En utilisant le composé d'éthylène de libération, l'acide 2-chloroéthylphosphonique, comme un outil pour étudier la réponse de l'éthylène chez les bactéries

Résumé

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Résumé

Ethylene (C₂H₄) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Introduction

L'éthylène oléfine (C ₂ H ₄₎ a d' abord été découvert comme une hormone végétale en 1901 quand il a été observé que les semis de pois, cultivés dans un laboratoire qui utilise des lampes à gaz de charbon, présentaient une morphologie anormale dans laquelle les tiges (hypocotyles) étaient plus courtes, plus épais et courbé latéralement par rapport aux semis de pois normaux; un phénotype appelé plus tard , le ^1,2 triple réponse. Des études ultérieures ont démontré que l' éthylène est une phytohormone vitale qui régule de nombreux processus de développement tels que la croissance, la réponse au stress, la maturation des fruits et de la sénescence ^3. Arabidopsis thaliana, un organisme modèle pour la recherche en biologie végétale, a été bien étudiée en ce qui concerne sa réponse à l' éthylène. Mutants de réponse Plusieurs d'éthylène ont été isolés en exploitant le phénotype triple réponse observée dans l' obscurité-adulte A. semis thaliana en présence d'éthylène ^1,4,5. Le précurseur biosynthétique pour la production d'éthylène dans les plantes est 1-aacide minocyclopropane carboxylique (ACC) ⁶ et est couramment utilisé pour le dosage de la triple réponse pour augmenter la production endogène d'éthylène qui conduit à la triple réponse ^1,4,5 phénotype.

Bien que la réponse à l'éthylène est largement étudié dans les plantes, l'effet de l'éthylène exogène sur les bactéries est largement sous-étudiée en dépit de l'étroite association de bactéries avec des plantes. Une étude a rapporté que certaines souches de Pseudomonas peuvent survivre à l' aide d' éthylène en tant que source unique de carbone et d' énergie ^7. Cependant, seules deux études ont démontré que les bactéries réagissent à l'éthylène. La première étude a montré que les souches de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida et P. syringae étaient chimiotactique envers l' éthylène en utilisant un essai de bouchon d' agarose dans lequel l' agarose fondu a été mélangé avec un tampon de chimiotaxie éthylène pur équilibrée avec du gaz ^8. Cependant, à notre connaissance, il n'y a pas eu de further rapports en utilisant de l'éthylène gazeux pur pour caractériser la réponse d'éthylène bactérienne, probablement en raison de la difficulté de manipulation des gaz dans le laboratoire sans matériel spécialisé. Le deuxième rapport de la réponse à l'éthylène bactérienne a démontré que l' éthylène a augmenté la production de cellulose bactérienne et l' expression des gènes influencés dans la bactérie de fruits associée, Komagataeibacter (anciennement Gluconacetobacter) xylinus ^9. Dans ce cas, le composé libérant de l' éthylène, l' acide 2-chloréthylphosphonique (CEPA) a été utilisé pour produire de l' éthylène in situ dans le milieu de croissance bactérienne, en évitant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou d'un équipement spécialisé.

LCPE produit de l' éthylène à un rapport 1: 1 molaire pH supérieur à 3,5 ^10,11 à travers, une réaction de premier ordre catalysée par une base ^12-14. La dégradation de la LCPE est positivement corrélée avec le pH et la température ^13,14 et les résultats dans la production d'éthylène, le chlorure et le phosphate. CEPA offre aux chercheurs intéressés à étudier les réponses bactériennes à l'éthylène avec une alternative pratique à l'éthylène gazeux.

L'objectif global des protocoles suivants est de fournir une méthode simple et efficace pour étudier la réponse d'éthylène bactérienne et comprend la validation des niveaux physiologiquement pertinents de la production d'éthylène de la LCPE décomposition dans un milieu de croissance bactérienne, l'analyse de la culture pH pour assurer la LCPE décomposition ne soit pas compromise pendant la croissance bactérienne, et l'évaluation de l'effet de l'éthylène sur la morphologie et le phénotype bactérien. Nous démontrons ces protocoles utilisant K. xylinus Toutefois, ces protocoles peut être adapté pour étudier la réponse de l' éthylène dans d' autres bactéries en utilisant le milieu de croissance approprié et analyse le phénotype.

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Protocole

1. Produits chimiques

1. Préparer une solution mM CEPA 500 (144,49 g / mol) et une solution comprenant à la fois du NaCl 500 mM (58,44 g / mol) et 500 mM de NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O (137,99 g / mol) dans acidifiée (pH 2,5) de l'eau ultra-pure ou HCl 0,1N. Mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que les solutions sont claires.
2. Diluer en série (10x) les solutions 500 mM dans le même solvant pour obtenir 5 mM et des stocks 50 mM.
3. Préparer une solution 10 mM de 1-aminocyclopropane-carboxylique (ACC; 101,1 g / mol) dans de l'eau ultra-pure.
4. Filtre-stériliser les solutions mères et aliquotes stocker à -20 ° C.
5. Filtre-stériliser cellulase. aliquotes Conserver à 4 ° C.

2. Vérification de production d'éthylène de 2-chloroéthylphosphonique Acid Décomposition: Assay Triple Response

1. Surface-stériliser Arabidopsis thaliana Seeds Ecotype Columbia Utilisation de la vapeur en phase Méthode:
   ATTENTION: L'étape suivante produit toxic chlore gazeux. Effectuer la stérilisation des semences dans une hotte.
   1. Procurez-vous un contenant hermétique assez profond pour accueillir un bécher en verre de 250 ml pour la stérilisation des semences et le placer dans une hotte.
   2. Ajouter A. thaliana graines à un tube à centrifuger et placer le tube dans un rack. Placer la grille contenant le tube ouvert dans le récipient hermétique.
      Note: Ne pas remplir des tubes individuels plus de la moitié plein pour permettre au gaz de chlore de pénétrer les graines inférieures.
   3. Placez un bécher de 250 ml contenant 100 ml d'eau de Javel commerciale dans le récipient hermétique. ajouter avec précaution 3 ml d'HCl concentré à l'eau de Javel et sceller immédiatement le récipient avec son couvercle.
      ATTENTION: Bleach et HCl réagissent pour produire du chlore gazeux toxique qui agit à la surface-stériliser les graines.
   4. Incuber les graines en présence de chlore gazeux pendant 4 heures dans la hotte.
      Remarque: plus longs temps de stérilisation réduisent l'efficacité de la germination.
   5. Après stérilisation, laisser le cgaz hlorine pour évacuer dans la hotte pendant au moins 1 h puis sceller le tube de microcentrifugation. Laissez l'eau de Javel et le mélange HCl dans la hotte pendant au moins 24 heures avant de les jeter.
      Remarque: les graines stérilisées peuvent être conservés à température ambiante pour une utilisation immédiate.
   6. Gardez les graines à 4 ° C pour le stockage à long terme. Apportez des graines à la température ambiante avant d'ouvrir le tube de microcentrifugation pour éviter la condensation. graines de magasin dans l'obscurité.
2. Préparer des plaques d'agar dans 4-secteur des boîtes de Pétri (90 x 15 mm):
   1. Préparer 110 ml de milieu de croissance pour A. thaliana plants: 1x Murashige et Skoog (MS) d' un milieu de base ¹⁵ (4,33 g / L) contenant 1% (p / v) de saccharose et 0,8% (p / v) d' agar - agar. Ajuster le milieu MS à pH 6 avec NaOH.
   2. Préparer 100 ml de milieu de croissance bactérienne pour la décomposition CEPA: Schramm et Hestrin (SH) milieu ¹⁶ contenant 1,5% (p / v) d' agar - agar. Ajuster le milieu SH à un pH de 7 avec NaOH.
   3. Stériliser médias par autoclavage et Temper dans un bain d'eau C 55 °.
   4. Une fois que la gélose MS a trempé, ajouter 40 ml dans un flacon stérile. Pour préparer le milieu de croissance témoin positif pour R. thaliana semis, complètent les 40 ml aliquote de gélose MS avec 40 pl de mM ACC 10 pour obtenir une concentration finale de 10 uM ACC.
   5. Ajouter 5 ml de milieu aux quadrants appropriés des plats sectorisées Petri (figure 1) et laisser la gélose se solidifier. Préparer toutes les plaques en trois exemplaires.
      Remarque: la LCPE ne sont pas ajoutés au milieu de croissance jusqu'à ce que plus tard dans le protocole.

Figure 1:. Mise en place de plaques d' agar utilisés pour le dosage de la triple réponse à la LCPE Un schéma illustre les quadrants spécifiques pour le contrôle négatif (A), le contrôle positif (B), et les plaques expérimentales (C). Ce chiffre a été modifié depuis Augimeri et Strap ^9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Stratify A. thaliana Seeds pour assurer Germination synchrone:
   1. Ajouter environ cinquante A. thaliana graines sur chaque quadrant contenant de la gélose MS ou MS + ACC. Veiller à graines sont réparties uniformément pour faciliter le retrait et l'analyse des semis.
   2. Incuber les plaques contenant des graines dans l'obscurité à 4 ° C pendant 3-4 jours.
4. Décomposer LCPE sur Milieu de croissance bactérienne (SH) et effectuer Triple Response Assay:
   1. Après stratification, exposer les graines à la lumière fluorescente pendant 2 heures.
   2. Étaler 10 pi de la LCPE mM solution mère 500 sur les quadrants des plaques expérimentales contenant de la gélose SH (pH 7; Figure 1) pour obtenir une concentration finale de la LCPEde 1 mM.
   3. Sceller les plaques avec un film de laboratoire et couvrir de papier pour créer un environnement sombre pour les graines.
   4. Germer des graines par incubation des plaques dans l'obscurité à 23 ° C pendant 3 jours avec le côté agar vers le bas.
      Remarque: Les plaques peuvent être empilés, mais les contrôles négatifs doivent être placés sur le fond depuis l'éthylène est plus léger que l'air.
5. Analyser Triple Response Assay données:
   1. Avec des pinces de flamme stérilisée, retirer les semis simples à partir d'une plaque correspondant à chaque traitement et vue sous une dissection ou d'un microscope numérique USB. Assurer le fond des plants sont alignés et photographie.
   2. Retirer 30 plants de chaque quadrant (60 plants par répétition biologique et 180 plants par traitement). Aligner sur une surface avec un fond noir et la photographie avec une règle.
   3. Mesurer la longueur de l' hypocotyle (mm) de plants répliqués en utilisant le logiciel ImageJ ^17. Réglez l'échelle en cliquant et en faisant glisser le * Droit *Outil pour sélectionner une longueur de 10 mm. Sélectionnez "Scale Set" sous l'onglet "Analyser" et régler la distance connue à 10. Utilisation de l'outil * segmenté *, cliquez et faites glisser pour sélectionner la longueur de l'hypocotyle et appuyez sur M pour mesurer la distance. Comparez les moyens de répétitions biologiques à l'aide d'une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont considérées comme significatives si p <0,05.

3. Analyse du pH tout au long de la croissance bactérienne

1. Cultivez et Quantifier Komagataeibacter Cultures xylinus Starter en Triplicate:
   1. Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à ce qu'une _DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
   2. Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). 5 ml stérile à 0,85% (p / v) de NaCll de solution, se laver les cellules deux fois et remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
   3. Quantifier cellules à l'aide d'une chambre de comptage de Petroff-Hausser.
2. Inoculer des cultures pour l'analyse du pH:
   1. Ajouter 150 ml de bouillon SH (pH 7), additionné de 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration à douze flacons de 500 ml avec des opercules. Inoculer flacons avec K. xylinus cultures starter à une concentration de 10 ⁵ cellules / ml. En utilisant les trois cultures de départ, préparer trois répétitions biologiques par traitement.
   2. cultures Supplément avec 300 pi des solutions de stock mM CESP 5, 50, ou 500 pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter les cultures témoins non traitées avec 300 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA.
   3. Sceller les fioles en collant étroitement les opercules des flacons et incuber les cultures pendant 14 jours à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute.
3. Chaque jour, asépticaretirer lly échantillons de 5 ml de chacune des cellules du ballon et de granulés par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Transfert surnageants dans un tube propre et mesurer le pH de chaque répétition biologique en utilisant un pH-mètre.
4. Analyser les données temps-cours en traçant le pH moyen des répétitions biologiques.
   Remarque: il est important que le pH de la culture ne tombe pas au-dessous de 3,5; un pH de culture de 5 réduit de manière significative l'éthylène libération de la LCPE, et un pH inférieur à 3,5 inhibe complètement l'éthylène libération.
5. Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH ₂ PO ₄ en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.

4. Colony Morphologie

1. Cultivez K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate:
   1. Inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. incubales cultures TE à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à une _DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
   2. Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver les cellules, puis remettre en suspension le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
2. 24 préparer des plaques d'agar contenant 25 ml de SH (pH 7) avec des moyennes de 1,5% (p / v) d'agar.
3. Une fois que solidification de la gélose, étaler 50 pi de 5, 50, et 500 mM de CESP solutions mères sur l'agar pour obtenir des concentrations finales de CESP de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Mettre en place des plaques témoins non traités et de solvants, qui consistent en aucune modification et d'étalement de 50 ul du solvant utilisé pour dissoudre les composés d'essai.
4. Plaques Streak pour des colonies isolées avec une boucle complète (~ 5 pi) de K. culture starter xylinus et les sceller avec un film de paraffine. Inoculer toutes les plaques en triple. Incuber les plaques pendant cinq jours à 30 ° C.
5. Photcolonies de ographie à un grossissement de 20x en utilisant un microscope numérique USB et d'évaluer qualitativement coloniale morphologie et la production de cellulose sur un milieu solide.
   Remarque: La cellulose se présente comme une substance trouble le long du bord de la colonie.
6. Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH ₂ PO ₄ en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.

5. Essais des pellicules

1. Cultivez et Quantifier K. Cultures xylinus Démarreur à Triplicate:
   1. En trois exemplaires, inoculer une seule colonie de K. xylinus dans 5 ml de milieu SH (pH 5) supplémenté avec 0,2% (v / v) de cellulase stérilisé par filtration. Incuber les cultures à 30 ° C sous agitation à 150 tours par minute jusqu'à ce qu'une _DO600 de 0,3 à 0,4 soit atteint (environ 72 h).
   2. Récolte starter cultures par centrifugation (2000 xg, 4 ° C; 10 min). Avec 5 ml de solution saline stérile, laver tcellules il deux fois et remettre le culot cellulaire. Gardez les cellules sur la glace.
   3. Quantifier cellules à l'aide d'une chambre de comptage de Petroff-Hausser.
2. Préparer Maître Mixes pour inoculer 24 puits Plaques:
   1. Supplément 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 pi du 5, 50, et 500 actions mM de CESP pour obtenir des concentrations finales de la LCPE de 0,01, 0,1, et 1,0 mM, respectivement. Compléter un autre 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 ul de solvant utilisé pour dissoudre CEPA. Vortex pour mélanger.
   2. Divisez par 60 ml de la LCPE milieu contenant en quatre 14 ml aliquotes. Inoculer trois des 14 ml aliquotes avec répétitions biologiques de culture de départ à une concentration de 10 ⁵ cellules / ml. Garder les tubes avec des cellules sur la glace pour empêcher la production de cellulose.
      Remarque: Le restant 14 ml aliquote sera utilisé pour les puits témoins stériles.
3. Inoculer Plaques 24 puits:
   1. Testez chaque traitement dans sa propre assiette avec trois rangées de répétitions et biologiquesune rangée de témoins stériles (Figure 2).

Figure 2:. Flow-diagramme illustrant le protocole utilisé pour le dosage de la pellicule et de l' analyse Stock LCPE supplémenté milieu SH pH 7 (60 ml) est aliquoté pour trois inoculations réplicats biologiques distincts et un contrôle stérile (14 ml chacun). Ces cultures sont ensuite aliquotées en six répétitions techniques (2 ml) dans une plaque de 24 puits, puis scellés avec un film de paraffine. Après incubation pendant 7 jours à 30 ° C, pellicules sont récoltées et caractérisées par la détermination du poids humide, l' épaisseur, le poids sec, et la cristallinité par FT-IR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure

2. Utilisation du mélange maître de 14 ml, ajouter 2 ml dans each de six puits d'une plaque de 24 puits stérile. Remplissez les trois répétitions biologiques et le contrôle stérile (Figure 2). Répétez l'opération pour chaque traitement.
3. plaques d'étanchéité avec un film de paraffine et incuber statiquement pendant 7 jours à 30 ° C.

4. Récolte et mesure Pellicle poids humide, épaisseur, poids sec (Cellulose Yield) et Cristallinité (figure 2):
   1. Enfoncer un côté de la pellicule pour élever le bord de la pellicule adverse et enlever les pellicules individuelles avec une pince. Tout en conservant l'adhérence, placez-les sur du papier absorbant frais pour 3 sec pour éliminer le milieu excès avant la pesée pour déterminer leurs poids humides.
   2. Alignez pellicules adjacentes à une règle et une photographie du côté à l'aide d'un appareil photo numérique haute résolution.
   3. En utilisant le logiciel ImageJ ^17, mesurer l' épaisseur de la pellicule sur l'épaule gauche, l' épaule droite et au centre de chaque pellicule. En moyenne toutes les répétitions techniques pour chaque Replicat biologiquee.
   4. transférer individuellement les pellicules dans les puits d'une plaque à 6 puits. Traiter les pellicules avec 12 ml de NaOH 0,1 N à 80 ° C pendant 20 minutes pour lyser les cellules.
   5. Retirez le NaOH et neutraliser les pellicules en lavant avec de l'eau ultra-pure pendant 24 heures avec agitation. Changez l'eau toutes les 6 heures.
      Remarque: Les pellicules doivent être blancs à l'issue de l'étape de lavage.
   6. La place sur tapis pellicules de silicium et sèche à 50 ° C pendant 48 heures à poids constant. Une fois sec, retirer du tapis et de mesurer le poids des pelliculaires sur une échelle analytique pour déterminer le rendement de cellulose bactérienne.
   7. Analyser pelliculaire cristallinité à l' aide de transformée de Fourier par spectroscopie infrarouge (FT-IR) en utilisant 32 balayages et une résolution de 4 cm ^-1 dans la plage de 4000 à 650 cm ^-1. Calculer l'indice de cristallinité, CI (IR), en utilisant A ₁₄₃₇ / A _895; le rapport d'absorbance de la bande "cristallin" et "amorphe bande" ¹⁸ comme décrit précédemment.
5. Afin de contrôler les niveaux de chlore et de phosphate, réaliser une expérience identique , en utilisant 0,01, 0,1 et 1,0 mM de la solution de NaCl NaH ₂ PO ₄ en utilisant 5, 50 et 500 mM de valeurs, respectivement.
6. Analyser Pellicle données:
   1. Calculer pelliculaire hydratation en déterminant la différence entre le poids humide de la pellicule et le poids sec.
   2. La moyenne des valeurs de toutes les répétitions techniques pour obtenir une valeur unique pour chaque répétition biologique pour l'analyse statistique. Comparez les traitements à l'aide d'une ANOVA à une voie avec un test de comparaison multiple de Tukey. Les différences sont significatives si p <0,05.
   3. Normaliser les données que le pour cent des témoins non traités et tracer les moyens de réplicats biologiques.

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Résultats

Une configuration de plaque schématique pour la vérification de l' éthylène libération de la LCPE dans un milieu SH (pH 7) par le test de triple réponse est représentée sur la figure 1A - C. Un organigramme illustrant le protocole pelliculaire est représenté dans la figure 2. Dark-adulte A. thaliana plants présentent le phénotype de réponse triple (hypocotyle court et plus épais avec un crochet apicale exagér?...

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Discussion

Les méthodes décrites ici décrivent la production in situ de l' éthylène à partir CEPA pour l'étude de la réponse à l'éthylène bactérien en utilisant l'organisme modèle, K. xylinus. Cette méthode est très utile que l' éthylène peut être produit en complétant tout milieu aqueux qui présente un pH supérieur à 3,5 à ^10,11 CEPA niant la nécessité d'éthylène gazeux pur ou de l' équipement de laboratoire spécialisé. Ce procédé ne se limit...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)	Sigma	A3903	Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish	Phoenix Biomedical	CA73370-022	For testing triple response
Agar	BioShop	AGR001.1	To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera	Canon	3818B004	For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921	Sigma	C2730	Aqueous solution
Citric acid	BioShop	CIT002.500	For SH medium
Commercial bleach	Life Brand	57800861874	Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl	BioShop	HCL666.500	Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope	Plugable	N/A	For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid)	Sigma	C0143	Ethylene-releasing compound
Glucose	BioBasic	GB0219	For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube	LifeGene	LMCT1.7B	1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium	Sigma	M5519	Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O	BioShop	SPD579.500	Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl	BioBasic	SOD001.1	Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O	BioShop	SPM306.500	Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH	BioShop	SHY700.500	Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film	Parafilm	PM996	For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological)	BioShop	PEP403.1	For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	3900	Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm	VWR	28145-501	For sterilizing cellulase
Sucrose	BioShop	SUC600.1	Sucrose for MS medium
Yeast extract	BioBasic	G0961	For SH medium