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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Résumé

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introduction

Une limitation du VIH-1, les traitements actuels est qu'ils doivent être administrés de façon chronique pour prévenir la progression de la maladie. Transplant du VIH-1 résistant à des lymphocytes T, ou cellules souches hématopoïétiques, a le potentiel de fournir le contrôle à long terme du VIH-1 replication en l'absence de traitement médicamenteux 1,2 et peut également être une approche efficace pour atteindre un VIH-1 cure 3. Une façon de rendre les cellules résistantes au VIH-1 réplication consiste à insérer un ou plusieurs gènes codant des anticorps anti-VIH-1 ARN ou des peptides dans les cellules d'un individu infecté au cours d' une transplantation autologue 4. Plusieurs candidats anti-VIH-1 des gènes ont été conçus avec des essais cliniques qui entrent en combinaison de deux 5 ou trois 6, pour prévenir le développement du VIH-1 résistance à un seul gène.

Anti-VIH-1 ARN sont parmi les meilleurs candidats pour la thérapie génique combinée en raison de leur faible potentiel pour obtenir des réponses immunitaires et parce qu'ilson transcrit à partir des séquences de gènes très courts. Quelques-anti-VIH-1 ARN ont été conçus pour cibler l'intégration et l'entrée virale. Cependant, la plupart des anti-VIH-1 ARN cible étapes de post-intégration dans le cycle de vie du virus (figure 1). Les inhibiteurs post-intégration comprennent des ARN leurre, ciblant les VIH-1 protéines régulatrices Tat ou Rev 1, et des ARN antisens à base, ciblant différents sites en ARN VIH-1, tels que ribozymes 7, shRNA 8 et U1i ARNs 9. Les méthodes qui ont été utilisées pour comparer l'efficacité des anti-VIH-1 ARN comprennent la surveillance de la réplication virale dans les cellules transduites avec les gènes codant pour des ARN candidates et en mesurant la production virale dans des cellules transfectées de manière transitoire avec des plasmides exprimant des ARN candidates et un rétrovirus VIH-1 du plasmide d' expression 10 -13. Nous avons déjà utilisé un test de production du VIH-1 à l' écran ARN VIH-1 pour les nouveaux ribozymes sites cibles 13-15. Ces méthodes ont été affinées pour optimiser la forme d'un ARNmolécule d'interférence exprimée à partir de l' ADN plasmidique comme un shRNA ou livré comme un siRNA synthétique 16. L'essai mesure la production de virus matures à partir de cellules de rein embryonnaire humain (HEK 293T), et peut être utilisé pour comparer les effets des inhibiteurs qui ciblent les étapes de post-intégration dans le cycle de réplication du VIH-1 (Figure 1). Pour les inhibiteurs qui ciblent les étapes de pré-intégration, les tests alternatifs comme une infectivité cellulaire dosage TZM-bl 17 sont nécessaires pour évaluer l' efficacité antivirale.

problèmes de sécurité majeurs pour la fourniture d'anti-VIH-1 ARN dans la clinique comprennent les effets hors-cible potentiels sur les ARN ou les protéines humaines, et l'activation des capteurs immunitaires innées. Afin d' évaluer la toxicité des anticorps anti-VIH-1 ARNsi, nous avons utilisé un test de viabilité cellulaire dans les différentes lignées cellulaires 16. Nous avons également mesuré l'activation des capteurs à double brin d'ARN immunitaire, l'ARN protéine kinase activée par R (PKR) et Toll like receptor 3 (TLR3), ainsi que l'expression de l'interféron stimulé gène, p150 ADAR1. Ces essais peuvent être utilisés pour confirmer l'efficacité des anticorps anti-VIH-1 ARN ne résulte pas d'effets indirects sur la viabilité cellulaire ou l'activation du capteur immunitaire. Ils sont également utiles en excluant les ARN candidats avec les toxicités potentielles de développement ultérieur.

Dans les protocoles suivants, les procédures pour identifier les nouveaux ARN thérapeutiques et d'optimiser le format de celles existantes sont décrites. Les méthodes sont utiles pour les inhibiteurs de post-intégration d'ARN de dépistage à base de VIH-1 réplication et pourraient être adaptés à l' écran d' autres inhibiteurs de post-intégration, tels que les petites molécules ciblant Rev exportation médiation de l' ARN viral 18 ou CRISPR / systèmes Cas conçus pour cibler intégrée ADN du VIH-1 19.

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Protocole

1. Cellules et transfections

  1. Cultiver des cellules HEK 293T dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Préparer une suspension de 2 x 10 5 cellules / ml dans le milieu de culture cellulaire. Ajouter 500, 100 et 1000 pi de la suspension cellulaire à chaque puits de 24 puits, des plaques à 96 puits et 12 puits, pour la production virale, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, respectivement (figure 2A).
  2. Agiter doucement les plaques et incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2. Cultiver les cellules à 50-70% de confluence.
  3. Selon un plan de transfection, préparer des dilutions d'ARN d'essai et de leurs contrôles dans 1,5 ml de micro tubes (exemple, la figure 2B).
    1. Pour le dosage de la production virale, préparer une 10 ng / ul de la dilution d'un VIH-1 du plasmide d'expression et ajouter 10 ul à chaque tube. préparer Suivant 5 uM dilutions d'ARN d'essai et un RN de contrôle négatifA. Ajouter 2,5 ou 10 ul de chaque ARN d'essai négatif et la dilution de commande pour les tubes correspondants 25 ou 100 concentrations finales nm.
    2. Pour le dosage de la viabilité des cellules, de préparer des dilutions de 5 um d'ARN d'essai et 10 mg / ml de dilution de l'ARN témoin positif, de faible poids moléculaire poly I: C. Ajouter 2 ul d'ARN d'essai ou des dilutions d'ARN de contrôle positif aux tubes correspondants pour 100 nM ou ml concentrations finales 200 ug / respectivement.
    3. Pour l'essai d'activation immunitaire, ajouter 20 pl d'ARN test ou des dilutions d'ARN témoin positif préparé à l'étape 1.3.2. aux tubes correspondants de 100 nm ou 200 ug / ml de concentration finale, respectivement.
      Remarque: Pour les tests ARN des plasmides d'expression, préparer des dilutions de 10 ng / ul à la place des 5 um dilutions d'ARN d'essai, ce qui donne des quantités finales de 25 et 100 ng pour l'étape 1.3.1. et 100 ng pour les étapes 1.3.2. et 1.3.3.
  4. Ajouter 50, 25 ou 75 ul de DMEM à chaque tube de transfection virale pour production, la viabilité cellulaire et des essais d'activation immunitaire, respectivement. Pour les essais de production virale, apportent des cellules et des tubes de transfection préparés à un niveau de biosécurité 3 (BSL3) laboratoire avant l'étape suivante.
  5. Ajouter 2 ul du réactif de transfection séquentielle aux tubes de transfection et incuber pendant 15 à 20 minutes pour permettre de former des complexes. Voir la table des matières pour le réactif de transfection spécifique à utiliser.
  6. Ajouter le mélange de transfection entier de chaque goutte à goutte dans les positions correspondantes dans les plaques de culture cellulaire microtube. Remuer doucement et incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  7. Mesurer le VIH-1 production (section 2), la viabilité des cellules (section 3) et l' activation immunitaire (section 4) dans les plaques de culture cellulaire (figure 2C).

