Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

Résumé

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Résumé

De nombreuses applications biomédicales importantes, telles que l'imagerie cellulaire et la manipulation à distance, peuvent être obtenues par marquage des cellules avec des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIONs). La réalisation de l'absorption cellulaire suffisante de SPIONs est un défi qui a traditionnellement été rencontré par l'exposition des cellules à des concentrations élevées de SPIONs ou en prolongeant le temps d'exposition (jusqu'à 72 h). Cependant, ces stratégies sont susceptibles de servir de médiateur toxicité. Ici, nous présentons la synthèse du SPION magnetoferritin à base de protéines, ainsi qu'un protocole de fonctionnalisation de surface facile qui permet la magnétisation rapide des cellules en utilisant des concentrations faibles d'exposition. Le noyau de SPION de magnetoferritin est constitué de cobalt dopé d'oxyde de fer ayant un diamètre moyen de particules de 8,2 nm minéralisé à l'intérieur de la cavité de rate de cheval apo- ferritine. cationisation produit chimique de magnetoferritin un roman, SPION fortement à la membrane active qui magnétise les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) en utilisant des temps d'incubation commecourt que les concentrations d'une minute et de fer comme bas que 0,2 mM.

Introduction

liaison à la surface ou l'internalisation des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIONs) a permis l'aimantation d'une variété de types cellulaires pour des applications telles que l'imagerie et la manipulation à distance. ¹ Toutefois, la réalisation de l' aimantation cellulaire suffisante peut être un défi, en particulier lorsque l'interaction entre le SPION et la surface des cellules est faible. ² Dans les concentrations passées, l' exposition prolongée ou haute Spion ont été utilisés comme des stratégies pour surmonter ce défi. ^3,4 Néanmoins, ces stratégies sont problématiques car ils augmentent la toxicité ^5,6 et ont un succès très limité dans des types cellulaires avec des taux d'internalisation faibles, tels que les lymphocytes. ⁷ Afin d' améliorer l' absorption cellulaire de SPIONs, les approches de plusieurs fonctionnalisation de surface ont été explorées. Par exemple, les anticorps ont été utilisés pour favoriser l' endocytose médiée par le récepteur ⁸ , tandis que l' absorption non spécifique peut être obtenue en utilisant une transfectiongents ^9,10 ou des espèces de pénétration cellulaire, telles que le VIH tat-peptide. ^11,12 Cependant, les approches d'anticorps et le peptide fonctionnalisation sont limitées par des réactifs coûteux et complexe préparation synthétique, tandis que les agents de transfection peuvent induire la précipitation des nanoparticules et affecter négativement la fonction cellulaire. ^13,14

Nous avons récemment rapporté la synthèse de magnetoferritin cationisé chimiquement, un roman SPION qui était très efficace dans les cellules de magnétisation souches mésenchymateuses humaines (CSMh) en utilisant des temps d'incubation aussi courtes qu'une minute. ¹⁵ Magnetoferritin est synthétisé en reconstituant une SPION intérieur de la cavité déminéralisé de la protéine de stockage du fer de la ferritine. ¹⁶ Cette SPION à base de protéines combine de nombreuses propriétés qui le rendent bien adapté pour la magnétisation de la cellule, tels que le contrôle des propriétés magnétiques du noyau magnétique, ^17-19 et la biocompatibilité et la solubilité aqueuse conférés par l'enveloppe protéique. Plus loinplus, fonctionnalisation de surface est facile à réaliser en raison des acides aminés adressables qui peuvent être chimiquement ^20-22 ou génétiquement modifiés. ^23-25 Nous avons montré que la cationisation chimique des résidus d'acides aminés acides de la protéine d'enveloppe génère une nanoparticule stable qui interagit avec les domaines facilement anioniques sur la surface cellulaire , conduisant à une aimantation cellulaire rapide et persistante. Cette procédure élimine le besoin de fonctionnalisation laborieux et des protocoles d'incubation longs, et en raison du mécanisme de marquage non spécifique de cette stratégie de magnétisation rapide devrait trouver une application très répandue dans d'autres types de cellules. Ici, nous présentons un rapport en profondeur de la méthode de marquage cellulaire ultra-rapide, y compris les protocoles détaillés de la synthèse, la purification et la surface fonctionnalisation de magnetoferritin cationisé.

Protocole

les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) ont été récoltées à partir du fémur proximal de la moelle osseuse des patients arthrosiques subissant une chirurgie de remplacement total de la hanche, en pleine conformité avec les lignes directrices du Comité d'éthique Bristol Southmead Hospital Research (référence # 078/01) et après le consentement du patient a été obtenu.

1. Magnetoferritin Synthèse et purification

1. Remarques générales
   1. Effectuer la synthèse de magnetoferritin dans un réacteur à double enveloppe pouvant être scellé à 65 ° C sous atmosphère d'azote pour limiter l'oxydation des précurseurs métalliques. Injecter des solutions de sel métallique et de peroxyde d'hydrogène à travers des orifices d'accès dans le couvercle dans la cuve de réaction en utilisant une pompe à seringue.
   2. Après la synthèse de magnetoferritin, purifier la protéine par chromatographie échangeuse d'anions (voir section 1.4) pour éliminer les nanoparticules non enfermées dans la cavité de la protéine, suivie par chromatographie d'exclusion (voir section 1.5) pour isoler des monomères de protéines. deconcentration en protéines de Termine en utilisant un dosage de Bradford (voir section 1.6).
2. Préparations avant la synthèse
   1. Désoxygéner 500 ml d'eau déminéralisée en plaçant un tube relié à une bouteille de gaz d'azote dans l'eau, l'étanchéité du récipient avec une pellicule de plastique et barbotage d'azote gazeux pendant environ 60 min.
   2. Chauffer un bain d'eau relié à la cuve de réaction à double paroi à 65 ° C. Ajouter 75 ml de 50 mM d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 8,6) dans le récipient de réaction, sceller le récipient, et désoxygéner en faisant barboter de l'azote gazeux à travers la solution tampon pendant environ 20 min. Dans le même temps, agiter la solution tampon à l'aide d'un agitateur magnétique.
   3. Après désoxygénation de la solution tampon HEPES, retirer le tube d'alimentation du gaz d'azote à partir du tampon et à le maintenir en suspension dans le récipient pour maintenir une atmosphère d'azote. Apo- ferritine ajouter pour obtenir une concentration finale de 3 mg / ml. Poursuivre l'agitation magnétique, mais réduire la vitesse d'agitation si le moussage se produit.
   4. Préparer une solution 25 mM du stock de sulfate de cobalt heptahydraté en dissolvant 0,19 g dans 50 ml d'eau désionisée désoxygénée.
   5. Préparer une solution 25 mM d'une solution de sulfate de fer hexahydraté d'ammonium par dissolution de 0,98 g dans 100 ml d'eau déminéralisée désoxygéné.
   6. Retirer 2,5 ml de la solution de sulfate de fer hexahydraté d'ammonium et le remplacer par 2,5 ml du heptahydrate de sulfate de cobalt.
   7. Préparer une solution 8,33 mM de peroxyde d'hydrogène dans de l'eau déminéralisée désoxygéné en ajoutant d'abord 965 pi d'une solution de peroxyde d'hydrogène (30% p / p) à 9 ml d'eau déminéralisée désoxygéné, puis en ajoutant 1 ml de cette sous-stock à 99 ml d'eau désionisée désoxygénée.
3. synthèse Magnetoferritin
   1. Injecter 10,1 ml à la fois le précurseur de fer-cobalt et le peroxyde d'hydrogène en même temps dans la solution apo-ferritine (s magnétiquementtirred) à un débit de 0,15 ml / min en utilisant deux pompes à seringue de débit (volume total injecté: 20.2 ml).
   2. Pendant la période d'injection, désoxygéner encore 500 ml d'eau déminéralisée.
      NOTE: Le contenu de la cuve de réaction adoptent progressivement une couleur brun foncé que le produit de réaction.
   3. Peu de temps avant la fin de la première injection, préparer un autre précurseur 100 ml de fer-cobalt et une solution de peroxyde d'hydrogène en utilisant de l'eau déminéralisée fraîche désoxygénée.
   4. Répéter l'étape d'injection décrit dans 1.3.1 en utilisant des solutions fraîchement préparées de fer-cobalt et de peroxyde d'hydrogène.
   5. Au cours de la période d'injection, désoxygéner encore 500 ml d'eau déminéralisée, et procéder comme décrit dans 1.3.3 et 1.3.4.
   6. Après la troisième injection, laisser la solution à mûrir pendant 15 min sous agitation.
   7. Ajouter 1,5 ml d'une solution de citrate de sodium 1 M dans le récipient de réaction pour chélater des ions métalliques libres en solution.
   8. On élimine la solution de la réactionrécipient dans 50 ml tubes de centrifugeuse, centrifugeuse pendant 30 minutes à 4350 xg et passer le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,22 um. A ce stade, on filtre le surnageant peut être conservé à 4 ° C jusqu'à la purification.
4. Chromatographie par échange d' ions
   1. Charger l'échantillon sur une colonne (2,5 cm de diamètre, 20 cm de longueur) contenant une matrice cationique en utilisant une pompe péristaltique à un débit de 10 ml / min.
   2. Laver la colonne avec environ 100 ml de tampon (50 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris), tampon pH 8,0) fonctionnant à l'aide d'une pompe à gradient à un débit de 10 ml / min.
   3. Pour éluer la protéine, laver la colonne à 10 ml / min avec des concentrations croissantes de chlorure de sodium (NaCl) dans du tampon Tris: 150, 500 et 1000 mM, la concentration finale de NaCl, 150 ml de chaque concentration.
   4. Que la protéine est éluée à une concentration de 500 mM de NaCl, de recueillir dans les fractions de 50 ml en utilisant un collecteur de fractions automatique.
      NOTE: Pour uneprotocole détaillé de la chromatographie par échange d'ions consulter les protocoles précédemment publiés. ²⁶
5. Chromatographie d'exclusion de taille
   1. On concentre les 150 ml de magnetoferritin à un volume d'environ 2 ml en utilisant une unité de filtre centrifuge de 15 ml suivie d'une unité de volume de 4 ml. Reportez-vous aux instructions du fabricant des unités de filtre centrifuge (voir la liste des matériaux) pour un protocole détaillé de cette procédure.
   2. Charger l'échantillon concentré sur une colonne de filtration sur gel en utilisant une boucle d'injection.
   3. Laver la colonne avec du tampon d'essai (tampon Tris 50 mM, pH 8,0, contenant 150 mM de NaCl) à un débit de 1,3 ml / min.
   4. Collecter fractions de 6 ml en utilisant un collecteur de fractions automatisé. monomères de protéines éluent dernier. À ce stade, magnetoferritin purifié peut être conservé à 4 ° C jusqu'à cationisation.
      NOTE: Pour un protocole détaillé de chromatographie d'exclusion de taille en utilisant une colonne de filtration sur gel consulter previoisa nt publié des protocoles. ²⁷
6. La détermination de la concentration en protéines
   1. Préparer des normes de ferritine de 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 et 1 mg / ml dans du tampon Tris 50 mM, disponible dans le commerce à l'aide de la ferritine de rate de cheval.
      NOTE: La concentration de protéine disponible dans le commerce ferritine est indiqué sur la bouteille. Sinon, contacter le fournisseur pour obtenir cette information.
   2. Diluer les échantillons de magnetoferritin de concentration inconnue dans un tampon Tris 50 mM jusqu'à ce que la couleur de la solution correspond approximativement à la couleur de 0,5 mg / ml standards. Notez le facteur de dilution.
   3. Ajouter 10 pi de chaque échantillon standard et magnetoferritin en triple dans les puits d'une plaque à 96 puits.
   4. Ajouter 200 pi de réactif de Bradford ready-made à chaque puits (voir la liste des matériaux pour Bradford détails de réactifs de dosage).
   5. Incuber à température ambiante pendant 8 minutes.
   6. Mesurer l'absorbance à λ = 595 nm en utilisantun lecteur de microplaques.
   7. Tracer l'absorbance moyenne des normes ferritine en fonction de la concentration en protéines et utiliser la pente et l'interception de l'ajustement linéaire pour calculer la concentration de l'échantillon de magnetoferritin.
      NOTE: Prendre en compte le facteur de dilution qui a été utilisé pour ajuster l'échantillon de magnetoferritin à la courbe standard.

2. Magnetoferritin Cationisation

1. Remarques générales
   NOTE: Pour magnetoferritin cationisation, N, N -diméthyl-1,3-propanediamine (DMPA) a été couplé à des résidus d'acide aspartique et glutamique sur la surface MF utilisant le N - (3-diméthylaminopropyl) - chlorhydrate -ethylcarbodiimide N '(EDC).
   1. Effectuer la réaction à la température ambiante sous agitation. Le protocole donné ci - dessous pour la cationisation de 10 mg de magnetoferritin dans un volume total de 5 ml (concentration en protéines de 2 mg / ml). Cependant, l'échelle vers le haut ou vers le basen maintenant la protéine DMPA: rapports EDC cohérente, ainsi que les volumes de la solution tampon et magnetoferritin.
   2. Avant la réaction de cationisation, on dialyse les échantillons de magnetoferritin dans 50 mM de tampon phosphate (pH 7) contenant 50 mM de NaCl. Ceci est important pour éliminer le tampon d'élution de Tris et d'éviter des réactions indésirables entre l'aminé tris et les résidus d'acides carboxyliques activés par EDC. Déterminer la concentration en protéine après la dialyse et l'ajuster à 4 mg / ml, avant de cationisation.
2. Protocole de cationisation
   1. Peser 374 mg de DMPA et dissoudre dans 2,5 ml de 200 mM 2- (N - morpholino) éthanesulfonique (MES) tampon.
   2. Ajuster le pH de la solution à environ 7 en utilisant de concentré (6 M) d'acide chlorhydrique (HCl).
      ATTENTION: Effectuez cette étape dans une hotte, que l' addition de l'acide à DMPA libère des fumées toxiques!
   3. Ajouter 2,5 ml d'une solution magnetoferritin à 4 mg / ml (tration finaletration de MES 100 mM, concentration finale de magnetoferritin est de 2 mg / ml, la quantité totale de protéines est de 10 mg).
   4. Ajouter un agitateur magnétique et agiter pendant 2 heures à équilibrer.
   5. Ajustez soigneusement la solution à un pH de 5,0 en utilisant HCl 1 M.
   6. Ajouter 141 mg de poudre EDC à la solution DMPA / magnetoferritin.
   7. Poursuivre l'agitation pendant 3,5 heures.
   8. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 um pour éliminer tous précipités.
   9. Ajouter la solution à un tube de dialyse avec 12 à 14 kDa de poids moléculaire de coupure et on dialyse contre 4 litres de tampon 50 mM de phosphate (pH 7) contenant 50 mM de NaCl pendant 2 jours à 4 ° C, en remplaçant le tampon de dialyse au moins trois fois au cours de cette période.
      NOTE: A ce stade, magnetoferritin cationisée peut être conservé à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

3. mésenchymateuses Human Stem Cell marquage avec cationisé Magnetoferritin

1. Remarques générales
   1. Effectuer toute la culture cellulaire à l'aide de la classe II hottes à flux laminaire et les incubateurs humidifiés à 37 ° C et 5% atmosphère de dioxyde de carbone.
   2. Les cellules de culture comme monocouches en utilisant 175 cm ² flacons et 20 ml de milieu de culture, qui a été renouvelé tous les 3 - 4 jours. Le milieu de culture consistait en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 1,000 mg / L de glucose, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin, 1% (v / v) d'une solution de pénicilline / streptomycine, 1% (v / v) L alanyl-L-glutamine et une solution à 5 ng / ml fraîchement additionné de facteur de croissance de fibroblaste humain.
2. Étiquetage magnétique de CSMh avec magnetoferritin cationisée
   1. Seed 150.000 CSMh dans 25 cm ² flacons et laisser adhérer pendant une nuit à 37 ° C.
   2. Stériliser par filtration à travers un magnetoferritin cationisée filtre de 0,22 um de seringue et déterminer la concentration en protéines.
   3. Maintien des conditions stériles, préparer une solution à 0,5 uM de magnetoferri cationiséel'étain dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Garder couvert dans une hotte de culture stérile jusqu'à utilisation.
   4. On lave les cellules ensemencées avec 2 ml de PBS température ambiante.
   5. Ajouter 1 ml de la solution de stérilisation magnetoferritin cationisé aux cellules étalées et incuber pendant la période de temps désirée (1 min à 1 h).
   6. Laver les cellules avec du PBS, et les cellules, puis la récolte en ajoutant 0,5 ml d'acide trypsine / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incubation à 37 ° C pendant 5 min.
   7. Ajouter 1 ml de milieu de culture pour inactiver la trypsine / EDTA, transférer la solution dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 524 x g.
   8. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml de tampon de séparation magnétique, constitué de 0,5% (p / v) de sérum bovin foetal et 2 mM d'EDTA dans du PBS.
3. Séparation magnétique de cellules
   1. Fixez l'aimant sur le support multi, et ajouter une colonne de séparation magnétique à l'aimant. Placer un filtre de pré-séparation sur the colonne.
   2. Placer 0,5 ml de tampon de séparation magnétique dans le filtre de pré-séparation et le laisser courir à travers le filtre et la colonne de se laver et de les mouiller.
   3. Placer un tube de centrifugation de 15 ml dans la colonne.
   4. Ajouter 0,5 ml de la suspension cellulaire dans le réservoir de filtration de la colonne de séparation magnétique.
   5. Lorsque le réservoir est vide, ajouter 0,5 ml de tampon de séparation magnétique.
   6. Lorsque le réservoir est vide, ajouter encore 0,5 ml de tampon de séparation magnétique.
   7. Répéter une fois de plus (le volume total de tampon de séparation magnétique utilisée pour le lavage doit être de 1,5 ml). Cette étape de lavage est élué toutes les cellules non magnétisées de la colonne (fraction de cellules non aimantée).
   8. Retirer la colonne de l'aimant et le placer dans un tube de 15 ml frais de centrifugeuse. Retirer le filtre du réservoir de la colonne.
   9. Ajouter 1 ml de tampon de séparation magnétique au réservoir et pousser immédiatement à travers la colonne à l'aide du piston fourni par le fabricantr. Ce élué les cellules magnétisées de la colonne dans le tube de centrifugation (fraction cellulaire aimantée).
   10. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 524 x g.
   11. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles de cellules dans 0,3 ml de PBS.
   12. Compter le nombre de numéros de cellules dans chaque fraction en utilisant un hémocytomètre.
   13. Déterminer la fraction de cellules magnétisées, M (%), en utilisant l'équation suivante:
       
       où n (M) est le nombre de cellules dans la fraction aimantée et n (M + NM) est la somme du nombre de cellules dans les fractions aimantées et non magnétisées.
4. Préparation de CSMh marqués avec magnetoferritin cationisé pour la quantification de fer en utilisant la spectroscopie d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES)
   NOTE: Le protocole peut devoir être adapté pour d'autres instruments ICP-OES. Il est conseillé de consulter le retechnicien responsable.
   1. Centrifuger un nombre connu de cellules pendant 5 min à 524 x g.
   2. Retirer le surnageant du PBS et on ajoute 0,25 ml de 50% (v / v) d'acide nitrique.
   3. Tourbillonnaire mélanger la suspension de cellules acidifiées.
   4. Incuber à température ambiante pendant une nuit.
   5. Ajouter 4,75 ml d'eau distillée à chaque échantillon et vortexer mélange.
   6. Analyser avec ICP-OES. ²⁸
   7. Normaliser la teneur en fer mesuré le nombre de cellules pour déterminer une valeur pour la teneur en fer cellulaire.

Résultats

TEM a été utilisé pour confirmer la minéralisation des nanoparticules à l' intérieur de la cavité de l' apoferritine et déterminer la taille moyenne du noyau (figures 1A et 1B). L'analyse d'image des échantillons non colorés magnetoferritin a un diamètre de noyau moyen de 8,2 ± 0,7 nm, tache aurothioglucose ont confirmé la présence des nanoparticules dans la cage de la protéine. Notez que les images montrent un échantillon de magnetoferritin qui a été purifié davantage en utilisant la séparation magnétique pour isoler les noyaux de nanoparticules uniformes. échantillons Magnetoferritin qui ne sont pas magnétiquement purifiés ont une distribution légèrement plus large de la taille du noyau. ²⁹ L' analyse de la structure du noyau de magnetoferritin par diffraction d'électrons région sélectionnée indique la présence possible de la structure de spinelle inverse sur la base de la magnétite (Fe ₃ O ₄₎ et / ou la maghémite (γ-Fe ₂ O _3), ainsi que la structure spinelle en raison de Co ₃ O _4. En outre, les spectres de Raman ont révélé des pics attribués à Fe ₃ O _4, de petites quantités de γ-Fe ₂ O _3, et un ferrite de cobalt (figure 1 C). analyse ICP-OES de magnetoferritin a montré une moyenne de 102 pg de fer et 0,9 pg de cobalt par milligramme de magnetoferritin.

Un schéma est inclus, ce qui illustre l'étape ultérieure de cationisation (figure 2 A). Le diamètre hydrodynamique des magnetoferritin et magnetoferritin cationisée était de 11,8 ± 1,1 nm et 12,5 ± 1,4 nm, respectivement, tel que déterminé par diffusion de lumière dynamique. L'efficacité de cationisation de couplage covalent DMPA à magnetoferritin a été évaluée par potentiométrie zêta laser et ionisation par désorption à temps de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse assistée par matrice. Le potentiel zêta change de -10,5 mV pour MF à +8,3 mV pour magnetoferritin cationisée, confirmantmodification du potentiel de surface du négatif au positif (Tableau 1). Expériences de spectrométrie de masse ont trouvé un poids moléculaire de sous - unité de 20,1 kDa pour natif apo-ferritine et 21,1 kDa pour cationisé apo-ferritine (Figure 2 B). Cette augmentation de la masse correspond à environ 12 molécules couplées de DMPA par sous-unité de la protéine, ainsi que la cationisation de 288 résidus sur la totalité de la protéine 24 sous-unités.

saturation magnétique et la sensibilité ont été mesurées en utilisant magnétométrie SQUID et transversal et longitudinal relaxivité ont été mesurées en utilisant l'imagerie par résonance magnétique. Les propriétés magnétiques étaient semblables pour magnetoferritin et magnetoferritin cationisé, indiquant que cationisation a eu un impact négligeable sur les propriétés magnétiques de l'SPION clos (tableau 1). En outre, ces propriétés sont similaires à d' autres nanoparticules à base d' oxyde de fer, ^19,30 démontrant que cationisée magnetoferritin serait aussi approprié comme agents de contraste IRM à base spion conventionnelles dans l'amélioration de contraste d'imagerie.

Après une exposition de 30 minutes, la surface cellulaire est densément couverte de magnetoferritin cationisée (Figure 3 A). Cependant, après une semaine, aucune des nanoparticules ont été trouvés sur la surface cellulaire (figure 3 B). magnetoferritin cationisée a été remarquablement efficace à CSMh magnétiquement étiquetage. Notamment, l'exposition des cellules à magnetoferritin cationisé pendant une minute a donné lieu à l'aimantation de 92% de la population cellulaire et la fourniture de 3,6 pg de fer par cellule. L' augmentation de la durée d'incubation de 15 minutes donné lieu à l'aimantation de la population totale de cellules (figure 3 C).

Figure 1: Caractérisation des magnetof noyaux de erritin dopés avec 5% de cobalt. Images TEM de magnetoferritin colorées avec aurothioglucose (A) et souillures (B). Encart montre la diffraction d'électrons correspondant aux indices de magnétite. Barre d'échelle: 20 nm. (C) Raman spectre pour magnetoferritin. Les flèches indiquent les principaux modes de vibration Raman pour la ferrite de cobalt (T _{2 g),} de la magnétite et de maghémite ( à la fois A _{1 g).} ^31,32 La longueur d' onde du laser utilisé était de 532 nm. (Image adapté de Okuda et al. ^18). Notez que cet exemple de magnetoferritin avait été davantage purifié par séparation magnétique, qui isole les particules de magnetoferritin uniformément chargées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

785fig2.jpg "/>
Figure 2: Cationisation de magnetoferritin. A) accessible au solvant des représentations de surface montrant la répartition des acides (rouge) et jaune) les résidus d'acides aminés basiques (la surface de la protéine. Magnetoferritin (1) est modifié pour magnetoferritin cationisée (2) par réticulation induite par carbodiimide du DMPA aux résidus d'acides aminés acides sur la surface de la protéine (3). B) L' analyse par spectrométrie de masse des sous - unités apo-ferritine apo-ferritine et cationisé. Mass-charge (m / z) Spectre de apoferritine (ApoF) et apoferritine cationisée (cat-ApoF) généré par MALDI-TOF. Une augmentation de la masse de 20,1 kDa à 21,1 kDa est observée après cationisation. (Image adapté de Correia Carreira et al. ¹⁵⁾ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: étiquetage magnétique et la séparation des cellules de CSMh incubées avec magnetoferritin cationisée. A) image TEM de CSMh après une incubation de 30 minutes avec magnetoferritin cationisé. La flèche indique la présence de noyaux de magnetoferritin denses sur la surface cellulaire. Barres d'échelle: 200 nm. B) image TEM de CSMh une semaine après l' étiquetage. La surface cellulaire est clairement magnetoferritin cationisé. C) Etude de la rapidité de marquage magnétique: 92% de la population de cellules ont été magnétisé après une exposition d' une minute avec 0,5 uM magnetoferritin cationisés, et l' ensemble de la population de cellules a été magnétisé dans les 15 minutes. La teneur en fer par cellule a été déterminée à l'aide ICP-OES. moyenne et écart type de trois répétitions biologiques sont présentées. (Image adapté de Correia Carreira et al. ¹5) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

	MF	cat-MF
Diamètre hydrodynamique [nm]	11,8 ± 1,1	12,5 ± 1,4
Zeta potentiel [mv]	(-) 10,4 ± 0,2	8,3 ± 0,7
Instant de saturation magnétique [Am 2 kg -1]	54,9 ± 1,6	55,3 ± 1,4
Mass sensibilité [x 10 4 m 3 kg -1]	1,75 ± 0,08	1,75 ± 0,07
Relaxivité longitudinale [mM de la sec -1]	2,6 ± 0,1	2,3 ± 0,1
Relaxivité Transverse [mM de la sec -1]	44,6 ± 1,0	52,8 ± 0,8

Tableau 1: Caractérisation physico - chimique des magnetoferritin (MF) et magnetoferritin cationisée (cat-MF). (Tableau adapté de Correia Carreira et al. ¹⁵⁾

Discussion

MET d'échantillons colorés avec magnetoferritin aurothioglucose a révélé la minéralisation réussie des nanoparticules à l'intérieur de la cage de la protéine. diffraction des électrons et de l'analyse Raman du noyau de la nanoparticule a indiqué la présence d'une ferrite de cobalt, ce qui indique la réussite de dopage du coeur de la nanoparticule avec le cobalt. Ceci démontre que les nanoparticules d'oxyde mixte peuvent être minéralisé avec succès dans la cavité de l'apo-ferritine. En outre, nous avons montré précédemment que le dopage de cobalt peut être modifiée en modifiant la quantité de précurseur de cobalt ajouté au mélange réactionnel, ce qui permet le réglage des propriétés magnétiques. ¹⁸

Synthèse Magnetoferritin peut être effectuée dans une variété de vaisseaux, aussi longtemps qu'ils sont étroitement refermable et avoir des ports d'accès par lequel réactifs peuvent être introduits (par exemple, un à trois cols de ballon à fond rond). La température de réaction doit être maintenue à 65 ° C, soit en plaçant le récipient dansa / bain d'huile de l'eau ou à l'aide d'un navire à double enveloppe. Ici, nous avons utilisé une configuration à double enveloppe cellule électrochimique pour effectuer la synthèse. Pour garantir la synthèse réussie, en maintenant le pH correct et d'éviter la contamination de l'oxygène de la solution aqueuse est primordiale. les solutions de sels métalliques doivent toujours être préparés fraîchement avant leur utilisation plutôt que d'avance. En outre, les solutions de apoferritine commerciales peuvent varier en qualité et affecter la synthèse des résultats (par exemple., La taille des nanoparticules noyau minéralisée). Il peut aider à dialyser la solution de apoferritine dans un tampon HEPES 50 mM (pH 8,6) avant la synthèse pour éliminer tout agent réducteur résiduel utilisé par le fabricant. Il est utile de prendre note du nombre de la solution apo-ferritine utilisée pour la synthèse par lots, il peut donc être expressément demandé par le fabricant devrait plus besoin de matériel à acheter. En outre, la concentration de protéine disponible dans le commerce apo-ferritine doit être indiqué sur la bouteille, qui peutêtre utilisé pour calculer le volume de solution apo-ferritine nécessaires pour la synthèse. Si cela est le cas, contactez le fournisseur pour obtenir cette information.

L'avantage de l' addition graduelle des sels métalliques et le peroxyde d'hydrogène - tel que présenté ici et dans les rapports précédents - que la minéralisation du noyau de la nanoparticule peut être commandé de telle sorte que les différents facteurs de charge ( par exemple, la taille des nanoparticules) peuvent être obtenus. ³³ En outre, il est possible de purifier davantage magnetoferritin en utilisant une colonne de séparation magnétique, par exemple une colonne garnie de poudre d'acier inoxydable fixé à l' intérieur d' un électro - aimant. ³⁴ Ainsi, les noyaux de nanoparticules hautement monodispersées peut être isolé de l'échantillon de magnetoferritin en vrac. Cependant, pour le marquage cellulaire magnétique présenté ici ne l'exige pas. Une limitation de la synthèse de magnetoferritin est relativement faible rendement de synthèse d'environ 10%, et le coût relativement élevé du commerce apo-fésolutions rritin. Cependant, apo-ferritine peut également être préparé à partir disponible à bon marché de la rate de cheval ferritine en suivant les protocoles de-minéralisation établies. ¹⁶

Cationisation de magnetoferritin a été obtenue en ajoutant un rapport molaire de 250 molécules de DMPA et de 50 molécules d'EDC par résidu chargé négativement (calculs basés sur la séquence d'acides aminés de la rate de cheval ferritine). Cet excès de réactif sur la protéine conduit à des rendements de cationisation élevés, comparables aussi précédemment rapporté des résultats pour la cationisation de la ferritine. ³⁵ Pour l' analyse MALDI-TOF, et apoferritine apoferritine cationisé ont été utilisés en raison de la masse moléculaire en excès du noyau de magnetoferritin. Pour obtenir des rendements élevés de cationisation, pH optimal est également crucial. réticulation EDC médiation est le plus efficace dans des conditions légèrement acides, et nous avons trouvé que le pH 5 a donné des résultats de cationisation optimaux pour magnetoferritin. Cependant, pour d'autres protéines cationization pH peut avoir besoin d'être optimisé. Cationisation à ou près du point isoélectrique de la protéine doit être évitée, car cela peut conduire à des fortes précipitations.

Stem aimantation cellulaire avec magnetoferritin cationisée était très efficace et pourrait être réalisé en utilisant des temps d'incubation nettement inférieure à 30 minutes. Même une incubation d'une minute a donné lieu à une teneur en fer de 3,6 pg cellulaire, ce qui est rapporté dans la plage requise pour influencer T2 et T2 * contraste pour l'IRM. ^36,37 Il est également remarquable que ce marquage efficace est obtenue avec les concentrations de fer extracellulaire faible. Par exemple, des études antérieures utilisant des nanoparticules anioniques signalent des niveaux de fer de 10 pg par cellule après une période d'incubation de 30 minutes avec du fer 5 mM. ³⁸ A titre de comparaison, l' incubation avec une solution contenant 0,5 magnetoferritin cationisé uM de protéine correspond à une incubation à environ 0,2 mM , du fer et des rendements également approximativement 10 pg de fer par cell au bout de 30 minutes. Nous ne sommes pas en mesure d'identifier clairement les vésicules d'endocytose utilisant TEM. Toutefois, des études antérieures utilisant la ferritine cationisée constaté que l'intériorisation a eu lieu dans les dix premières minutes d'exposition. ^39,40 ferritine cationisée pourrait être localisé dans des vésicules enrobées, indiquant endocytose clathrine ou cavéoline-dépendante. Ces mêmes études ont également indiqué que, après 30 minutes d'incubation, la ferritine cationisée était encore présent à la surface des cellules, ainsi que dans les corps multivésiculaires, ressemblant à des lysosomes.

D' autres applications peuvent inclure des cages de cationisation apo-ferritine chargées avec d' autres nanoparticules et / ou des molécules fonctionnelles telles que des médicaments anticancéreux ⁴¹ ou ⁴² points quantiques. Cationisation de ces constructions ferritine pourrait se traduire par une livraison plus rapide et plus efficace de leur cargaison aux cellules.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	BPE310-1	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen	Sigma Aldrich	A3641	we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	C6768	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate	Sigma Aldrich	F1543	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%)	Sigma Aldrich	216763	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate	Sigma Aldrich	S1804	powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron	Merck Millipore	SLGP033RS	syringe filter
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434	poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units	Merck Millipore	4310	Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis	Merck Millipore	UFC801024	Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare	17-1287-04	we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17-1196-01	this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system	GE Healthcare	28406264
sample pump P-960	GE Healthcare	18-6727-00	load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00
Bradford assay reagent	Sigma Aldrich	B6916	solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen	Sigma Aldrich	F4503	prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)	Sigma Aldrich	308110	CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma Aldrich	E6383	keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	AppliChem	A0689,0500	powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane	Sigma Aldrich	D9652	soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose	Sigma Aldrich	D5546	warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F7524	add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution	Sigma Aldrich	P0781	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution	Gibco	35050-087	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor	PeproTech	100-18B	add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537	sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution	Sigma Aldrich	E5134	keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134	powder; make a 2 mM solution in PBS
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7030	add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for attachment of MACS magnet
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102	can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407	30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66%	Sigma Aldrich	7006
Titrando 907, syringe pump	Metrohm	2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5	Molecular Devices		Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX	JEOL		Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer	Renishaw		Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser	Laser Quantum		Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme	Applied Biosystems		Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS	Malvern Instruments		Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System	Quantum Design		Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra	Siemens		Used to determine longitudinal and transverse relaxivity
Tecnai 12 BioTwin Spirit	FEI		Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES	Agilent		Used to determine iron content in cells