Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

Résumé

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Résumé

Scramblases phospholipides translocation à travers la membrane bicouche bidirectionnellement de façon ATP-indépendant. La première scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée a été Opsin le apoprotéine du rhodopsine photorécepteur. Rhodopsine est un récepteur couplé aux protéines G localisée dans les membranes de disque tige photoréceptrices de la rétine, où il est responsable de la perception de la lumière. L'activité de scramblase de rhodopsine ne dépend pas de son ligand 11- cis -retinal, à savoir, l'opsine apoprotéine est également actif en tant que scramblase. Bien phospholipides constitutive et régulée de brouillage jouent un rôle important dans la physiologie cellulaire, seulement quelques scramblases phospholipides ont été identifiés à ce jour plus de opsin. Nous décrivons ici un dosage basé sur la fluorescence de l'activité de scramblase opsine. Opsine est reconstitué dans de grands liposomes unilamellaires composés de phosphatidylcholine, phosphatidylglycérol et une quantité trace de fluorescence NBD-PC marqué (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycéro-3-phosphocholine). scramblase activité est déterminée en mesurant la mesure dans laquelle les molécules NBD-PC situé dans le feuillet interne de la vésicule sont en mesure d'accéder au feuillet externe où leur fluorescence est éliminé par voie chimique d'un agent réducteur qui ne peut pas traverser la membrane. Les procédés décrits ici ont une applicabilité générale et peuvent être utilisées pour identifier et caractériser les activités de scramblase d'autres protéines membranaires.

Introduction

La rhodopsine photorécepteur, un récepteur de protéine G couplée à prototypique ( passage en revue par exemple dans la référence ^1), est le premier phospholipide scramblase à identifier et biochimiquement vérifiée ^2,3. Scramblases phospholipides sont des transporteurs qui augmentent le taux intrinsèquement lent du mouvement transbilayer phospholipide physiologiquement niveaux appropriés dans une bi - directionnelle, de façon ATP-indépendant ^6/4. Des exemples de leurs actions peuvent être trouvées dans le réticulum endoplasmique et de la membrane cytoplasmique bactérienne , où le brouillage constitutif est nécessaire pour l' homéostase de la membrane et la croissance, ainsi que pour une variété de voies de glycosylation ^5. Phospholipide régulé embrouillage est nécessaire d'exposer la phosphatidylsérine (PS) à la surface des cellules apoptotiques où il agit comme un «eat-moi» -signal pour les macrophages ⁷ et fournit une surface procoagulante sur les plaquettes sanguines activées pour catalyser la production de facteur protéiques nécessaire pour la coagulation sanguine. Dans les membranes du disque photoréceptrices, l'activité de brouillage de la rhodopsine a été suggéré pour contrebalancer le déséquilibre phospholipide entre les deux feuillets de la membrane bi - couche qui est générée par l'ATP-dépendante, un lipide unidirectionnel flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

En dépit de l'importance physiologique de scramblases, leur identité est restée difficile à atteindre jusqu'à ce que la rhodopsine a été rapportée en tant que scramblase dans les disques photorécepteurs ^2, des membres de la famille des protéines TMEM16 ont été identifiés comme ^{Ca2 +} scramblases -dépendantes nécessaires pour une exposition de PS à la membrane plasmique (passé en revue dans la référence ^13), et la protéine bactérienne FTSW a été proposée comme un lipide II scramblase nécessaire pour la synthèse du peptidoglycane ^14. Ces découvertes ont été basés sur la reconstitution de protéines purifiées dans des liposomes et la démonstration de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant la méthodologie described ici. Autres scramblases potentiels ^15-21 - les protéines MurJ et AMJ impliqués dans la biosynthèse de peptidoglycane, WzxE et protéines apparentées impliquées dans le brouillage des précurseurs de O-antigène, la protéine MPRF nécessaire pour la translocation phosphatidylglycérol aminoacyle à travers la membrane cytoplasmique bactérienne, et les membres de la famille Xkr8 qui ont été proposées exposer PS à la surface des cellules apoptotiques - restent à tester biochimiquement. Cela souligne l'importance d'un test robuste pour identifier et caractériser l'activité scramblase.

Ici, nous décrivons la reconstitution de l'opsine purifiée, l'apoprotéine de la rhodopsine photorécepteur, en grandes vésicules unilamellaires (LUV), et l'analyse ultérieure de l'activité de scramblase dans les protéoliposomes résultant en utilisant un dosage basé sur la fluorescence. Il existe plusieurs protocoles bien décrits dans la littérature pour l'expression hétérologue et la purification de l'opsine, donc nous ne serons pasdécrire dans ce protocole; on utilise les protocoles décrits dans Goren et al. , ce qui donne ³ étiquetée FLAG, opsine thermostable à environ 100 ng / ul de 0,1% (p / v) , dodécylmaltoside (DDM).

La reconstitution est obtenue par traitement avec un détergent LUV suffisante pour qu'ils gonflent mais ne se dissolvent pas. Dans ces conditions, une protéine membranaire - fourni sous forme de micelles protéine-détergent - intégrera dans les liposomes et devient reconstituée dans la membrane des liposomes lors de l'élimination de détergent, ce qui entraîne des protéoliposomes. Pour reconstituer opsine (obtenu sous la forme d' une protéine purifiée dans 0,1% (p / v) DDM), LUV sont préparés à partir d' un mélange de POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine) et le POPG (1- palmitoyl-2-oléoyl sn - glycéro-3- [phospho-rac- (1-glycérol)]) et saturé avec DDM avant d' ajouter opsin et NBD-PC. Le détergent est ensuite éliminé par traitement de l'échantillon avec des billes de polystyrène.

lass = "jove_content"> Le principe de l'essai à base de fluorescence est représentée sur la figure 1B. LUV sont symétriquement reconstitués avec une trace de NBD-PC ou un autre journaliste de phospholipides fluorescent NBD marqué (figure 1A). Par addition de dithionite, un non-fluorescente à la membrane impermeant dianion, les molécules NBD-PC dans le feuillet externe des GVU sont rendus en tant que groupe nitro du NBD est réduite à un groupe amino non fluorescent. Étant donné que ni les molécules NBD-PC ni dithionite sont capables de traverser la membrane sur l'échelle de temps de l'expérience (<10 min), il en résulte 50 une réduction du signal fluorescent%. Cependant, si les liposomes sont reconstituées avec une scramblase, les molécules NBD-PC dans le feuillet interne peut mélanger rapidement vers l'extérieur où ils sont réduits. Cela se traduit par la perte totale de la fluorescence dans le cas idéal (figure 1C).

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. Figure 1: Représentation schématique de l'essai d'activité scramblase L'essai utilise un marqueur fluorescent rapporteur lipide NBD-marqué; NBD-PC est disponible (A). De grosses vésicules unilamellaires sont reconstituées avec une quantité trace de NBD-PC. Reconstitution produit des vésicules symétriques, avec NBD-PC répartis également dans les dépliants extérieurs et intérieurs. Dithionite (S ₂ O ₄ ^2-) réduit chimiquement le groupe nitro du NBD à un groupe amino non fluorescent. Traitement des liposomes sans protéines avec du dithionite (B, en haut) provoque une réduction de la fluorescence de 50% depuis que les molécules NBD-PC dans le feuillet externe sont réduits: dithionite est chargé négativement et ne peut pas traverser la membrane pour réagir avec des molécules NBD-PC dans le feuillet interne. Traitement dithionite de protéoliposomes contenant opsin-(B, bas), à savoir, protéoliposomes de scramblase-actif, entraîne la perte de f 100%luorescence comme opsin facilite le mouvement de NBD-PC entre l'intérieur et l'feuillet externe. (C) montre des traces de fluorescence idéalisées obtenus sur le traitement des liposomes dépourvus de protéine et protéoliposomes contenant opsin-dithionite. Le taux de perte de fluorescence est le même dans les deux cas, ce qui indique que la réduction chimique du NBD par le dithionite est le taux limitatif, et que le brouillage se produit à une vitesse égale ou supérieure à la vitesse de la réaction chimique. Des traces obtenues à partir d' une expérience réelle sont présentés dans la figure 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les procédés que nous décrivons peuvent être utilisées pour reconstituer et doser d' autres protéines purifiées, ainsi que des mélanges de protéines membranaires obtenues, par exemple, par extraction avec un détergent ²² microsomes.

