SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de protéomique quantitative en utilisant la technique de marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) pour analyser les effets du VIH-1 infection sur protéomes exosomales hôte. Ce protocole peut être facilement adapté à des cellules sous différentes contraintes ou infection conditions.

Résumé

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introduction

De nombreuses maladies humaines, y compris les infections virales, sont souvent associés à des processus cellulaires distincts qui ont lieu dans et autour des cellules affectées. Les protéines, agissant souvent comme les effecteurs cellulaires ultimes, la médiation de ces processus. L'analyse des protéines peuvent souvent fournir des informations précieuses à l'environnement local des cellules affectées et nous aider à comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la maladie. Parmi les différentes techniques d'analyse des protéines, la protéomique tient particulièrement grande promesse. Comme un outil puissant, à grande échelle, la protéomique peut fournir une compréhension systémique des processus cellulaires, en particulier dans le domaine de la fonction et l'interaction des protéines. L'analyse des protéines spécifiques est simplifiée grâce au développement des techniques de marquage, qui permettent aux chercheurs de surveiller l'expression de composants cellulaires, en particulier des protéines, dans le site de l'enquête. Bien que de nombreuses analyses protéomiques ont été réalisées au cellulaireéchelle de protéome, caractérisations protéomiques sur des compartiments subcellulaires se sont révélés être particulièrement instructifs ^1. Ceci est bien illustré dans les études de HIV-1 infection.

Exosomes, 30-100 vésicules membranaires nm sécrétées par une large gamme de types de cellules ^{2, 3,} sont des composantes essentielles de la communication intercellulaire et de transport moléculaire. Ils ont déjà été découverts à jouer un rôle important dans le processus du VIH-1 en herbe ^{4, 5.} En combinant l' analyse protéomique dissection fonctionnelle, nous avons constaté que les exosomes libérés par le VIH-1 des cellules infectées sont constitués d'une molécule de régulation unique et quantitativement différentes signatures de protéines et de ports qui ont un impact propriétés cellulaires sur des cellules réceptives, y compris l' apoptose et la prolifération cellulaire ⁶ voisine. Les méthodes sont décrites dans ce protocole,à savoir SILAC (de marquage isotopique stable par les acides aminés dans une culture cellulaire) ⁷ caractérisation protéomiques à base d'exosomes à partir du VIH-1 des cellules infectées. Des approches similaires peuvent être appliquées à mieux comprendre les autres compartiments intracellulaires pendant la pathogenèse en ajustant le stress expérimental au compartiment ou une fraction d'intérêt spécifique et apporter les changements nécessaires aux procédures décrites.

Compte tenu de l'évolution récente des méthodes protéomiques quantitatives, il y a beaucoup de choix lors de la sélection de la méthode la plus efficace pour une expérience particulière. Parmi ceux - ci sont la iTRAQ base chimique (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) ⁸ et le sans étiquette MRM (surveillance de réaction multiple) ⁹ techniques. Les deux méthodes sont des outils puissants et sont de bons choix pour les réglages spécifiques. Un laboratoire typique travaillant principalement avec des lignées cellulaires, cependant, ces deux méthodes ont relatively des coûts plus élevés et sont plus de temps par rapport à la méthode basée sur SILAC. SILAC est une technique de marquage métabolique à base qui intègre les formes isotopiques non radioactifs d'acides aminés à partir du milieu de culture dans les protéines cellulaires. Typiquement, les expériences SILAC commencent avec deux populations de cellules, par exemple, infectées et non infectées. Chacun est marqué de manière différentielle dans son environnement isotopique spécifique jusqu'à l'étiquetage complet est atteint. Les exosomes marqués de ces cellules sont ensuite soumises à une extraction des protéines. Une fois extraites, les protéines exosomales marquées sont analysées par chromatographie en phase liquide tandem spectroscopie de masse ^10. Enfin, les résultats de spectrométrie de masse et les protéines marquées de façon significative sont soumis à des statistiques et bioinformatique analyses ainsi que la vérification biochimique rigoureuse. Nos rapports d'enquête précédents suggèrent que les procédures SILAC / exosomes sont plus appropriés pour les lignées cellulaires que les cellules primaires, comme les lignées cellulaires sont habituellement dans unétat de prolifération active efficace étiquetage isotopique,

Protocole

1. Culture cellulaire et VIH-1 Infection

NOTE: Avant de commencer les expériences, il est recommandé de vérifier la viabilité des cellules par coloration au bleu Trypan ¹¹ et leur prolifération par le biais d' un test MTT ^12. Il est également essentiel d'utiliser milieu SILAC nouvellement préparé. Diverses lignées cellulaires peuvent être utilisés, tant qu'ils sont à un stade de prolifération active et sont sensibles à l'infection par le VIH-1, ou la condition de test de choix. Dans ce protocole, utiliser la lignée cellulaire H9 comme l'exemple.

1. Semences 2 x 10 ⁶ cellules H9 dans chaque flacon de culture cellulaire. Cultiver un groupe dans 10 ml marquées du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum dialyse de fœtus bovin (FBS), 100 mg / L ¹³ C ₆ L-lysine et 100 mg / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginine. Cultiver l'autre groupe dans 10 ml de milieu non marqué RPMI 1640 avec 10% de FBS dialyse, 100 mg / L de L-lysine et 100 mg / L de L-arginine.
2. Cultiver les cellules pendant six doublements à quel point les protéines des cellules dans le milieu marqué sont pratiquement totalement étiquetés (> 99%) avec des acides aminés lourds. Ajouter un milieu frais ou changer de support régulièrement (tous les 1-3 jours selon le type de cellule. Pour cellule H9, changement de milieu tous les 3 jours). A la fin du marquage, d' augmenter le volume de la culture (par exemple , ~ 30 ml) pour tenir compte de la croissance de plusieurs cellules.
   REMARQUE: déterminer le temps de doublement cellulaire exacte au début de l'expérience, par la coloration au bleu Trypan et le comptage des cellules.
3. Infect les cellules marquées avec le VIH-1 en utilisant la norme _NL4-3 VIH-1 protocole d'infection ¹³ pendant 48 heures. Incuber les cellules avec des quantités appropriées de virus à une multiplicité d'infection (MOI) d'environ 0,3. Vérifier infection VIH-1 p24 par quantification des surnageants de culture en utilisant un kit de l'antigène p24 du VIH-1 ELISA. Effectuer un test d'immunofluorescence ¹⁴ pour confirmer l' infection réussie de cellules. Keep la croissance des cellules non marquées dans un milieu non marqué sans infection VIH-1.
4. Récolter les surnageants des deux groupes à la fin de l'infection (étape 2.1).

2. Exosome Isolation

NOTE: Grâce à une série d'étapes d'ultracentrifugation, fractions exosomales de surnageants de culture sont enrichis ^15. Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 ° C, avec un rotor d'ultracentrifugation qui peuvent atteindre une vitesse d'au moins 100 000 x g.

1. Collecter les surnageants des cultures dans 50 tubes coniques ml, en évitant les cellules. Centrifuger pendant 10 min à 300 xg pour éliminer les cellules restantes.
2. Collecter les surnageants dans de nouveaux tubes de 50 ml coniques et centrifuger pendant 10 min à 2000 xg pour éliminer les cellules mortes. Transfert des surnageants dans les tubes de rotor compatible commerciaux qui sont capables de résister à une ultracentrifugation résultant.
3. Assurez-vous d'équilibrer les tubes d'ultracentrifugation. Centrifuger les tubes pendant 30 minutes à 10.000 xg pour éliminerles débris cellulaires.
4. Collecter les surnageants dans des tubes d'ultracentrifugation et centrifuger pour 70 min à 100 000 x g. Jeter les surnageants.
5. Resuspendre les pellets exosomes riches dans 5 ml de PBS frais. Transférer les solutions dans des tubes d'ultracentrifugation frais et centrifuger à nouveau pendant 70 minutes à 100.000 x g.
6. surnageants Jeter. Pour stocker les exosomes à long terme, remettre en suspension les pastilles dans 50 pl de PBS et conserver à -80 ° C. Sinon, passez directement à l'extraction des protéines, comme indiqué ci-dessous.

3. Protein Extraction et préparation

1. Dissoudre isolés pellets exosomales dans 100-200 ul RIPA lyse et l'extraction avec un tampon ajouté cocktails d'inhibiteurs de la protéase. Le tampon est composé de 25 mM de Tris-chlorhydrate, chlorure de sodium 150 mM, 1% de NP-40, 1% de désoxycholate de sodium et 0,1% de SDS (sodium dodécyl sulfate), à ​​pH 7,6. Les cocktails d'inhibiteur de protéase doivent contenir une variété d'inhibiteurs de protéase, tels que l'aprotinine, bestatine, leupeptin, pepstatine A et EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), qui peut inhiber une gamme complète de protéases.
2. Centrifuger les solutions dissoutes pour 10 min à 13000 xg (4 ° C), et transférer les surnageants défrichées à de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation.
3. Quantifier la concentration en protéine de chaque échantillon d'exosomes en utilisant l' acide bicinchoninique (BCA) ou Bradford dosage ^16.
4. Mélanger une quantité égale de protéines (2 pg) à partir d'échantillons étiquetés et non étiquetés et exécuter le mélange égal sur un gel SDS-PAGE 4-20% à 120 mA / 200 V pendant 30 min.
5. Gel Stain au bleu de Coomassie suivie par détachage ^17.
6. En utilisant une lame de rasoir, coupe la voie de l'échantillon à partir du gel. Ensuite, couper la voie de gel en 10-15 morceaux égaux. Mettez chaque morceau en 1,5 ml tube frais de microcentrifugeuse pour un total de 10-15 tubes.
7. Immergez cubes dans 25 mM NH ₄ HCO ₃ dans 50% d' acétonitrile, vortex, et jeter surnageants. Répéter deux fois. Seccubes dans un concentrateur sous vide ^{18, 19.}
8. Réhydrater cubes avec 10 mM de dithiothréitol (DTT), vortex et centrifuger brièvement. Incuber à 56 ° C pendant 1 h. surnageant Jeter.
9. Immergez cubes de gel dans 55 mM d'iodoacétamide, vortex, et de spin. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 45 minutes. surnageant Jeter.
10. Immergez cubes dans 25 mM NH ₄ HCO _3, vortex, rotation, et éliminer le surnageant.
11. Immergez cubes dans 25 mM NH ₄ HCO ₃ dans 50% d' acétonitrile, vortex, et de spin. Répétez 3.9 et 3.10.
12. Sécher les cubes dans un concentrateur sous vide. Ajouter 25 ul séquençage de grade trypsine modifié dans 25 mM NH ₄ HCO _3, incuber à 4 ° C pendant 30 min, et jeter l'excès de solution. Immergez cubes dans 25 mM NH ₄ HCO ₃ sans trypsine, et incuber une nuit à 37 ° C.
13. tourner brièvement cubes vers le bas et transférer le peptide supplémentaire résultantct un nouveau tube. Ajouter 30 ul d'acide formique à 5% dans 50% d'acétonitrile aux cubes, vortex pendant 30 min, essorage. Combinez le surnageant avec l'extrait. Sécher les extraits peptidiques avec un concentrateur sous vide à moins de 5 ul.
14. Soumettre des échantillons à la masse installation centrale de spectrométrie pour l'analyse LC-MS / MS. Les données d'analyse MS, qui peut être généré à partir d'un logiciel open source, comprend généralement un numéro d'adhésion pour chaque protéine identifiée, étiquetés / rapports non marqués et le nombre de peptides uniques identifiés.

4. Vérification Western blot

NOTE: Western blot est recommandé de vérifier les résultats de spectrométrie de masse.

1. Suivre les protocoles de l'Ouest standard de transfert et de veiller à ce que des quantités égales de protéines de chaque groupe sont chargés. Utilisez des anticorps contre les protéines d'intérêt (par exemple A5 annexine, lactate déshydrogénase chaîne B) identifiés par MS. détection Western blot, avec densitométrie analysis, peut réaffirment que MS l'identification des protéines et la quantification sont corrects.

5. Analyse protéomique données

NOTE: L'évaluation de la qualité des données, le prétraitement des données, le calcul et la détermination des candidats de protéines importantes sont effectuées séparément pour chaque MS répliquer. Une fois les analyses ci - dessus sont terminées, les données analysées à partir de répétitions sont comparés et combinés ^{6, 20, 21.}

1. Évaluer la qualité des données MS.
   1. Tout d'abord, LOG2 transformer le SILAC-MS marqué / ratios non marqués de protéines quantifiées dans un programme de tableur.
   2. Dans graphique scientifique et logiciel statistique, regrouper les ratios dans 40-100 bacs ratio et tracer le nombre de rapports par bac pour générer un histogramme. Une distribution normale de l' histogramme indique une bonne qualité des données MS ^6. Effectuez cette opération pour tous les MS se réplique.
2. Pour accroître la confiance et la précision des rapports de peptides MS, envisager de supprimer des protéines qui ont moins de deux peptides quantifiés.
3. Pour déterminer les candidats de protéines significativement haut et bas réglementé, utilisez les étapes suivantes pour calculer l' importance des seuils ^22.
   1. Dans graphique scientifique et logiciel statistique, générer une régression non linéaire ou ajustement de courbe des données de distribution de fréquences. Cette étape donne des valeurs qui peuvent être utilisées pour calculer les valeurs de coupure. Calculer les valeurs de coupure que médiane ± 1,96 σ pour les limites de confiance à 95% ou 2,56 σ pour les limites de confiance de 99%.
      NOTE: Les détails spécifiques de calcul des seuils peuvent être trouvés à Emmott et al. ^22.
   2. Sélectionnez les candidats de protéines dont les ratios sont soit supérieur à 1,96 (ou 2,56) écarts types au-dessus de la médiane (nettement sur-exprimé) ou inférieure à 1,96 (ou 2,56) écarts types en dessous de la médiane (significativement sous-exprimé).
4. Comparez les répétitions des candidats importants identifiés ci-dessus pour assurer la cohérence. Veiller à ce qu'ils répondent aux critères suivants pour passer cette étape finale de sélection: les candidats doivent être systématiquement identifiés dans toutes les répétitions; et répétitions d'un candidat doivent être cohérentes dans leur direction de la réglementation (de préférence, au moins 2 de 3 répétitions d'un candidat devrait être soit régulée à la hausse ou à la baisse réglementée).
5. Finaliser données pour les candidats qui répondent aux critères mentionnés ci-dessus en fusionnant les données de leurs répétitions.

6. Bioinformatics Vérification et caractérisation

REMARQUE: l'information génomique et bioinformatique existant offre une mine d'informations pour presque toutes les protéines. L'exploration de données et l'analyse bioinformatique de cette information peuvent aider à gagner beaucoup de perspicacité dans la propriété et les fonctions des candidats importants. Cette procéss est généralement nécessaire de concevoir des expériences de laboratoire humide en aval appropriés.

1. En utilisant leurs numéros GenBank d'adhésion ou les ID UniProt, rechercher les candidats contre les bases de données exosomes actuelles (Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ pour vérifier que les protéines candidates ont déjà été trouvés dans exosomes. Cette étape ajoute une couche de confiance que les candidats sont en effet en exosomes.
   1. Accès http://www.exocarta.org/, cliquez sur "Rechercher" et l'entrée soit le gène ou la protéine nom / numéro d'adhésion. Une page de résumé apparaît et la preuve en exosomes sera montré, à condition, s'il y a lieu.
2. Rechercher les candidats contre le VIH-1 et la protéine humaine Interaction Database ^25. Vous pouvez également rechercher les bases de données spécifiques qui peuvent fournir des informations sur l'interaction des protéines candidates et la condition de test.
   1. Accédez à la base de données www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions. Lors de l'entrée «protéine du nom de domaine ', entrez les noms des candidats ou des numéros d'accès, puis cliquez sur rechercher. Les résultats de recherche peuvent donner un aperçu des interactions entre le VIH-1 et les candidats de protéines, et de proposer des candidats qui pourraient être vraiment le VIH-1 associé.
3. Importation GenBank numéros d'adhésion ou UniProt ID des candidats dans le logiciel d'analyse GO (comme FunRich, enrichissement fonctionnel outil d'analyse ²⁶⁾ et exécuter le logiciel.
   1. Téléchargez le logiciel à http://www.funrich.org/. Après l'installation, ouvrez le logiciel, en cours d'analyse d'enrichissement, cliquez sur "Ajouter Data Set", et télécharger la liste des protéines / gènes. Ensuite, sélectionnez le type de graphique pour visualiser l'analyse de GO.
      NOTE: GO résultats de l'analyse seront visualisées sous forme de diagrammes circulaires. Cette étape nous aide à mieux comprendre globale associée avec les candidats dans les domaines du processus biologique (BP), le composant cellulaire (CC), et fonction moléculaire (MF).
4. Accès DAVID au http://david.ncifcrf.gov/ ^27, cliquez sur le "outil d' annotation fonctionnelle" sur son site Internet. Entrez la liste des candidats, sélectionnez le "Identifier" du gène tel que le "UniProt ID", sélectionnez "Liste Gene" et la recherche. Les termes enrichis GO, p-valeurs, et d'autres paramètres peuvent être trouvés en cliquant sur la page "Annotation Sommaire des résultats" dans la catégorie "Gene_Ontology".
5. Pour étudier les interactions potentielles des candidats avec d' autres protéines, utiliser ouvertement accessible la base de données STRING ²⁸ pour élucider les interactions protéine-protéine potentiels et possibles voies biochimiques.
   NOTE: GO Analyse et Annotation fonctionnelle (section 6,3-6,4) peut également être effectuée en utilisant le dernier logiciel de STRING.
   1. Accédez à la base de données http://string-db.org/. Entrez l'ID de protéine ou séquence dans les s désignéscase echerche et sélectionner les espèces correctes pour l'analyse. Cliquez sur "Rechercher". Les résultats donneront des informations sur les deux associations directes (physiques) et indirects (fonctionnels). Les dix premiers matchs connus pour le candidat de exosomal seront affichés et doivent être pris en considération pour la sélection des candidats importants.
      NOTE: Une grande partie des informations associées aux candidats peut être analysé en utilisant les étapes ci-dessus. Les candidats les plus importants peuvent être choisis pour une analyse moléculaire et biochimique en aval.

Résultats

La figure 1A est un organigramme décrivant la procédure d'étiquetage SILAC ^21. Afin de purifier les exosomes, les échantillons doivent être décélérée par centrifugeuse. Figure 1B montre les étapes de purification d'exosomes par ultracentrifugation série ^21. Une fois purifiés, les exosomes sont soumis à des analyses protéomiques expérimental tel que décrit dans la procédure.

Discussion

Dans les procédures décrites dans le présent document, nous avons démontré l'application de la technique de SILAC pour étudier l'effet du VIH-1 infection sur le protéome exosomal hôte. Initialement, les cellules infectées et non infectées du VIH-1 sont différentiellement marquée par un isotope. Les exosomes marquées de façon différentielle sont ensuite purifiés avant d'effectuer l'extraction des protéines. Ensuite, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem est utilisée p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details