À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Carolina Rodriguez-Tirado; Takanori Kitamura; Yu Kato; Jeffery W. Pollard; John S. Condeelis; David Entenberg

doi:10.3791/54603

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Résumé
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Résumé

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Résumé

Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l' os est un événement traumatique avec un taux d'environ ¹ à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l'imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d'ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d'un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l'arrivée d'une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d'imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule ² sont nécessaires pour définir les phénotypes de l'ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l' imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l'environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire ^3. Des travaux récents ont montré que l' imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d'imagerie ^2,4,5 cependant, les temps typiques d'imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d'images obtenues à l'aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d'image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.

Introduction

L'imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l' imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales ^6-11 qui ne sont présents que chez l'animal intact.

Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution ce....