Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

Résumé

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Résumé

Le développement récent de cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) a prouvé que les cellules somatiques matures peuvent revenir à un état pluripotent indifférenciée. Maintenant, la reprogrammation est effectuée avec divers types de cellules somatiques adultes: kératinocytes, cellules de l' urine, des fibroblastes, etc. Les premières expériences ont été généralement fait avec des fibroblastes dermiques. Cependant, cela nécessitait une intervention chirurgicale invasive pour obtenir les fibroblastes des patients. Par conséquent, les cellules de la suspension, telles que des cellules de sang et d'urine ont été considérées comme idéales pour la reprogrammation en raison de la facilité d'obtention des cellules primaires. Ici, nous rapportons un protocole efficace pour la génération COPSi à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). En étalant les CMSP transduites en série à une nouvelle plaque à l'aide de la matrice centrifugation revêtu, ce protocole peut facilement fournir des colonies iPSC. Cette méthode est également applicable à des cellules mononucléées du sang du cordon ombilical (CBMCs). Cette étude présente une prot simple et efficaceocol pour la reprogrammation de CMSP et CBMCs.

Introduction

Les cellules souches ont été l' un des matériaux les plus attrayants de la thérapie clinique depuis plusieurs décennies ^1. Les propriétés intéressantes de cellules souches sont pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement. En 1981, les premières cellules souches embryonnaires (CSE) ont été isolées à partir de l'embryon de souris ^2. Cependant, quand la technique a été appliquée à des embryons humains, il fait face à plusieurs questions éthiques.

En 2006, lorsque le Dr Yamanaka et son équipe reprogrammées la première cellule pluripotente à partir de cellules somatiques de souris, le champ de cellules souches a retrouvé sa possibilité et l' intérêt a été ravivé ^3. En fournissant plusieurs facteurs définis, les cellules souches pluripotentes ont été avec succès "induits" à partir de cellules somatiques adultes, et ont donc été nommés «cellules souches pluripotentes induites (CSPi)." En 2007, cette technique a été appliquée à des cellules humaines ^4, ce qui donne des cellules avec les caractéristiques exactes des CES , mais aucun du débat éthique. Théoriquement, iPSCs peut être générée à partir de tout type de cellule obtenue à partir de tout individu ou patient. CSPi spécifiques des patients sont en hausse comme un outil potentiel qui peut simuler les phénotypes de la maladie et les conditions épigénétiques de chaque patient. En utilisant la modification génétique ou d' autres procédés qui peuvent inverser l'état pathogène, iPSCs spécifiques à un patient peuvent également être utilisés en médecine personnalisée ^5. En outre, iPSCs sont moins associée à un rejet immunitaire parce qu'ils ont la même identité immunitaire du donneur, ce qui rend l' auto-transplantation plus réalisable ^6. Par conséquent, CSPi sont devenus la plate-forme la plus prometteuse dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues et des thérapies régénératrices. Compte tenu de ces avantages, les protocoles améliorés qui peuvent donner plus purs et des rendements plus élevés dans le moins de temps à partir de la source de cellules plus petites sont constamment en cours de développement. Une considération majeure de trouver le protocole le plus efficace pour l'application future est le type de cellules primaires. La plupart des premières générations proto iPSCcols sont optimisés pour les cellules adhérentes puisque les lignes iPSC originales ont été induites à partir de fibroblastes de la peau ^4. Cependant, l'isolement et la préparation de ces cellules sont main-d'œuvre. En outre, l'isolement des fibroblastes de peau comprend des interventions chirurgicales invasives qui peuvent devenir un défaut majeur pour une application plus large.

Par conséquent, pour l'utilisation ultérieure de iPSCs, une source de cellules à l'acquisition pratique est nécessaire. Le sang est considéré comme une source de cellules idéale car elle est obtenue par le biais d' une procédure minimalement invasive et non ^09/07. Dans cette étude, nous avons développé une simple modification au protocole générant hiPSCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Sans que le processus d'expansion difficile d'un type cellulaire spécifique, telles que les cellules CD34 +, les cellules du sang entier ou en série PBMC ont été étalées sur des plaques de matrice revêtu par centrifugation après transduction avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka. Cette méthode réduit le temps nécessaire à lafixation des cellules flottantes transduites et une diminution de la perte de cellules reprogrammées qui ne sont pas en mesure de joindre leur propre chef.

Protocole

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861).

1. Isolement des cellules monocytaires du sang

1. Isolement des cellules monocytaires (Jour -5)
   1. Obtenir au moins 10 ml de sang frais à partir d'un prélèvement de sang dans un tube de préparation de cellules (CPT).
   2. Transférer le sang dans un nouveau tube conique de 50 ml et dilué avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un ratio de 1: 4.
      REMARQUE: Un taux plus élevé de dilution peut être utilisé pour une plus grande pureté.
   3. Ajouter 10 ml de milieu à gradient de densité dans un nouveau tube conique de 50 ml et couche avec soin le sang dilué au-dessus du milieu de gradient de densité. Centrifuger à 750 g pendant 30 min à température ambiante (RT) sans frein de centrifugation.
   4. Soigneusement transférer la couche leucocytaire dans un nouveau tube conique de 50 ml, ajouter 30 ml de PBS dans le tube, et laver les cellules.
   5. Centrifuger les cellules à 515 g pendant 5 min à température ambiante.
   6. Jeter le PBS et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines.
   7. Compter les cellules et la plaque 1 x 10 ⁶ cellules par puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter PBS dans les puits environnants pour éviter l'évaporation.
   8. Stabiliser les cellules pendant 5 jours à 37 ° C dans 5% de CO ₂ avant la transduction. Ajouter un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais sur 3-4 jours sans perturber les cellules.

2. Transduction de virus Sendai

1. Transduction (jour 0)
   1. Recueillir et transférer les cellules du sang dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre.
   2. Préparer 3 x 10 ⁵ cellules par transduction et centrifuger les cellules à 515 xg pendant 5 min à température ambiante.
   3. Jeter le surnageant par aspiration et remettre les cellules dans 0,5 ml de milieu de cellules sanguines.
   4. Transférer les cellules dans un puits d'une plaque non revêtue 24 puits.
   5. Décongeler le mélange de virus Sendai dans la glace et l'ajouter à la sucellules spended. Ajouter virus Sendai aux cellules basées sur les recommandations du fabricant.
   6. Sceller la plaque avec un film d'étanchéité et centrifuger à 1.150 xg pendant 30 min à 30 ° C.
   7. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant une nuit (O / N).
2. transfert de la cellule à la matrice nourricière (jour 1)
   1. Le lendemain, le manteau, une plaque de 24 puits avec vitronectine. Diluer la solution de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine à un puits d'une plaque à 24 puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Retirer la solution de revêtement avant l'utilisation. Les plaques revêtues peuvent être stockées dans la température ambiante pendant 3 jours.
   2. Transférer tous les médias contenant les cellules et le virus au bien enrobé.
   3. Recueillir les cellules restantes avec un 0,5 ml supplémentaires de milieu de cellules de sang frais et l'ajouter à la cellule contenant bien.
   4. Centrifuger la plaque à 1.150 xg pendant 10 min à 35 ° C.
   5. Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 ml de iPSC médias, et de maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO ₂ O / N.
3. transfert de cellules Second (Jour 2)
   1. Enduire les puits d'une nouvelle plaque de 24 puits avec 5 ug / ml de vitronectine, comme décrit à l'étape 2.2.1. Utiliser un puits de la plaque pour chaque transduction.
   2. Transférer la suspension cellulaire à partir de la première plaque à la plaque de vitronectine nouvellement revêtu.
      NOTE: Si non nécessaire, les cellules en suspension peuvent être jetés. La procédure décrite à l'étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules.
   3. Pendant ce temps, ajouter 1 ml de milieux COPSi au puits de la première plaque, pour l' entretien et incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ O / N.
   4. Maintenir les cellules fixées à 37 ° C et 5% de CO ₂ et d' effectuer un changement quotidien des médias avec les médias iPSC frais. Colonies apparaîtront sur jours 14-21 après transduction.
   5. Centrifuge la plaque fraîchement revêtue contenant les cellules en suspension à 1.150 x g et à 35 ° C pendant 10 min.
   6. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO ₂ O / N.
   7. Le lendemain, retirer le surnageant et le remplacer par les médias iPSC frais.
      REMARQUE: La procédure décrite à l'étape 2.3 peut être répétée 2-3 fois avec les cellules en suspension. Si les étapes seront répétées, récolter les cellules dans le surnageant et répéter l'étape 2.3.
   8. Maintenir les cellules attachées avec des changements de médias quotidiens jusqu'à 80% de confluence est atteinte.

3. Reprogrammed Maintenance cellulaire

1. entretien précoce après la culture de la plaque de 24 puits
   1. 7-10 jours après la transduction, une fois que les cellules sont confluentes, préparer un, de 60 mm plat vitronectine-enduit. Avec une solution diluée de vitronectine dans du PBS pour obtenir une concentration finale / ml 5 pg. Ajouter 1 ml de vitronectine au plat et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
   2. laver lecellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM pour détacher les cellules.
   3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   4. Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu iPSC frais.
   5. Plate toutes les cellules remises en suspension sur le plat nouvellement revêtue de 60 mm.
   6. Ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux cellules et les maintenir à 37 ° C dans 5% de _CO2 jusqu'à ce que les cellules sont confluentes à 80%.
2. Split pour l'apparence de la colonie (Subcloning Préparation)
   1. Préparer un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme décrit à l'étape 3.1.2.
   2. Laver les cellules avec du PBS et ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d'EDTA pour détacher les cellules.
   3. Incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   4. Récolter les cellules et de les centrifuger à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min.
   5. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparer 1 x 10 ⁴ cellules par boîte.
   6. Centrifuger les cellules à 250 x g et à température ambiante pendant 2 min.
   7. Resuspendre 1 x 10 ⁴ cellules dans 6 ml de iPSC médias, la plaque - les sur le plat revêtu de 100 mm, et d' ajouter un inhibiteur de kinase 10 mM RHO aux médias.
   8. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant une semaine jusqu'à ce que les grandes colonies apparaissent.
      NOTE: Maintenir et élargir les colonies pour le sous-clonage. Le sous-clonage se fait habituellement en moins de 5 passages.
3. Colony picking en utilisant iPSC colonie solution détachant
   1. Une semaine avant la cueillette de la colonie, les graines 1 x 10 ⁴ cellules dans un, de 100 mm plat vitronectine revêtu, comme mentionné à l' étape 3.2.7.
   2. Préparer une 60 mm Antenne vitronectine revêtu par addition de 2 ml d'une solution de la vitronectine et l'incubation à température ambiante pendant au moins 1 h.
   3. En observant à travers un microscope (40X ou 100X), marquer des colonies avec des limites claires à l'aide d'un marqueur. Retirer la solution de vitronectine de la nouvelle plaque faite à l'étape 3.3.2 et ajouter 6 mldes iPSC médias supplémenté avec 10 mM RHO kinase.
   4. Retirez le milieu de culture des cellules et les laver avec 3 ml de PBS.
   5. Ajouter 1 ml d'une solution de détachement COPSi des colonies et les incuber pendant 30 secondes à température ambiante.
   6. On élimine la solution de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 secondes supplémentaires.
   7. En utilisant une pipette P200, dessiner 200 ul de milieu de la plaque et détacher les colonies ciblées par pipetage. Transférer les colonies dispersées à la nouvelle boîte de 100 mm.
   8. Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de _CO2.
      NOTE: Après avoir obtenu une colonie iPSC pure, les cellules ont été maintenues jusqu'à ce qu'ils atteignent le passage 10. La caractérisation a été réalisée après au moins 10 passages. Des dilutions d' anticorps et les informations d' amorce sont présentées dans les tableaux 1 et 2.

Résultats

Ce protocole présente une méthode simple pour reprogrammer CMSP isolées à partir du sang. En utilisant la combinaison de placage série et la centrifugation, iPSCs ont été produites avec succès. Avec cette méthode, iPSCs pourraient être générés avec une petite quantité de cellules du sang total sans isoler ou de développer un type de cellule spécifique. Nous avons généré avec succès à partir iPSCs seulement 1x10 ⁴ cellules dans une petite plaque de culture ...

Discussion

Puisque les cellules souches embryonnaires (CSE) ont montré plusieurs lacunes, la nécessité d'un outil de remplacement était nécessaire. Par conséquent, le développement des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par Yamanaka est venu sous les projecteurs internationaux. Il a été depuis près de dix ans Yamanaka a découvert que la pluripotence peut être induite en ajoutant seulement quatre gènes dans des cellules somatiques adultes. Depuis CSPi sont "induites" à partir de cellules soma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer