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  • Résumé
  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Résumé

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les technologies d'imagerie ont révolutionné la façon dont les médecins à diagnostiquer et de surveiller la maladie. Ces techniques d'imagerie, cependant, ont été largement limitée à des systèmes d'imagerie du corps entier, comme la tomographie par émission de positrons (PET), le photon unique par émission de positrons (SPECT), tomographie assistée par ordinateur (CT) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Une attention particulière a été accordée au cancer, et des percées technologiques d'imagerie ont grandement amélioré la façon dont cette maladie est diagnostiquée et traitée. Malgré ces progrès, il y a un endroit où ces technologies d'imagerie ne correspondent tout simplement pas: la salle d'opération. Bien que les techniques d'imagerie du corps entier peut aider à la planification chirurgicale, ils manquent généralement des résolutions spatiales suffisamment élevées pour aider les médecins à déterminer en temps réel si tout le tissu tumoral a été enlevé ou de tissu tumoral résiduel reste caché aux marges chirurgicales 1. Faire en sorte que pas infiltrativemarges tumorales sont laissés est l'un des objectifs chirurgicaux les plus importants, et les chirurgiens doivent marcher un corde raide entre la résection des tissus rigoureux et prudent. Si trop est enlevé, les effets secondaires indésirables pour le patient sont exacerbés; si trop peu est enlevé, les taux de récidive sont augmentés de 2, 3. Par conséquent, il est essentiel de définir des marges tumorales précises, et nous croyons que l'imagerie peropératoire chimioluminescent peut aider à améliorer la précision de l'identification des marges tumorales en aidant les chirurgiens de visualiser les tissus malins qui pourraient autrement ne pas être détectés avec des techniques établies.

Il existe de nombreuses technologies d'imagerie actuellement étudiés pour leur utilité possible que les systèmes d'imagerie peropératoire. Ceux - ci comprennent des sondes ß et γ-émettant un rayonnement 4, la fluorescence optique 5, Raman spectroscopie 6 >, 7 et Cherenkov luminescence 8, 9. À ce jour, cependant, aucune de ces sont établies comme des outils cliniques standard. l'imagerie de fluorescence optique a jusqu'ici avéré être le plus prometteur de ces techniques et est donc le plus exploré. Bien qu'il ait déjà été révélé être un outil précieux pour de nombreuses applications, il ne va pas sans limitations. En effet, son principal inconvénient est la fluorescence de fond généré par le tissu biologique intrinsèquement autofluorescents. Ce signal de fond autofluorescente est un produit de l'excitation du tissu environnant, en plus du fluorophore, par la source de lumière externe nécessaire pour la production d'un signal fluorescent. Du point de vue pratique, cette autofluorescence peut potentiellement conduire à de faibles rapports signal sur bruit, ce qui peut limiter l'utilité de cette technologie dans la salle d'opération.

Le principalavantage de l'imagerie par chimioluminescence sur l'imagerie de fluorescence est qu'aucune lumière d'excitation est nécessaire. Par conséquent, il n'y a pas de fond d'autofluorescence. En imagerie par chimiluminescence, l'énergie d'excitation est générée au lieu chimiquement. Ce procédé ne produit aucun signal de fond non voulue et peut donc entraîner une augmentation des rapports signal sur bruit. Cela pourrait finalement conduire à la détection plus précise et exacte des marges chirurgicales. Assez étonnamment, l'utilité de cette approche comme une technique d'imagerie peropératoire est restée inexplorée 10. En effet, l'exemple le plus proche de cette technique est l'oxydation du luminol par la myéloperoxydase chez les souris 11, 12, 13. imagerie biomédicale chimioluminescente est donc un domaine assez inexploré de la recherche qui pourrait offrir les avantages suivants: (1) autofluorescence minimale résultant en un signal de fond bas avec salutle rapport signal-bruit gher; (2) les longueurs d'onde accordables d'émissions chimioluminescentes allant du visible au proche infrarouge; et (3) complexes chimiluminescents fonctionnalisables qui, lorsqu'il est combiné avec les technologies de liaison et de biomolécules qui existent déjà ciblées, donnent accès à des bibliothèques entières de sondes d'imagerie moléculaire ciblées 14.

