifs chez la souris

Résumé

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Résumé

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Introduction

Troubles du spectre autistique (TSA) est un trouble neurodéveloppemental composé de trois principaux symptômes: perte de valeur sociale, la difficulté à communiquer par le langage et les comportements à motifs répétitifs ^1. Depuis 2000, le nombre de personnes qui ont été diagnostiqués avec TSA a augmenté , passant de 1 150 à 1 à 68 en l'espace de dix ans ^2. Bien que la prévalence de la maladie continue à augmenter, la cause de la maladie est encore inconnue. Il y a eu une augmentation des efforts pour identifier des modèles de souris appropriés pour le noyau et les symptômes des TSA, car ces modèles pourraient conduire à une meilleure compréhension des symptômes et les causes sous-jacentes de TSA. Il existe des souches de souris consanguines multiples qui semblent afficher des comportements avec une validité pour les principaux symptômes de TSA, y compris des comportements répétitifs ^3.

Restreintes, des comportements répétitifs (ORR) sont un symptôme de base de certains troubles psychiatriques tels que la TSA.ORR peut augmenter avec la sévérité de la maladie ^4, et peuvent considérablement perturber le mode de vie des personnes touchées. ORR sont couramment placés dans deux catégories, d'ordre inférieur comportements répétitifs, qui chez l'homme sont constitués d'actions telles que bascule et de la main-battement; et d'ordre supérieur des comportements répétitifs, qui consistent en le strict respect de la routine et la résistance au changement ^5-8.

Basse-ordre des comportements répétitifs ont été largement étudiés chez les rongeurs où ils se manifestent comme stéréotypies motrices, qui peuvent être facilement observés dans la fixation d' un laboratoire ^9. Ces comportements semblent avoir une bonne validité de visage pour ORR chez l' homme, et potentiellement forte validité conceptuelle et ^10. Test de la présence des ORR d'ordre inférieur peut être complété par une surveillance vidéo de l' activité de la souris pour étudier les combats et la durée de ces stéréotypies motrices ^11. ordre supérieur des comportements répétitifs posent un défi pour re biomédicale fondamentalerecherche utilisant des rongeurs, comme ces ORR ne sont pas aussi faciles à identifier par l'observation simple. En raison de la difficulté à identifier ces comportements, moins dosages établis pour ordre supérieur comportement répétitif existent. Traditionnellement, d'ordre supérieur ORR ont été mesurés chez les rongeurs en utilisant un paradigme de labyrinthe où l'animal d'essai est formé pour atteindre la compétence à échapper. L'emplacement d'échappement est alors commuté et le nombre d'essais requis pour re-connaître l'emplacement d'échappement est enregistré ^12. Ces tests ne sont pas idéales car elles nécessitent une longue période de formation, induisent souvent de l'anxiété, et peut entraîner des résultats très variables. Exploration Hole-conseil a également été utilisé pour quantifier d'ordre supérieur ORR ^13,14. Cette approche ne nécessite pas de sessions de formation étendues, mais ne repose sur la motivation des aliments et / ou de discrimination olfactive. Des dosages pour ORR d'ordre supérieur qui ne sont pas anxiogènes ou exigent la formation serait un bon complément au répertoire existant du trou bord exploratio n et des analyses basées sur labyrinthe actuellement en usage.

La souche de souris consanguine C58 / J (C58) illustre fortement des niveaux élevés de comportement stéréotypique associés aux TSA, à savoir répétitifs, stéréotypies motrices et sans but des niveaux élevés d'auto-toilettage ^3,11. En outre, les souris C58 affichent ORR par des niveaux élevés de l' élevage, le dos et le retournement scrabbling ^11,14,16. Cette souche commence à montrer ces comportements au début de la période néonatale et continue de les afficher à l'âge adulte. Il serait idéal pour être en mesure de tester la présence d'un ordre supérieur élevé ORR pour compléter les ORR d'ordre inférieur bien documentées présentes dans cette souche, ainsi que d'autres souches de souris. Le nouveau test d'exploration de l'objet décrit ici offre la possibilité aux chercheurs d'observer d'ordre inférieur et d'ordre supérieur ORR simultanément, car il donne la possibilité de mesurer les comportements à motifs ainsi que stéréotypies motrices répétitives.

e_content "> Utilisation nouvelle exploration de l' objet comme un essai pour un ordre supérieur des comportements répétitifs a été développé par Pearson et al. ^17. Cette nouvelle évaluation est une extension de l'essai en plein champ bien établi ^18-21 avec l'ajout de quatre nouveaux objets l'arène. les souris ont été autorisés à enquêter librement sur ces objets inconnus et le nombre et l'ordre des enquêtes de l'objet a été suivi. les enquêtes d'objets ont ensuite été analysés pour la présence de motifs, avec des souris BTBR affichant un nombre élevé d'enquêtes à motifs entre les objets. en utilisant cette test, les souris peut afficher d'ordre supérieur des comportements répétitifs et à motifs, tout en éliminant la nécessité d'apprendre des comportements ainsi que la suppression des stimuli inutiles. exploration de l'objet Novel induit d'ordre supérieur ORR, car elle permet aux souris pour créer des motifs et des séquences de forme par leur exploration naturelle . l'utilisation de ce test permet à l'enquêteur de quantifier la présence de ces ORR ordre supérieur.

Pearson et al. développé ce test et l'a utilisé pour tester la présence d'ordre supérieur des comportements répétitifs potentiels dans la souche de souris consanguine BTBR, avec des résultats intrigants ^17. Nous avons récemment publié une étude de suivi en regardant les comportements de la C58, C57BL / 6J (C57) et FVB / NJ (FVB) souches, ainsi que d'une enquête plus approfondie sur les variables de confusion potentiels présents dans cet essai, et possible approches statistiques pour analyser les données générées ^22.

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Protocole

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université de Redlands. Les souris C58, C57 et FVB utilisées dans ces études ont été élevés à l'Université de Redlands vivarium du stock initialement obtenu à partir du Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Sentinelles de ce vivarium ont été examinés tous les six mois et jugés exempts d'agents pathogènes.

1. Matériel et Room Set Up

Note: Nous avons utilisé deux arènes différentes pour les essais de nouvel objet: une cage rectangulaire en plastique transparent (45 cm x 24 cm x 20 cm) ou une cage circulaire opaque avec un diamètre de base de 41 cm; cependant, toute cage peut être utilisée. Pearson et al. , Utilise une cage rectangulaire plus petite (20 cm x 30 cm x 20 cm) dans leur analyse. Détails à partir de cette conception expérimentale spécifique sont inclus ci-dessous, mais étant donné la nouveauté de cet essai, il n'y a pas de normes acceptées dans le domaine de phénotypage comportemental pour l'une des variables décrites.

1. Remplir le terrain d'essai à environ ½ po de la literie de maïs en épi.
2. Sélectionnez quatre nouveaux objets différents. Sélectionner quatre objets qui sont à peu près les mêmes dimensions, constitués de matière plastique de haute densité pour faciliter le nettoyage et à résister à la mastication et différentes les unes des autres en forme et en couleur. Surtout, assurez-vous que les souris de test ne sont pas exposés à ces objets avant d'être exécuter dans le dosage.
   Remarque: Par exemple, une brique rose de jouet, un singe rouge, un carreau blanc avec l'écriture bleue et une matrice blanche standard ont été utilisés ici.
3. Dans l'arène rectangulaire, placer ces objets d'environ 3 cm à partir des coins. Dans l'arène ronde, placez les objets tels qu'ils sont à égale distance les uns des autres et d'environ 10 cm sur les côtés. Notez l'emplacement de chaque objet comme un autre numéro, 1-4 (Figure 1). Veiller à ce que les objets sont placés dans un ordre aléatoire ou frontal tout au long des essais.
4. Placer une caméra directement au-dessus des essaisarène pour enregistrer toute l'arène pendant les périodes d'acclimatation et d'essai.
   Note: Avoir les enquêteurs dans la même pièce avec les souris peuvent potentiellement influencer les niveaux et l'exploration activité au cours des essais.

2. Objet Novel Exploration test

1. Test au début du cycle de la lumière dans une pièce éclairée par un éclairage fluorescent à environ 100 lux. Assurez-vous que l'éclairage est uniforme à travers l'arène de test pour standardiser l'apparence pendant l'enregistrement vidéo.
2. Placer un notecard de dimensions connues dans le fond de l'arène de test et commencer l'enregistrement vidéo.
3. Transférer la souris de test dans un test arène vide pendant 10 min pour servir une période d'acclimatation. Enregistrement vidéo de la période d'acclimatation.
4. Après la période d'acclimatation, laissez la souris dans l'arène, ajouter rapidement les quatre nouveaux objets à l'arène de test et d'enregistrer le comportement de la souris pour un 10 minutes supplémentaires.
5. Une fois que la totalité des 20 minutes d'acclimatation / pe de testriode écoulée, retournez la souris de test dans sa cage à la maison et bien nettoyer et sécher les objets nouveaux et arène de test avec plat savon non parfumé et de l'eau.

3. Vidéo Scoring

1. Remplissez tous les comportements notation en utilisant la vidéo pour faciliter la fiabilité.
   Remarque: Le logiciel d'enregistrement du comportement Noldus L'observateur a été utilisé pour effectuer les étapes ²² comme décrit ici, mais un programme spécialisé est pas nécessaire:
   1. Avant de marquer la première vidéo, mis en place le projet dans le système logiciel d'enregistrement du comportement de codage en créant un nouveau projet ou en modifiant, un projet similaire existant.
      1. Dans la boîte de configuration du projet, définissez l'acquisition de données à «Offline Observation. Dans la boîte de codage du comportement, le programme "Scrabble", "Creuser", "Elevage", "toilettage" et "Object Sniff 1, 2, 3 et 4» comme «Événements d'État». Programme "Jumping" comme un "Point Event '. Note: Définitions pour ces comportements sont décrits en détail ailleurs ^11.
         Note: Etat des événements ont un démarrage et d'arrêt du temps, alors que Point Events recueillent tout simplement des données de comptage. Les touches pour chaque comportement discret sont générés par le logiciel et ces touches correspondantes sont programmées dans un clavier secondaire (étape 3.1.2).
      2. Pour programmer le clavier secondaire, ouvrez le logiciel du clavier, cliquez sur le bouton approprié secondaire du clavier affiché à l'écran, tapez la combinaison de touches appropriée, puis cliquez sur OK. Une fois que le clavier secondaire a été programmé, fermez le logiciel que le programme fonctionnera en arrière-plan de l'ordinateur.
   2. Une fois le projet et a été mis en place, utilisez le logiciel d'enregistrement de comportement pour marquer le nombre et la durée des arrières (définis comme les deux pattes avant d'être placé sur un mur de l'arène), creuse (définie comme deux pattes avant de la souris enfouissant dans la literie de l'arène), l'auto-palefreniers (défini comme le mOuse léchant une région de leur propre corps et / ou la souris de toucher une partie de la face avec leurs pattes avant), et les sauts (défini comme un élevage de souris, puis en sautant de telle sorte que les quatre pieds sont sur le sol en même temps).
      1. Pour marquer une vidéo, allez dans Fichier> Ouvrir un projet puis Observer> Observation> Nouveau. Le programme invite à entrer un nom de fichier. Une fois nommé, sélectionnez le fichier multimédia vidéo approprié.
      2. Commencez le score en cliquant sur le bouton Début Observation.
         Remarque: Lors de l'évaluation des comportements répétitifs de la souris, tous les Etats événements nécessitent deux frappes, la première correspondant à l'initiation du comportement et le second correspondant à la fin du comportement. Point Events ne nécessitent une seule touche.
   3. Note le nombre de fois la souris renifla chaque objet. Sniffs sont définis comme chaque fois qu'une souris se déplace de son nez à moins de 0,5 cm d'un objet. Mesurer la durée de sniff en utilisant un logiciel d'enregistrement du comportement de la même manière que Repetdurées de comportement itive ont été mesurées (étape 3.1.2).
      1. Chaque fois qu'une souris renifle un objet, enregistrer le numéro de position correspondant, ce qui conduira à une chaîne de nombres à la fin de la période d'essai de 10 min (par exemple 1243421 ...). enregistrer manuellement ces données.
         Remarque: Pour faciliter l'efficacité et la cohérence des données vidéos de notation, les chiffres correspondent toujours à une position donnée, pas d'objection.
      2. Si une souris renifle un objet, détourne le regard, puis renifle à nouveau l'objet, compte ce numéro deux fois.
      3. Une fois les 10 min vidéo complète a été marqué, visualiser les données en cliquant sur Analyse> Behavior Analysis> Nouveau. Une fois que les données apparaissent sur l'écran, l'exportation ou copier et coller dans une feuille de calcul distincte.
   4. Notez la distance totale de la souris a voyagé dans l'arène pendant le test.
      Note: Le logiciel de suivi vidéo, calibré pour suivre la souris de test et enregistrer la distance totale déplacée en centimètres, a été utilisépour effectuer cette étape. Toutes les vidéos marqués par le logiciel de suivi vidéo avaient une notecard de dimensions connues placés dans l'arène au début de la vidéo.
      1. Utiliser la carte pour notes pour calibrer chaque vidéo dans le logiciel en établissant une courbe d'étalonnage le long de chaque extrémité de la notecard et la saisie de la longueur appropriée à l'intérieur de l'écran d'étalonnage du logiciel. Une fois que les lignes sont tracées, entrée la longueur connue et la largeur de la notecard qui correspondent à chaque ligne.
      2. Dans Réglages Arena, sélectionnez toute l'arène.
         Note: Des zones séparées de l'arène peuvent être différenciés dans le logiciel si, par exemple, le mouvement de la souris le long des murs par rapport au centre était d'intérêt.
      3. Dans Paramètres de contrôle de première instance, sélectionnez une durée de dix minutes. Dans Paramètres de détection, choisissez un objet sombre sur un fond clair.
         Remarque: Ce devrait être changé si des souris albinos ont été utilisés ou si l'arrière-plan était une teinte plus foncée.
      4. Une fois que les paramètresont été programmés, marquer les vidéos. Cliquez sur Acquisition> Ouvrir Acquisition. Dans la zone de contrôle Acquisition, cliquez sur Nouveau, puis de première instance Démarrer l'essai. Au bout de dix minutes se sont écoulées, le programme arrête et les données peuvent être visualisées.
      5. Cliquez sur Analyser> Calculer les statistiques. Une fois que les données apparaissent sur l'écran, l'exportation ou copier et coller dans une feuille de calcul distincte.

4. Analyses statistiques, Sequencing

1. Dans la chaîne de numéros correspondant à des enquêtes générées par chaque souris objet, déterminer le nombre total de toutes les combinaisons possibles à 3 chiffres sans numéros de répétition (par exemple , 121, 123, 124 mais pas 112 ou 122).
   Note: Un programme écrit en langage de programmation Python a été utilisé pour déterminer le nombre de fois que chaque séquence possible apparaît dans la chaîne de nombres. Il ne faut pas utiliser un programme extérieur, et cette étape pourrait être complété de nombreuses façons différentes (par exemple en utilisantune fonction Rechercher dans Microsoft Word ou Excel).
2. Notez le nombre de fois que chaque séquence se produit et d'identifier les trois séquences plus souvent répétées pour chaque souris.
   Nota: Les séquences individuelles varient en fonction de la souris et la séquence réelle est d' un intérêt moindre que le nombre de fois qu'une séquence a été répétée ( par exemple l' adhérence à un motif est plus important que le motif lui - même).
3. Étant donné que le nombre total de séquences d'une répétition de la souris sera corrélée positivement au niveau d'activité, de corriger ces valeurs en divisant la quantité de motifs les plus fréquents par le nombre total de motifs pour chaque souris individuelle. Cela donnera un indice de répétition de séquence qui est indépendante de l'activité globale.
4. Comparez le nombre de fois chaque souris répète ses séquences les plus courantes (corrigé pour le niveau d'activité) entre les groupes en utilisant une ANOVA appropriée, la procédure de comparaison multiple (test de Dunnett, par exemple) et les tests post-hoc.

5. Analyses statistiques, Object Préférence

1. En utilisant la même chaîne de nombres générés ci-dessus (étape 3.1.3.1), identifier l'objet roman préférence de chaque souris en comptant le nombre total de fois chaque objet a été étudié, ou en d'autres termes, en comptant le nombre total de 1 sec, 2 sec , 3 sec, et 4 sec dans la chaîne de données. Correct pour le niveau d'activité et de comparer via ANOVA comme décrit ci-dessus (étapes 4,3-4,4).
   Remarque: Ces méthodes publiées par notre laboratoire ²² et décrits ici sont basés en grande partie sur Pearson et al ^17.

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Résultats

Les données représentatives ²² montrent que C58 femelle / souris J affichent un nombre plus élevé de motifs séquencés que les autres souches dans l'arène ronde (figure 2, partie A), mais pas dans l'arène rectangulaire (Figure 2, partie C). Aucun des trois souches mâles diffèrent les unes des autres (figure 2, panneaux B et D). Les données représentatives montrent que les souris mâles et femelles C58 / J af...

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Discussion

Ici, nous présentons un test récemment mis au point qui peut être utile pour quantifier les comportements de souris avec une validité pour ordre supérieur des comportements répétitifs chez les humains. Contrairement à des dosages plus établis comme le Barnes ou T-labyrinthe, ce nouveau test d'exploration de l'objet ne nécessite pas de formation de la souris ni particulièrement anxiogène. De plus, le roman d'exploration de l'objet ne nécessite pas de nourriture ou de stimuli sociaux, ce qui p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI