Un capteur à base de polyaniline d'acides nucléiques

Résumé

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Résumé

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introduction

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocole

1. traitables PANI Synthèse

1. Dissoudre l'aniline (1 ml, 11 mmol) complètement dans 60 ml de chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Agiter à 600 rpm pendant 5 min et laisser refroidir à 0-5 ° C avec de la glace. Cela prend habituellement 15 à 20 minutes (figure 2A).
2. Ajouter dodécylbenzène sulfonate de sodium (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) à la solution d'aniline dans un ballon à fond rond, sous agitation à 600 tours par minute.
3. Dissoudre le persulfate d'ammonium (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) dans 20 ml d'eau et ajouter tout cela goutte à goutte sur 30 min pour éviter la surchauffe de la réaction.
4. Effectuer la réaction à 0-5 ° C pendant 24 heures, et lui permettre d'atteindre la température ambiante pendant 24 h.
5. Observer le mélange réactionnel d' abord tourner blanc laiteux après 15 min, puis brun foncé au bout de 2 h, et enfin au vert foncé après 24 h (figure 2B-F).
6. Filtrer la solution PANI-NaDBS avec un entonnoir de Büchner. Mélanger avec 80 ml de chloroforme et 120 ml d'eau en tanta séparation entonnoir (figure 2G).
7. Incuber la solution pendant 24 heures à la température ambiante et recueillir le PANI vert foncé de l'entonnoir de séparation, ne laissant pas réagi NaDBS et APS dans le surnageant aqueux.

2. PANI-sonde de mélange et Irradiation UV

1. Diluer solution PANI 10x avec du chloroforme-eau (1: 3 v / v) et mélanger 200 pi de PANI dilué avec 6,4 pmol d'oligonucléotides d'ADN de la sonde par doux balancement pendant 15 min dans un tube de microcentrifugation.
2. Irradier la solution de PANI-ADN avec 1 200 pJ / cm ² d'un agent de réticulation UV pendant 2 min. Il est essentiel que l'exposition aux UV est limitée au montant indiqué. Une exposition prolongée aux UV compromet le changement de fluorescence dans PANI, probablement due à une reticulation covalente de PANI et l'ADN.
3. complexes à pellets par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 minutes et laver avec du tampon phosphate salin (PBS). Pellet à nouveau, et remettre en suspension dans du PBS.

3. Hybridization de PANI-sonde

1. Ajouter 8 ul de 100 uM d'oligonucléotides d'ADN complémentaire ou cibler des acides nucléiques à 200 ul de complexes PANI-sonde.
2. Effectuer l'hybridation en basculant mélange de solution pendant 15 min à 40 ° C.
3. Pellet les complexes de PANI par centrifugation à 17.000 xg pendant 6 min. Laver avec du PBS et re-suspension dans l'eau.

4. Emission Steady Mesure État Fluorescence

1. Ajouter PANI de différents traitements dans une microplaque à 96 puits et mesurer la fluorescence d'émission dans la gamme 270-850 nm par excitation à 250 nm. Un pic d'émission pour PANI devrait être observée autour de 500 nm.

5. Fluorescence Microscopy Mesure de hybridée Duplex

1. Baisse manteau PANI sur une lamelle de verre borosilicate et sec à 40 ° C pendant 48 heures.
2. Ajouter la sonde (8 pi de 100 uM) sur un film PANI séché et irradier avec une lumière UV (1200 pJ / cm ² ) pendant 2 min.
3. Lavez le film PANI-sonde avec du PBS et sèche à 40 ° C pendant 48 heures.
4. Effectuer l'hybridation pour 15 minutes en ajoutant des acides nucléiques cibles. Cela pourrait être un échantillon biologique ou d'un oligonucléotide cible de commande (8 ul de 100 uM). Suivi avec un lavage PBS.
5. Obtenir les images fluorescentes à 40X, avec un filtre à long passe de 500 nm.

Résultats

Figure 2A capture la configuration de réaction au début du processus de polymérisation, à savoir, avant l' addition APS. La formation de micelles est l'étape initiale dans la réaction de synthèse processus PANI se produit à l'interface micellaire. La figure 2B montre une solution laiteuse après 5 min. 30 minutes après l' APS est ajouté la réaction se transforme en une couleur légèrement brune. Figure 2C

Discussion

Un capteur à base PANI-des acides nucléiques nécessite la solubilisation du polymère dans l'eau afin d'interagir avec l'ADN et l'ARN. La dispersion de PANI dans l' eau est effectuée en utilisant des agents tensioactifs, formant des micelles comme indiqué précédemment ^8. Outre les NaDBS utilisées ici d' autres tensio - actifs anioniques tels que l' ester dodécylique d'acide 4-sulfophtalique, les tensioactifs non ioniques tels que l' éthoxylate de nonylphénol, ou ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536