Cette étude de validation de principe illustre l'utilité potentielle d'imagerie chimioluminescent dans le milieu biomédical à l'aide d'un agent d'imagerie à base de ruthénium. Les propriétés chimioluminescentes de ce composé sont bien étudiés, des enquêtes datant du milieu des années 1960 15. Lors de l' activation chimique, l'agent produit de la lumière à environ 600 nm 16, ce qui est bien adapté à des fins d'imagerie médicale. L'énergie d'activation est fourni par une réaction d'oxydoréduction qui conduit à un état-excité qui a une durée de vie de 650 ns dans l' eau 17 -folldue par la génération de photons lors du relâchement de cet état excité. Grâce à l'utilisation d'un nébulisateur à distance spécialement conçu, nous avons pu détecter le composé à la fois ex vivo et in vivo. Les résultats des premières expériences sont très prometteurs, ce qui suggère une enquête plus approfondie de cette technologie.

Protocole

Déclaration éthique: Tous les in vivo des expérimentations animales décrites ont été réalisées selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC).

1. Construction d'un dispositif de nébulisation

  1. Fixer le bois de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en position verticale dans le centre de la partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) à l' aide de deux vis (4 x 25 mm 2). Fixer le bois de la partie C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) au milieu de la partie A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) à l' aide d' une vis, de telle sorte que la partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) peuvent encore être déplacés. Voir Figure 1.
  2. Percez deux trous à travers l'extrémité inférieure de la gâchette de la bouteille de pulvérisation d'un mini-pulvérisateur 3 oz plastique (D) et pousser une tige en acier inoxydable (10 cm de "acier 1/16) (E) à travers pour former deux boucles, l'une des deux côté de la gâchette.
  3. Enveloppez la partie inférieure de la bouteille de pulvérisation avec du ruban adhésif (F) pour empêcher les attaches de câble de glisser. Fixer la bouteille à bois partie C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant les deux attaches de câble en plastique (28 cm) (G) de pulvérisation.
  4. Coupez le moteur 011 d'asservissement (I) et de le reconnecter avec les câbles en vrac de la commande d'asservissement (H). Ensuite, fixez le servo - moteur vers le haut de la partie A du bois (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en utilisant du ruban adhésif.
  5. Fixer un crayon (J) sur le levier de servo-moteur à l'aide du trombone (K). connecter Étroitement les parties les plus externes du crayon pour les boucles de tige en acier à l'aide de fils de torsion en plastique couverte (L) et fixer les extrémités sur le crayon avec du ruban adhésif.
  6. Coupez le connecteur du câble magnétique de l'unité de commande de servo-moteur (M) et le remettre en place le câble de haut-parleur (N). Ensuite, collez l'unité servo de commande du moteur à bois partie B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Couper un câble w1 avec des connecteurs magnétiques en deux et fixer une partie à l'extrémité libre du cuivre scâble peaker (1 m). Connectez le (magnétique) i2 interrupteur à bascule et la puissance de p1 au câble w1 disponible et une batterie de 9V.

2. Sensibilité Détermination de la méthode

  1. Dans un tube de centrifugation de 1,5 mL, préparer des solutions de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans l' eau d'osmose inverse (100 pi) dans des quantités de 260 ug (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 pg (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 pg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), et 3 ng (3,5 pmoles).
  2. Mélanger 100 ul de chaque [Ru (bpy) 3] Cl 2 solution avec 100 ul d'une solution aqueuse de nitrate d' ammonium et de cérium ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) dans l' eau (25 mM) sur une lame de microscope.
  3. Mettre en place l'acquisition dans le lecteur de bioluminescence par l' initialisation du logiciel d'imagerie.
    1. Connectez-vous au profil de l'utilisateur et recherchez le acquipanneau de contrôle d 'opposition. Cliquez sur "Initialiser" et attendre que l'appareil est prêt.
    2. Recherchez "Mode Imaging" et assurez-vous "luminescent" et "Photo" sont vérifiées et que "Fluorescent" est décochée.
    3. Change "temps d'exposition" réglage pour "luminescent" à 20 s. Définissez les paramètres restants pour "luminescent" comme suit: "Binning": Medium; "F / stop": 1; et "Filtre d'émission": Open.
      REMARQUE: Les temps d'exposition pourraient devoir être adaptés en fonction de l'instrumentation et le réglage expérimental utilisé, si différente de la configuration présentée.
    4. Pour "Photo," utiliser les paramètres suivants: "Temps d'exposition": Auto; "Binning": Medium; et "F / stop": 8. Réglez le "Sujet Hauteur" selon l'imagerie target.Look pour le menu «Field of View" déroulante. Le réglage initial est "C" Changer à "B" (14 cm de distance entre le cAmera et le stade de l'échantillon).
  4. Mettre en place le nébulisateur en plaçant une lame de microscope sur une feuille de papier noir sur le plancher de la chambre d'imagerie pour la protéger de l'agent oxydant. Mélanger 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution avec 100 pi d'une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Observer la boîte réticule vert.
    1. Placez le sujet d'imagerie sur le papier de construction noir, de telle sorte que la zone d'intérêt est dans le centre du vert boîte à lumière réticule apparaît sur la scène de l'échantillon. Préparer le nébuliseur en détachant le flacon pulvérisateur en plastique du support en bois. Remplir une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l'eau / éthanol) dans son réservoir en matière plastique et le remettre en place sur le support en bois.
    2. Placez le nébuliseur à l'intérieur du lecteur de bioluminescence et assurez-vous que le cordon d'alimentation est débranché de la corde du nébuliseur. Assurez-vous que l'interrupteur d'alimentationest activée, l'interrupteur à bascule est éteint, et le voyant rouge est allumé Placer le nébuliseur de telle sorte que le débit de pulvérisation est dirigé vers la zone d'intérêt sur le sujet d'imagerie, tout en minimisant l'obstruction de la vue de la caméra vers l'objet d'imagerie par la tête de buse de pulvérisation.
    3. Placez de petits morceaux de papier noir de construction sur tous les points chauds potentiels (par exemple, des marques blanches sur des lames microscopiques ou des sites d'injection) pour les protéger des embruns. La place d'au moins 40 cm de câble à distance du nébuliseur dans la chambre d'imagerie, de telle sorte qu'elle ne gêne pas le sujet d'imagerie, le nébulisateur, ou le verrou de porte magnétique. Fermez la porte du système d'imagerie.
      NOTE: Le réticule va changer la taille sur la base du «Field of View" mise en "image vivante;" assurez-vous que cela est réglé sur "B".
  5. Acquérir une image en lançant la séquence d'imagerie. Cliquez sur "Acquérir" dans le "Panneau de configuration d'acquisition." Sur la première Sequ d'imagerierence, activer la sauvegarde automatique si on le souhaite (recommandé) et choisissez un dossier de données. Ignorer le "Edit Imaging Labels" boîte de dialogue jusqu'à la fin de la séquence.
    REMARQUE: Le logiciel de contrôle affiche les actions de l'instrument, étape par étape en temps réel. Après la préparation de la mesure et le déplacement du stade de l'échantillon à la bonne position, il ouvre l'obturateur de la caméra et compte le temps de mesure. L'ouverture de l'obturateur peut également être entendu par un bruit de clic généré par la machine.
  6. Comme l'ouverture de l'obturateur, pulvériser trois salves d'une solution de triéthylamine (1: 3 dans de l'eau / éthanol, 0,24 ± 0,04 ml par pulvérisation rafale) en mettant l'interrupteur à bascule à trois reprises pour générer chimioluminescence.
    NOTE: L'étape de l'échantillon se déplace pendant la mesure. Laisser un câble suffisamment (minimum 40 cm) à l'intérieur de l'instrument pour permettre cela. Assurez-vous que la solution à pulvériser par le nébuliseur peut être aspiré par le tube ascendant et qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le tuyau. Avoir plusieurs batterie de rechanges pour le nébuliseur prêt en cas de besoin.

3. Imagerie in vivo Après injection intraveineuse systémique

  1. Dans un microtube de 1,5 ml, la préparation de 100 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) , solution contenant entre 8 et 33 nmoles de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l' eau (25 mM) en même temps.
  2. Intraveineusement injecter 100 pi de [Ru (bpy) 3] Cl 2 dans la veine de la queue des souris en bonne santé (n = 5).
  3. Euthanasier les souris 10 minutes après l' injection par l' intermédiaire de CO 2 asphyxie.
    1. Retirer la peau avec une coupe Y du torse, puis retirez l'arc costal dans une forme en U pour exposer le cœur et les poumons. Perfuser les souris en coupant un orifice de sortie dans l'oreillette droite et en injectant 20 ml de PBS à travers une aiguille de calibre 24 dans le ventricule gauche 18. Découpez soigneusement par le ventrela peau et exposer le rein et le foie. Couper longitudinalement à travers les organes pour créer une coupure visible.
  4. Mettre en place l'acquisition comme décrit dans les étapes 2.3-2.6, avec les modifications suivantes.
    1. Après avoir soigneusement lavé le réservoir en plastique nébulisateur, le remplir avec une solution de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 dans de l' eau (25 mM) au lieu de triéthylamine.
      NOTE: Il est important de rincer la buse du nébuliseur après chaque utilisation, car cristallisant (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 peut détruire la buse de pulvérisation après plusieurs utilisations.
  5. Utilisez l'ensemble des échantillons d'animaux ou d' organes pour l' imagerie.
    1. Pour l'imagerie de l'abdomen entier, positionner la carcasse de la souris avec l'abdomen ouvert face à la caméra et la tête pointant vers l'arrière de l'instrument. Centrer l'organe à imager (par exemple, le foie ou les reins) dans le vert boîte à lumière réticule.
    2. Fou individu imagerie d'organes et de quantification, retirez la souris de l'instrument d'imagerie et la broche vers le bas. A partir de la cavité du corps déjà ouvert, exciser les organes internes (par exemple, les reins, le foie, les poumons, les muscles, la rate, le cerveau et le cœur). Couper à travers la peau de la patte arrière pour exciser le tissu musculaire. Ouvrez soigneusement le crâne avec un scalpel pour exciser le cerveau.
      1. Si l'organe d'intérêt est le foie, les reins ou la rate, couper tous les organes dans la moitié longitudinalement, placer chaque organe sur une boîte de Pétri ou un morceau de papier de construction noir.
    3. Suivez la procédure décrite dans les étapes 2.3-2.6 pour établir l'émission relative du traceur chimiluminescent pour les organes simples.

4. Imagerie in vivo des ganglions lymphatiques

  1. Préparer 10 pi d'une solution de PBS contenant 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Préparer une solution aqueuse de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en water (25 mM) en même temps.
  2. Injecter 10 ul de la solution sous la peau dans la patte arrière de souris en bonne santé (n = 5). Comme témoin négatif, injecter la patte controlatérale avec 10 pi de pur PBS. Sacrifiez les souris via CO 2 asphyxie 15 min après l'injection. Enlever la peau sur les deux pattes arrière pour exposer les canaux lymphatiques jusqu'aux ganglions lymphatiques poplités.
  3. Mettre en place l'acquisition telle que décrite à l'étape 3.4.
  4. Retirer les ganglions lymphatiques poplités des deux pattes arrière, les couper en deux et les pulvériser avec oxydant sur une boîte de Pétri, comme décrit précédemment (étape 3.5.3), aux fins de quantification.

Résultats

Le système de nébuliseur décrit dans la section 1 du protocole peut être construit à partir de matériaux facilement disponibles à un faible coût. Il est destiné à être un encart pour la télécommande déclenché par pulvérisation du réducteur / agent oxydant à l' intérieur d' un lecteur de bioluminescence (figure 1). Notre conception permet le fonctionnement en toute sécurité du nébuliseur dans le lecteur de bioluminescence à une distance de 1...

Discussion

Ici, nous présentons une technologie qui est capable de délimiter le tissu optiquement par l'intermédiaire de l'émission de photons créés par un rapporteur chimioluminescent. Contrairement à d' autres, plus établi, les technologies 4, 5, 6, 7, 8, 9, ce système rapporteur chimioluminescent utilise une son...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

Références

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