2. Dosage de la production virale

  1. Retirez les plaques de culture cellulaire à 24 puits de l'incubateur et agiter doucement les plaques à l'intérieur de la culture cellulaire BSL3capuche. Transférer 150 pi de surnageant de chaque puits à un puits correspondant d'une plaque de 96 puits à fond plat, qui sera utilisé pour quantifier la production de VIH-1.
    Nota: Les dosages de quantification virales courantes incluent la mesure de l'expression de la protéine HIV-1 capside (p24) par l' enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 20, la quantification de l' ARN viral par réaction de transcription inverse en chaîne par polymérase (RT-PCR) , 21 et en mesurant l'activité du VIH-1 RT enzyme. Les étapes 02.02 à 02.05 expliquer les méthodes pour quantifier le VIH-1 l' activité de RT 13,15,16.
  2. Transfert 5 pi de surnageant à puits correspondant dans une plaque de 96 puits, contenant 25 ul d'une interruption virale cocktail 15 (tableau 1). Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante et à transférer la plaque à un poste de travail de la radioactivité.
    Remarque: l'étape 2.2. est nécessaire seulement si un poste de travail de la radioactivité ne sont pas disponibles dans le laboratoire BSL3. Si les plaques ne doivent pas être retirés de lalaboratoire BSL3, passez à l'étape 2.3. et ajouter 50 ul de radioactive / virale perturbation cocktail (tableau 1) à la place des 25 pl de cocktail radioactif.
  3. Préparer un cocktail radioactif 15 (tableau 1), et ajouter 25 ul à chaque puits de surnageant viral et la perturbation cocktail. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 heures.
  4. Point 5 ul du mélange réactionnel sur des carrés correspondants d'une fibre de verre Di éthyl amino éthyle (DEAE) de papier et Filtermat permettent aux taches sécher pendant 10 minutes. Repérez le mélange de réaction sur tous les autres carrés de sorte que deux échantillons Boarder directement les uns les autres. Cela permet d'éviter cross-over entre les échantillons lors de la détermination coups par minute (cpm) dans l'étape 2.6.
  5. Laver les papiers 5x pendant 5 min avec 2x citrate de sodium salin (SSC) tampon (tableau 1), suivi de deux lavages 1 min avec 95% d' éthanol. Laisser les papiers à sécher et les sceller dans des sacs d'échantillons.
  6. Clip sacs d'échantillons containing le papier Filtermat dans une cassette et insérez la cassette dans un compteur à scintillation de microplaques. Régler le compteur pour lire cpm 32 P à la date de référence prévue pour le lot de [32 P] dTTP utilisé dans l'expérience. Sélectionnez les échantillons à lire en utilisant la carte de la plaque et démarrer le compteur.
  7. Pour toute méthode de quantification virale, diviser les valeurs obtenues pour chaque ARN de test par le contrôle négatif adjacent et multiplier cette valeur par 100 pour obtenir le pour cent d'inhibition du VIH-1 production pour chaque répétition des ARNs de test. Un exemple des résultats de comparaison différents ARN d'essai à différentes concentrations est présentée à la figure 3.

Viabilité 3. Cellule Assay

  1. Retirer les plaques à 96 puits de l'incubateur et on ajoute 20 ul de 5 mg / ml de MTT (bromure de 3- [4,5-diméthyl-2-thiazolyl] -2,5-diphényl-2H-tétrazolium) dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco ( DPBS) à chaque puits. Incuber les plaques fou 3 heures à 37 ° C.
  2. Ajouter 150 ul d'isopropanol acidifié avec un détergent (1% de NP-40, du HCl 4 mM dans de l'isopropanol) à chaque puits et incuber les plaques pendant 2 heures à température ambiante.
  3. Déterminer l'absorbance à 570 nm dans un spectrophotomètre de microplaque.
  4. Calculer le métabolisme du MTT relatif pour chaque ARN témoin positif et un test en divisant la valeur obtenue pour chaque échantillon par le contrôle de transfection adjacente. Un exemple des résultats de comparaison différents ARN d'essai et un groupe témoin positif est fourni à la figure 4.

4. Essai d'activation immunitaire

  1. Retirer les plaques à 12 puits de l'incubateur et aspirer le milieu de culture. Lavez délicatement les cellules deux fois avec DPBS et ajouter 70 ul de tampon de lyse froid 22 (y compris les inhibiteurs de la protéase et la phosphatase, tableau 1) à chaque puits. Incuber les plaques pendant 10 minutes sur la glace.
  2. Transfert lysats de cellules dans des tubes micro et les congeler rapidement par immersion de lales tubes dans de l'azote liquide. Laisser les échantillons décongeler et répéter pendant 2 cycles de gel-dégel pour un total de 3.
  3. Centrifuger les lysats pendant 15 min à 4 ° C, 15 700 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes micro et déterminer la concentration en protéines en utilisant la méthode 23,24 bleu de Coomassie (Bradford).
  4. Résoudre 75 pg de protéine provenant de chaque échantillon dans un gel à 10% de Polyacrylamide dénaturant et les transférer à une membrane de nitrocellulose comme décrit précédemment 25,26.
  5. Après électrophorèse et transfert sur ​​membrane, révèlent des bandes de protéine par incubation de la membrane dans Ponceau S (tableau 1) pendant 1 min , suivie d' un lavage à l' eau bidistillée. Utilisez les bandes et de protéines échelle comme un guide pour couper la membrane à 80 et 55 kDa.
    Remarque: Dans l' étape 4.4 échantillons peuvent être exécutés sur 16 x 18 cm 2 gels vers le bas à 34 kDa, de sorte qu'il est facile de couper la membrane aux positions spécifiées et ne pas couper à travers lagroupes d'intérêt. Sinon, plusieurs gels peuvent être exécutés avec les mêmes échantillons pour éviter de couper la membrane.
  6. Laver la coloration Ponceau S avec du tampon Tris salin contenant 0,05% de Tween 20 (TBST, tableau 1). Ajouter TBST avec 5% de lait non gras pour couvrir complètement les membranes. Incuber les membranes à la température ambiante sous agitation pendant 1 heure.
  7. Incuber les membranes O / N dans du TBST avec 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et d'anticorps dilué à 1 en 1000 contre ADAR1 (110 et 150 kDa), phospho-PKR (62 kDa) et phospho-IRF3 (47 kDa), les pièces du haut, du milieu et du bas de la membrane, respectivement.
  8. Laver les membranes 5x pendant 5 minutes avec du TBST et incuber dans du TBST avec 5% de lait non gras et des anticorps secondaires marqués à la peroxydase de chèvre anti-lapin (dilué à 1 à 5000) pendant 1 h.
  9. Laver les membranes 5x pendant 5 min avec TBST et appliquer électrochimiluminescence (ECL) solution pour visualiser les bandes sur les films selon les instructions du fabricant.
  10. Après la visualisation des bandes de protéines sur des films, laver les pièces médianes et inférieures de la membrane pendant 10 minutes avec une solution d'anticorps de décapage. Incuber les membranes O / N dans du TBST avec 3% de BSA et d'anticorps contre PKR totale (à 1 à 500) et IRF3 (à 1 à 1000), pour le milieu et d'une partie inférieure, respectivement. Répétez les étapes 4.8. et 4.9. en utilisant marqué à la peroxydase de chèvre anti-souris à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin pour la membrane PKR (milieu).
  11. Laver la partie inférieure de la membrane 5x pendant 5 minutes avec du TBST et on incube la membrane dans du TBST avec 3% de BSA pendant 1 heure avec un anticorps dirigé contre l'actine (dilué à 1 en 5000). Répétez les étapes 4.8. et 4.9. en utilisant marqué à la peroxydase de chèvre anti-souris à la place de l'anticorps secondaire anti-lapin. Un exemple des résultats comparant différents ARNs de test et un contrôle positif est fourni à la figure 5. Voir la table des matières pour les anticorps spécifiques à utiliser.

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Résultats

Un schéma général de la procédure est représenté sur la figure 2 avec un plan de transfection par exemple pour les trois ARN d'essai et un ARN de commande prévue dans la figure 2B. Pour la production et la viabilité cellulaire des analyses virales, la lecture-out pour chaque construction d'essai est normalisée à un contrôle négatif. Réplicats sont transfectées dans des ensembles, de sorte que chaque ARN de test est normalisé à son...

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Discussion

HIV-1 essai de production décrite a été réalisée en utilisant des cellules HEK293T (figure 2) et est similaire à essais utilisés pour cribler ARN VIH-1 pour un ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, 30 ARNsi et les sites 11,31 U1i ARN cibles. L'utilisation de différentes méthodes pour quantifier le VIH-1 la production, la plupart des études ont mesuré la production virale 48 heures après co-transfection d'un plasmide d'expression de VIH-1 a...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

Le travail présenté ici a été soutenue par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (accorde DCB-120266, PPP-133377 et HBF-348967 à AG).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

Références

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