Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Résumé

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Résumé

Zika Virus (ZIKV) est un pathogène émergent qui est lié à des anomalies du développement fœtal telles que la microcéphalie, des anomalies oculaires et troubles de la croissance. ZIKV est un virus à ARN de la famille des Flaviviridae. ZIKV est principalement transmis par les moustiques, mais peut aussi se propager par la mère à la transmission verticale du fœtus ainsi que le contact sexuel. À ce jour, il n'y a pas d'options de traitement ou de vaccin fiables pour protéger les personnes infectées par le virus. Le développement d'un système de culture cellulaire reproductible efficace du virus zika infectieux est essentielle pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réplication de ZIKV ainsi que le développement de médicaments et de vaccins. À cet égard, un protocole décrivant un système in vitro Zika de culture de mammifère à base de cellules pour la production virale et de la croissance virale analyse est rapporté ici. Des détails sur la formation de plaques de virus zika sur une monocouche cellulaire et un essai sur plaque pour mesurer le titre viral sont présentés. génome viral cinétique de replicationet intermédiaires replicatory double brin du génome de l'ARN sont déterminées. Cette plate-forme de culture a été utilisée pour l'écran contre une bibliothèque d'une petite série de cytokines conduisant à l'identification de l'interféron-α (IFN-α), l'IFN-β et IFN-γ en tant que puissants inhibiteurs de la croissance virale Zika. En résumé, une maladie infectieuse système in vitro Zika virale de la culture et de diverses analyses virologiques sont démontrées dans cette étude, qui a le potentiel de grandement bénéficier la communauté des chercheurs à élucider davantage les mécanismes de la pathogenèse virale et l'évolution de la virulence virale. Antiviral IFN-alpha peut en outre être évalué en tant que post-exposition prophylactique, et l'option de traitement prophylactique des infections à virus Zika dans les populations à haut risque, y compris les femmes enceintes infectées.

Introduction

Zika Virus (ZIKV) est un agent pathogène humain important associé à une microcéphalie et une mauvaise issue de la grossesse ^1,4. ZIKV appartient à l'ensemble des flavivirus médicalement pertinents qui peuvent causer des troubles neurologiques tels que la dengue, virus du Nil occidental, et les virus de l'encéphalite de Saint-Louis. Le principal mode de transmission du virus est par le moustique vecteur Aedes aegypti, et, en outre, la transmission sexuelle a également été rapporté ^5,6. ZIKV est devenu un problème de santé mondial majeur en raison de la répartition géographique de l'expansion du moustique vecteur et de sa forte corrélation avec des malformations congénitales. ZIKV a été isolé en 1947 à partir d' un singe rhésus sentinelle dans la forêt Zika, l' Ouganda et le premier cas humain a été rapporté en 1952 ^7,8. Les personnes qui sont infectées par le ZIKV présent avec des symptômes bénins tels que la fièvre, des éruptions cutanées, des maux de tête, la conjonctivite, et les muscles / douleurs articulaires. Les femmes enceintes infectées peuvent transmettre ZIKV au fœtus en développement ^1. ZL' infection de IKV a également été lié à un syndrome de Guillain-Barré, un nerf périphérique démyélinisation auto-immune trouble ^9.

Le génome viral est constitué d'Zika un sens positif, une molécule d'ARN simple brin qui est à environ 10,8 kilobases de longueur. La structure du génome est organisé comme 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, avec des régions non codantes (NCR) flanquant une région codant pour la protéine ^6. Un polyprotéine unique (3419 aa) est traduit qui est co- et post-traductionnelle clivé en 10 petits peptides. Tant le 5'NCR et 3'NCR ARN structures tige-boucle jouent un rôle crucial dans le début de la traduction du génome viral et la réplication. Les éléments de structure du génome sont constitués par des protéines de capside, la membrane et l'enveloppe. Les protéines non structurelles sont essentielles pour la replication du génome.

Actuellement, Zika souches virales sont regroupées en trois génotypes principaux: Afrique de l'Ouest, Afrique de l' Est et d' Asie ^6,10-13. Il a été proposé que la lignée Afrique de l' Est se propager à l' Afrique de l' Ouest et de l' Asie, où il est ensuite plus évolué ^12. Le génotype asiatique est responsable des flambées actuelles dans les Amériques. zika virus peut être cultivé dans les deux moustiques et les cellules de mammifères. Des fibroblastes primaires dermiques, les cellules dendritiques immatures, des cellules progénitrices neurales corticales, ainsi que les cellules Vero sont sensibles à une infection virale Zika ^10,14,15. À la fois de type I et de type II , interférons ont été montrés pour limiter la croissance des ZIKV dans les fibroblastes de la peau ^15. Les objectifs de cette étude sont de fournir, un protocole détaillé par étapes pour la production et l'analyse du génotype asiatique ZIKA souche virale PRVABC59 dans un système de culture de cellules de mammifères et de démontrer l'utilité de ce système de culture infectieuse comme une plate-forme de développement de médicaments. Cette ressource a le potentiel de grandement bénéficier la communauté de recherche virale et neurologique Zika à élucider imécanismes ts de la pathogenèse virale et de l'évolution de la virulence virale.

Protocole

Note: Un aperçu schématique du flux de travail est présenté dans la figure 1.

1. cellules

1. Utiliser des cellules Vero pour la production de virus zika et l'analyse du cycle de réplication virale.
2. Préparer un milieu complet de croissance contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 unités / ml) et 10 mM de HEPES.
3. La culture des cellules Vero avec le milieu de croissance complet spécifiée à 37 ° C avec 5% de CO _2.

2. Zika Virus production

1. Récolter les cellules Vero à une densité cellulaire de 80% en utilisant 0,25% de trypsine dans le flacon T-75 et compter les cellules.
   1. Aspirer les médias de la culture flacon T-75 et rincer les cellules avec 2 ml du tampon phosphate salin (PBS).
   2. Ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% et on incube le flacon à 37 ° C pendant 5 min.
   3. Ajouter 8 ml de sérum contenant du milieu de croissance pour inactiver la trypsine. Pipet haut et bas pour susPend cellules et transmettent les cellules dans un tube de 15 ml.
   4. Retirer 10 pi de cellules et mélanger avec une quantité égale de 0,4% de bleu trypan. Charger le mélange préparé dans la chambre de tiroir de comptage des cellules viables et d'obtenir des cellules comptages en utilisant un compteur de cellules automatisé.
2. Seed un total de 7 millions de cellules dans un volume dans un flacon T-160 30 ml.
3. Le lendemain, préparer une multiplicité appropriée de l'infection (0,01 à 0,1 MOI) de Zika virus inoculum dans un milieu de culture exempt de 10 ml de sérum par flacon.
4. Retirez le support passé du flacon T-160, puis ajouter l'inoculum viral fraîchement préparé (10 ml).
5. Incuber les fioles inoculées à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 4-6 heures. Etaler l'inoculum en inclinant doucement les flacons de côté à chaque heure.
6. A la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum avec des milieux chauds additionné de sérum de croissance (30 ml) pour chaque flacon. Ensuite, continuer la culture virale pour 96 heures suivant.
7. Vérifier la progression de dansfection en observant l'apparition de plaques virales sur la monocouche cellulaire à l' aide d' un microscope à contraste de phase et prendre des images (figure 2) selon les besoins à 40X et 200X grossissements.

Figure 2:. Plaques formées par le virus Zika sur une monocouche de cellules Vero images lumineuses de différents grossissements de terrain montrent Zika plaques virales à 48 hpi. On notera la présence de foyers de cellules arrondies sur la monocouche. (Barre d' échelle = 50 pm) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

8. Récolte surnageants de culture cellulaire au point de temps de 96 heures et centrifuger le surnageant à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
9. Retirez délicatement le surnageant sans débris granulés inquiétant et transfert to tubes de 15 ml. Ultracentrifugation à 24000 xg peut être réalisée pour concentrer les particules virales (en option).
10. Stocker les surnageants de culture virale dans plusieurs aliquotes à -80 ° C.

3. Mesure Zika titre viral par la plaque de dosage

1. Seed cellules Vero naïfs à 1 x 10 ⁵ cellules par puits dans 2 ml de volume à l' aide d' une plaque de 12 puits.
2. Le lendemain, préparer 10 fois des dilutions en série de surnageants de culture virales collectées à partir des T-160 flacon en utilisant un milieu sans sérum. Retirez le support passé de chaque puits et ajouter 400 ul d'inoculum préparé sur cellules Vero en triple.
3. Incuber les flacons inoculés dans 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 4-6 heures. Etaler l'inoculum en inclinant légèrement la plaque latérale à chacune h.
4. A la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum avec les milieux de sérum supplémenté (2 ml par puits).
5. A 48 heures après l'inoculation, compter les foyers viraux en utilisant un Contr de phaseast microscope. Calculer le titre viral en unités formant des plaques (PFU) par ml. Voir la figure 3 pour le dosage de la plaque.
6. Fixer et colorer les cellules dans 4% de formaldéhyde et solution de cristal violet 0,1% préparé dans 20% d'éthanol pour la visualisation claire des plaques.

Essai 4. Zika génome viral réplication

1. Seed cellules Vero naïfs à 1 x 10 ⁵ cellules par puits dans 2 ml volumes à l' aide d' une plaque de 12 puits. Le lendemain, préparer inoculum viral (MOI de 0,01 et 0,1; 400 pl / puits) de titre faible et élevé en utilisant du milieu sans sérum en triple exemplaire. Pour une infection simulée, utiliser du sérum médias libres (400 pl / puits) seulement.
2. Répétez les étapes 3.2 à 3.4.
3. Aux points de temps 48 et 96 h, recueillir les échantillons pour l'ARN et immunocytochimie (ICC).
   1. Pour les échantillons d'ARN de récolte, retirez le support, puis ajouter 400 pi de solution de lyse directement à chaque puits et recueillir les lysats.
   2. Pour la CPI, retirez le support et then fixer les cellules en ajoutant 1 ml de methanol à chaque puits et incuber la plaque à 4 ° C pendant 30 min.
   3. À partir du lysat des cellules, d'isoler l'ARN total en utilisant un kit d'isolement d'ARN selon les instructions du fabricant. Quantifier l'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
4. Effectuer une à deux étapes de transcription inverse PCR quantitative (RT-qPCR) pour déterminer le contenu du génome de l'ARN récolté à partir ZIKV.
   1. Pour inverser transcrire l'ARN, d'abord mis en place un mélange de réaction de 13 ul constitué de 5 ug d'ARN isolé, 1 pl de dNTP (10 mM), et 1 hexamère ul aléatoire (250 ng) dans un tube de 0,2 ml. Incuber le tube à 65 ° C pendant 5 min, puis placez-le sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajouter 1 pi de transcriptase inverse, 4 ul de tampon de synthèse du brin 5x, 1 pi de dithiothréitol 0,1 M et 1 ul d'inhibiteur de RNase dans le mélange réactionnel. Incuber le tube pendant 5 minutes supplémentaires à 25 ° C, puis 60 minutes à 50 ° C et inactivate la réaction par chauffage à 70 ° C pendant 15 min.
   2. Effectuer qPCR utilisant 1 pl de l'ADNc résultant avec 12,5 pi de colorant vert 2x super-mélange contenant de l'ADN polymérase et 1 pl de 10 mM d'amorces individuelles spécifiques pour le virus Zika [Zika virus amorces pan-génotype (Pour: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), le virus Zika génotype asiatique amorces de déformation PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ou le virus de l'hépatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), ou du type cellulaire GAPDH du gène de ménage (pour: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') dans un volume réactionnel de 25 ul.
   3. Faire la PCR en utilisant la condition de fonctionnement 95 ° C pendant 15 secondes et 60 ° C pendant 30 secondes (40 cycles) dans un système de PCR en temps réel.
   4. Utiliser le niveau d'expression de la GAPDH en fonction de seuil de cycle (Ct) pour normaliser la valeur Zika mesure du génome viral. Calculer le delta Ct (ACt) valeur du génome Zika par rapport à celle de GAPDH et obtenir la valeur 2 ^ACt. Ensuite, calculer le facteur de changement en prenant le rapport du contenu normalisé du génome Zika entre les cellules infectées et non infectées à des points de temps indiqués. Voir Figure 4 pour les résultats de la réplication du génome de ZIKV.
5. Effectuer la CPI en utilisant les cellules de méthanol fixe.
   1. Laver les cellules fixées à trois reprises avec PBS 1x et bloquer avec la CPI tampon de blocage (sérum de chèvre à 3%, 3% de BSA, 0,1% de Triton-x 100 dans du PBS).
   2. Utiliser monoclonal de souris anti-anticorps ARNdb J2 (1 pg / ml) à une dilution de 1: 100 dans du tampon de blocage et on incube pendant une nuit à 4 ° C.
   3. Laver les cellules avec du PBS 1X et ajouter un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris-594 (1 pg / ml) à une dilution de 1: 1000 dans du tampon de blocage et on incube pendant une heure à température ambiante.
   4. Laver les cellules avec PBS 1x et tache pour les noyaux en utilisant le colorant Hoechst etobserver les cellules en utilisant un microscope à fluorescence à un grossissement de 100X (figure 4).

5. Dépistage Cytokine Library contre Zika Virus Infection

1. Graine cellules Vero naïfs à 1 x 10 ⁵ cellules par puits en utilisant une plaque de 12 puits. Une fois que les cellules sont fixées (6 heures après l'ensemencement), ajoutez chaque cytokine à des concentrations indiquées dans les doublons biologiques (2 ml de volume / puits). Inclure véhicule (PBS) seul contrôle.
2. À 12 h post-traitement, effectuer une infection virale Zika (MOI de 0,1 à 400 ul par puits). Inclure les puits témoins négatifs sans infection (mock).
3. A 4 heures post-infection, remplacer le inoculum viral avec les médias de cytokines traité (2 ml). Incuber les cellules à 37 ° C pendant 44 h supplémentaires.
4. A 48 heures post-infection, compter plaques virales à l' aide d' un microscope à contraste de phase et d' acquérir des images représentatives de cellules infectées à un grossissement de 40X (Figure 5).

Résultats

Une souche virale Zika (PRVABC59; numéro d'accession GenBank KU501215) du génotype asiatique a été utilisé dans cette étude ^12. Cellules Vero à 80% de confluence ont été utilisés pour étudier de novo Zika infection virale. Pour la production virale et la caractérisation virologique ultérieure, un passage précoce virus (P3) Zika a été employé. Les plaques virales ont été observées sur le deuxième jour d'infection. Descendances viraux Zika l...

Discussion

Ici, un protocole simplifié pour la culture de virus Zika in vitro est présenté. Les étapes critiques notamment, l'identification des points d'extrémité optimales pour l'expansion de la culture du virus, la mesure de titre, et la quantification de la réplication du génome ont été fournies. virus Zika est un agent pathogène humain, de sorte que, lors de la manipulation d'agents infectieux, les procédures de biosécurité doivent être strictement suivies. Une lignée de cellules de re...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
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