Protocole

1. Préparation de liposomes et protéoliposomes

1. liposome Formation
   1. En utilisant une seringue en verre, ajouter 1,435 ul POPC (25 mg / ml dans du chloroforme) et 160 ul POPG (25 mg / ml dans du chloroforme) dans un ballon à fond rond pour obtenir 52,5 pmol de lipides dans un rapport molaire de POPC: POPG = 9: 1.
   2. Sécher les lipides pendant 30 minutes en utilisant un évaporateur rotatif à une vitesse de rotation de 145 tours par minute (pas de bain d'eau est nécessaire pour ce volume de solvant), puis transférer le ballon dans un dessicateur sous vide pendant au moins 3 heures, ou pendant une nuit, à la température ambiante (RT).
   3. Hydrater le film lipidique séché avec 10 ml d'HEPES 50 mM pH 7,4, 100 mM de NaCl (ci-après dénommé tampon A), en remuant doucement le ballon jusqu'à ce qu'une homogénéité, les résultats de suspension turbide;
      NOTE: La concentration des lipides à ce stade devrait être 5,25 mM comme aucune perte auraient eu lieu jusqu'à présent.
   4. Sonication de la suspension dans un bain d'eau pendant 10 min à température ambiante avec une fréquence of 40 kHz. La solution se penchera un peu plus claire.
   5. À l'aide d'une extrudeuse, faire passer la suspension 10 fois à travers une membrane ayant une taille de pores de 400 nm, suivi d'un deuxième cycle d'extrusion avec 4 passages à travers une membrane ayant une taille de pores de 200 nm.
      REMARQUE: Le diamètre moyen des LUV résultant est d'environ 175 nm. Si nécessaire, la taille et l'homogénéité des GVU peuvent être contrôlées par diffusion dynamique de lumière en suivant les instructions du fabricant.
   6. Quantifier la concentration en phospholipides de la suspension de LUV comme décrit dans la section 1.2).
      NOTE: En raison des pertes au cours de l'extrusion, la concentration est généralement autour de 3,6 mM.
   7. Stocker les LUV à 4 ° C pendant environ 2 semaines si non utilisé immédiatement.
2. Quantification phospholipides
   Remarque: pour déterminer la concentration en phospholipides de la suspension LUV utilisée pour la reconstitution, ainsi que celle des protéoliposomes qui sont éventuellement produites, une aliquote de l'échantillon est SUBJECTED à l'oxydation par l'acide perchlorique. Cette procédure se décompose phospholipides pour libérer le phosphate inorganique qui est ensuite quantifié par un essai colorimétrique en comparaison avec les normes ^23.
   1. Préparer une solution à 40 mM stock de phosphate de sodium (Na ₂ HPO ₄₎ dans de l' eau distillée désionisée.
   2. Diluer la solution mère avec de l'eau distillée désionisée pour obtenir 4 mM et 0,4 mM des solutions qui serviront de normes d'étalonnage de travail.
   3. En utilisant les solutions de travail, préparer des étalons dans des tubes de 13 x 100 mm ² en verre allant de 0 à 80 nmol de phosphate de sodium dans un volume final de 50 ul.
   4. Prendre 10 pl chacun des échantillons LUV et protéoliposomes à quantifier et diluer avec 40 pl de ddH ₂ O dans 13 tubes x 100 mm ² de verre.
      NOTE: Comme la concentration en lipides des LUV et protéoliposomes est dans la gamme 2,5-5 uM, les 10 ul de l'échantillon doit contenir 25-50 nmol lipide phosphore.
   5. Ajouter de l'acide 300 ul perchlorique à chacune des normes et des échantillons et de la chaleur pendant 1 heure à 145 ° C dans un bloc de chauffage. Mettez billes sur les tubes pour éviter l'évaporation.
   6. Laissez les tubes refroidir à la température ambiante et ajouter 1 ml de ddH ₂ O.
   7. Ajouter 400 pi chacun fraîchement préparé 12 g / L molybdate d'ammonium et 50 g / L ascorbate de sodium et vortex pour mélanger.
   8. Chauffer pendant 10 min à 100 ° C avec des billes sur le dessus des tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage et laisser refroidir à température ambiante.
   9. Mesurer l'absorbance des échantillons par rapport à l'ébauche (échantillon standard contenant du phosphate de sodium 0 nmol) avec un spectromètre à une longueur d'onde de 797 nm.
   10. Déterminer la teneur en phosphate d'échantillons sur la courbe étalon.
3. Reconstitution de Opsin
   NOTE: Il est nécessaire de déterminer les conditions optimales de gonflement pour la reconstitution que ceux-ci dépendent de la nature du détergent, ainsique la composition lipidique et la concentration des LUV. Comme LUV changent leurs propriétés de diffusion de la lumière sur le processus de gonflement peut être contrôlée en mesurant l' absorbance (Figure 2) tel que révisé par Rigaud et Levy ²⁴ et Geertsma et al. ^25.
   1. Pipette 800 pi de LUV (de la section 1.1, que la récupération des lipides après extrusion est de 70%, la concentration attendue de LUV est mM de phospholipides 3.6) dans un tube de 2 ml de microcentrifugation.
   2. Ajouter 5,3 ul de tampon A et de 34,7 ul de 10% (p / v) dissous dans du DCM tampon A.
   3. Incuber pendant 3 heures à la température ambiante avec un mélange de bout sur bout.
   4. Pendant ce temps préparer les perles de polystyrène:
      1. Utilisez 400 mg de perles par échantillon et peser dans un récipient en verre.
      2. Lavez-les deux fois avec du méthanol, trois fois avec de l'eau et une fois avec le tampon A. Pour chaque utilisation de l'étape de lavage 5 ml de liquide et remuer lentement pendant 10 min.
         NOTE: Il est recommandé de préparer le polystyrèneperles pour plusieurs échantillons à la fois, par exemple, peser 6 g de perles et on lave avec 75 ml de liquide. des perles en excès peuvent être stockés dans un réfrigérateur pendant plusieurs jours.
   5. Pendant les 30 dernières minutes de la vésicule déstabilisation sécher le phospholipide NBD marqué dans un tube à bouchon vissé en verre ( «reconstitution tube de verre»): Par exemple, 9,5 pi de NBD-PC (1 mg / ml dans le chloroforme, ce qui donne 0,4 mol% des phospholipides totaux) sont séchés sous un courant d'azote dans un tube en verre et ensuite dissous dans 45 ul de 0,1% (p / v) de DCM dans le tampon A.
   6. Au bout de 3 h de déstabilisation vésiculaire ajouter le phospholipide dissous NBD marqué, la protéine DDM-solubilisé et le tampon A de telle sorte que le volume final de 1 ml contient 0,36% (p / v), soit 7 mM, du DCM.
      1. Ainsi, pour produire des liposomes exempts de protéines (utilisé comme échantillon témoin) ajouter 45 pi de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 60 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A; pour protéoliposomes ajouter, pour examenple, 40 pl de protéine (à partir d'une solution mère typique de ~ 110 ng / pl) à 0,1% DCM, 45 ul de NBD-PC (dissous dans 0,1% de DCM), 20 ul de 0,1% de DCM et 55 pi de tampon A .
         NOTE: L'ordre d'addition doit être comme indiqué.
   7. Mélanger l'échantillon à une extrémité d'une heure supplémentaire par rapport à la fin à la température ambiante.
   8. Ajouter 80 mg de billes de polystyrène préparées et incuber l'échantillon avec de bout en bout sur le mélange pendant 1 heure à température ambiante.
   9. Ajouter ensuite 160 mg d'un supplément de perles de polystyrène et on incube avec l'extrémité sur l'autre extrémité le mélange pendant encore 2 heures à température ambiante.
   10. Transférer l'échantillon (en laissant les billes de polystyrène passées derrière) à un tube de verre à bouchon à vis contenant 160 mg de perles de polystyrène frais et mélanger pendant une nuit à 4 ° C.
       NOTE: Le moyen le plus simple pour transférer l'échantillon et éviter d'aspirer des billes est d'utiliser une pipette Pasteur qui est poussé vers le bas du tube de verre, avec une petite pression positive. Une fois que la pointe de la pipette est fermement aufond du tube, l'échantillon peut être retiré facilement sans interférence des perles.
   11. Le lendemain matin, transférer l'échantillon à un tube de micro sans porter sur des billes et placer sur la glace en préparation pour le dosage de l'activité scramblase.

2. scramblase Essai d'activité

NOTE: L'intensité de fluorescence des liposomes ou des protéoliposomes dilués avec le tampon A est surveillé au fil du temps après l'addition de dithionite dans un spectromètre à fluorescence. Pour obtenir une intensité stable de départ, la fluorescence est enregistrée pendant au moins 50 secondes (ou jusqu'à ce qu'un signal stable est atteint) avant d'ajouter dithionite à un échantillon constamment agité et est ensuite suivie pendant au moins 500 secondes après l'ajout de dithionite.

1. Ajouter 1,950 ul de tampon A à une cuvette en plastique contenant une barre d'agitation Mini.
2. Ajouter 50 ul du proteo préparé (liposomes) et de laisser l'échantillon équilibrer dans le spectro de fluorescencemètre sous agitation constante pendant plusieurs secondes.
3. Pendant ce temps , préparer une solution de 1 M dithionite dans 0,5 M tamponnée Tris (par exemple, pour deux échantillons peser 20 mg de dithionite dans un tube de microcentrifugation et se dissolvent dans 114 ul glacée 0,5 M Tris directement avant l' utilisation et garder sur la glace pour la prochaine échantillon).
   NOTE: La solution dithionite doit être fraîchement préparée et ne doit pas être utilisé plus de 20 minutes après la préparation; si plusieurs mesures sont à effectuer, des aliquotes de dithionite peuvent être pesés à l'avance et dissous juste avant utilisation.
4. Démarrer le suivi de fluorescence (excitation 470 nm, émission 530 nm, largeur de fente de 0,5 nm).
5. Ajouter 40 ul de la solution de dithionite de 1 M à la cuvette 50 secondes après le début de l'enregistrement de la fluorescence (en utilisant la cloison dans le couvercle de la chambre de la cuvette, si possible), et continuer à enregistrer la fluorescence pendant encore 400-600 sec.
6. Analyser les données comme décrit dans la section 3.

3.L'analyse des données

1. Cinétique de Scrambling
   1. Caractériser la trace de fluorescence de chaque échantillon obtenu par le dosage de l' activité scramblase en définissant la fluorescence initiale, F _i, avant l'addition de dithionite et la fluorescence du point final F, atteint au bout de > 400 s. F _i est déterminé pour chaque échantillon que la valeur moyenne de la fluorescence pour la période de 30 secondes avant l'addition de dithionite.
   2. Déterminer les données de point final correspondant à l'ampleur de la réduction de la fluorescence, R = 100 • F / F _i. Nous utilisons les termes R _L pour les liposomes sans protéines et R _P pour protéoliposomes contenant opsin.
2. La détermination du poids moléculaire du Fonctionnellement Reconstituée scramblase
   1. Convertir les données de réduction de la fluorescence en fonction de l'équation suivante:
      p (≥1 scramblase) = (R _p - R _L) / (R _max - R _L) (équation 1)
      REMARQUE: Où R _max est la réduction maximale qui est obtenue lorsque suffisamment de protéine est reconstituée telle que toutes les vésicules dans l'échantillon possèdent au moins une scramblase fonctionnelle, et p est la probabilité qu'une vésicule particulière dans un échantillon reconstitué est «scramblase actif», à savoir, elle possède au moins une scramblase fonctionnelle. La valeur de R _L est typiquement de ³ à 45% tandis que R _max est typiquement 82,5% ^3, au lieu de 100% attendus (R peuvent être déterminées expérimentalement pour protéoliposomes opsin avec un PPR> 1 mg / mmol _max). En tant que R _max <100% , il est supposé qu'une sous-population de vésicules est réfractaire à la reconstitution. Pour R _max = 82,5%, la fraction de vésicules qui est incapable d'accepter la protéine est de 0,35.
   2. Décrire la relation entre p (≥1 scramblase) et PPR (mg de protéine / mmol phospholipides) par les statistiques de Poisson comme suit:
      p (≥1 scramblase) = 1 - e ^{-m = 1 - exp (-PPR / α) (Equation 2)
      NOTE: Où m = nombre de scramblases par vésiculaire et α = mono-exponentielle constante ajustement en unités de mg de protéine / mmol de phospholipides.}
   3. En une fraction des vésicules ne contribue pas à brouiller même à haute PPR (voir la discussion), de modifier l'équation:
      p (≥1 scramblase) = 1 - exp (-PPR * / α) (Equation 3)
      NOTE: Lorsque PPR * = PPR / (1- f), où f est la population réfractaire de vésicules ou, dans ce cas, PPR * = PPR / 0,65 (équation 4).
      REMARQUE: La constante α ajustement est déterminée en ajustant une courbe de p (≥1 scramblase) par rapport à la PPR * avec une fonction mono-exponentielle. Si opsin (poids moléculaire de 41,7 kDa) recompose fonctionnellement dans des vésicules de 175 nm de diamètre (chaque vésicule a 280.000 phospholipides ²⁶⁾ en tant que monomère, alpha = 0,187 mg mmol ^-1. Si opsin dimérise avant la reconstitution ³ pour produire des vésicules scramblase-actif, α= 0,37 mg mmol ^-1. Si PPR plutôt que PPR * devaient être utilisés pour l'analyse, les valeurs alpha correspondantes seraient 0,122 et 0,244 mg mmol ^-1. Ces valeurs prédites pour α supposent que toutes les molécules opsin sont fonctionnellement compétent. Si seulement une fraction des molécules est compétente pour brouiller les lipides, les valeurs correspondantes de α sera plus grande.

Résultats

Nous décrivons la reconstitution de opsin en LUV pour caractériser son activité scramblase en utilisant un test basé sur la fluorescence. Nous analysons les résultats pour placer une limite inférieure du taux de phospholipides opsin médiation de brouillage et de déterminer l'état oligomérique dans lequel opsin reconstitue fonctionnellement dans les vésicules.

Pour déterminer les conditions optimales de reconsti...

Discussion

Le dosage de l' activité de l' origine scramblase nous a permis de déterminer que l' opsine a phospholipide scramblase activité ^2. L'essai a également permis de caractériser l'activité scramblase de l' opsine en testant la spécificité (nous avons utilisé une variété de lipides rapporteurs NBD marqués tels que le NBD-phosphatidyléthanolamine marquée avec NBD sur une chaîne acyle comme représenté par NBD-PC sur la figure 1A ou sur la groupe de tête, NBD...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS