Vein Interposition Modèle: un modèle approprié pour étudier Bypass Graft Patency

Résumé

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Résumé

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introduction

maladies des artères coronaires et leurs complications sont parmi les principales causes de décès dans le monde. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le rétablissement de la circulation sanguine, soit en dilatant le vaisseau rétréci ou en créant une dérivation. Le pontage coronarien coronarien (PAC) en utilisant des autogreffes veineuses a été décrite pour la première en 1968 et a été affinée au fil des ans. En dehors de la revascularisation de l'artère descendante antérieure gauche coronaire, conduits de veine saphène sont les plus couramment utilisés ^1. Cependant, la perméabilité du greffon reste le talon d'Achille des greffes de veine saphène (SVG). Un an après la chirurgie, la perméabilité du greffon est de 85%, passant à 61% après dix ans ^2,3. Dévoiler les mécanismes physiopathologiques et les causes de la perte de SVG patence est donc une tâche importante.

Cette vidéo montre une veine modèle d'interposition de rat pour étudier la veine perte du greffon. Les objectifs généraux de cette méthode sont à explorer le pathobiologique sous-jacenteet les processus -physiological pendant la progression de la maladie et de développer un modèle approprié pour la drogue ou l'essai d'option thérapeutique. En transplantant la veine épigastrique superficielle dans le système artériel, ce modèle imite étroitement le cadre clinique de pontage coronarien greffage. Un traumatisme chirurgical, l'ischémie, et le stress de la paroi sont des déclencheurs importants de changements vasculaires pathologiques et sont imités dans le modèle décrit.

Différents modèles et espèces sont disponibles pour enquêter sur la greffe de veine perte de perméabilité. Des modèles animaux grands, tels que les porcs, les moutons ^{4 5 6,} les chiens et les singes ^7, ressemblent à des navires et des structures anatomiques humaines et permettent ainsi des stratégies thérapeutiques complexes, tels que la pose de stent de dérivation ou de nouvelles techniques chirurgicales, à tester ^8. Cependant, spécial logement, l'équipement et le personnel sont nécessaires. En outre, les coûts élevés et la nécessité d'un anesthésiste supplémentaire au cours de la chirurgie entravent leur application plus large. Smtous les animaux, y compris les rats, sont faciles à manipuler, ne nécessitent pas de logement spécial, et ont des coûts gérables. Par rapport aux modèles de souris ^9,10, des modèles de rats ont l'avantage d' une meilleure capacité de fonctionnement et par conséquent moins de variabilité dans les résultats. Les rats sont physiologiquement et génétiquement plus semblables aux humains que les souris ^11,12. En outre, la plupart des souris de type sauvage ne se développent myointima limitée ^13, qui font des modèles de souris sujettes à des erreurs de type II. L'histologie des nervures principales de la souris, telles que la veine cave inférieure, ne se compose que de quelques couches de cellules et rend difficile l' évaluation précoce ^13. Un autre inconvénient est la faible quantité de tissu disponible pour une analyse subséquente après la récupération de la greffe.

Le modèle décrit dans cette vidéo est reproductible, peu coûteuse et facile à réaliser, et il peut être mis en place rapidement et de manière fiable. Il est particulièrement adapté à l'évaluation d'agents thérapeutiques coûteux expérimentaux, tels que les vecteurs virauxpour la thérapie génique, d'une manière économique.

Protocole

Les animaux ont reçu des soins humains en conformité avec le Guide des Principes des animaux de laboratoire, préparé par l'Institut des ressources animales de laboratoire et publiées par les National Institutes of Health. Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par l'autorité locale responsable ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Bureau de la santé et de la protection des consommateurs) de Hambourg").

1. Animal Care

1. Obtenir des rats Lewis (LEW / Crl) rats et ROSA / rats transgéniques luciférase-LEW pesant 300-350 g de l'Institut des animaux de laboratoire.
2. Gardez les rats dans des conditions classiques dans des armoires ventilées et de les nourrir chow de rat standard et autoclavé de l'eau ad libitum.
3. Effectuer une transplantation de greffe en utilisant les ROSA / luciférase-LEW rats transgéniques que les donateurs et les rats syngéniques LEW / Crl que les destinataires.

2. Préparation du Rat des donateurs

1. Utilisez un introducteurchambre ionique pour anesthésier un rat avec de l'isoflurane (2,5-3%).
2. Placez le rat sur son dos et de maintenir l'anesthésie avec un masque couvrant la bouche et le nez. Vérifiez la profondeur suffisante de l'anesthésie en pinçant les pattes arrière et de vérifier l'absence de réflexes. Appliquer un peu de vétérinaire onguent pour les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Répartir les pattes arrière et fixer leur position à l'aide du ruban adhésif.
4. Raser les cheveux inguinale avec une coupe de cheveux et de désinfecter l'ensemble de la zone en utilisant povidone-iode suivi par 80% d'éthanol. Répéter deux fois l'étape de désinfection.
   NOTE: La zone chirurgicale, de la gaze, et les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés. Maintenir un champ stérile tout au long de la procédure et à l'usure à usage unique, gants chirurgicaux stériles, masques et chapeaux.
5. Sous un microscope, effectuer une incision verticale le long des inguinalis linea. Utilisez deux pinces pour séparer délicatement les tissus sous-cutanés et d'exposer la veine épigastrique superficielle de son origin sur la veine fémorale. isoler soigneusement la veine épigastrique superficielle des tissus environnants.
6. Arrêter l'écoulement du sang dans la veine épigastrique superficielle en utilisant deux micro pinces.
7. La récolte d'un segment environ 0,5 à 1 cm de la veine en soulevant avec précaution la veine isolé avec une pince et coupe à travers le récipient avec microciseaux. Laissez les micro pinces sur le moignon du navire pour empêcher la perte de sang. Placez le morceau retiré de la veine sur une gaze stérile. Placez délicatement une aiguille de 30 G à l'intérieur d'une extrémité de la veine récoltée et rincer la cuve avec de l'héparine (50 unités / ml).
   REMARQUE: Manipulez la veine avec soin et éviter tout dommage pendant le levage, la coupe, et le rinçage. Assurez-vous de rincer la greffe avec la bonne quantité d'héparine.
8. Maintenir le segment de vaisseau à 1% de lidocaïne sur la glace jusqu'à leur transplantation dans le rat receveur pour prévenir un spasme du vaisseau.
9. Euthanasier le rat donneur en augmentant l'anesthésie à 5% d'isoflurane. Après 2-3 min, open l'abdomen le long de la ligne blanche, couper à travers le diaphragme, et retirer le coeur pour arrêter la circulation.

3. Préparation du Rat du bénéficiaire

1. Anesthetize et fixer le rat receveur de la même manière que le rat donneur.
2. Raser la face interne des pattes avec une tondeuse pour poils longs et désinfecter à trois reprises à l'aide povidone-iode et 80% d'éthanol.
3. Surveiller la profondeur de l'anesthésie et de veiller à ce qu'elle est suffisante en vérifiant l'absence de réflexes quand pincer les pattes de derrière.
4. Effectuer une incision médiane fémoral du genou au pli inguinal. Sous un microscope, utilisez 2 pinces pour séparer l'artère fémorale de son environnement.
5. Utilisez micro pinces pour arrêter l'écoulement du sang. Placer la pince proximale en premier, suivie par la pince distale.
6. Découpez un court segment de l'artère fémorale serrée avec microciseaux et jetez-le. Raccourcir le moignon artériel restant avec microciseaux, créant un espace qui est1-2 mm de plus que la greffe de veine. Rincer la souche artérielle avec de l'héparine en utilisant une aiguille 30 G.
   NOTE: Si l'adventice dépasse légèrement le moignon du vaisseau, utilisez une pince pour tirer légèrement sur l'extrémité de la cuve et enlever un morceau.
7. Placez la veine récoltées à partir de l'étape 2.8 entre les souches artérielles et d'ajuster la longueur afin qu'il tienne convenablement dans l'intervalle. Notez la direction de la veine.
8. Effectuez l'anastomose proximale d'abord en utilisant un fil de suture 10-0 de prolene. Mener des points simples dans l'ordre indiqué (figure 1D). Commencer avec un fil de suture sur chaque côté latéral avant d'ajouter plus de trois points de suture sur la face ventrale. Par la suite, placer trois points de suture sur la face dorsale du récipient pour compléter l'anastomose.
9. Raccorder les vaisseaux distaux avec le greffon en utilisant la même technique que pour l'anastomose proximale décrit à l'étape 3.8. Encore une fois, commencer par une suture sur chaque côté latéral, puis placez trois sutures sur le sid ventrale et la face dorsale.
10. Chargez deux seringues de 1 mL avec le composant de colle de fibrine 1 et 2. Soulevez délicatement la greffe avec une pince et déposer environ 100 pi de fibrine composant de la colle 1 sous la greffe, suivie par la composante 2.
    REMARQUE: Assurez-vous que les composants 1 et 2 sont appliqués dans un rapport 1: 1.
11. Placez le greffon dans sa position et déposer un 100 pi supplémentaires des composants 1 et 2 sur le dessus de la greffe. Assurez-vous que la colle couvre à la fois la greffe et l'anastomose afin de prévenir l'insuffisance anastomotique et sur-distension du greffon veineux.
12. Ouvrez soigneusement la pince distale, suivie par la partie proximale.
13. Confirmer une chirurgie réussie en vérifiant une impulsion visible dans la veine et l'artère transplanté distale de la greffe.
14. Retirer la colle excessive, ce qui empêche la fermeture de la peau. Utilisez une pince pour soulever la colle durcie et enlever l'excédent avec microciseaux. Fermez les couches de la peau avec 5-0 sutures prolène.
15. Injecter 4-5 mg / kg carprofène sous-cutanée avant de permettre au rat de se réveiller. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Gardez l'animal dans une seule cage jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli.
16. Ajouter Metamizole à l'eau potable (50 mg Metamizole par 100 ml) comme médicament de la douleur pour les 3 jours suivants et surveiller l'animal par jour.

4. Duplex Sonography

REMARQUE: Utilisez sonographie duxplex pour visualiser le flux sanguin non invasive chez les rats ^14.

1. Anesthésier un rat dans une chambre d'induction (isoflurane 2%). Placez le rat sur son dos et maintenir une anesthésie avec un masque couvrant le nez.
2. Utilisez les tondeuses et la crème d'épilation pour enlever les poils autour de la zone de la cuisse.
3. Appliquer le gel échographique à la cuisse. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air. Acquérir les images de l'échographie duplex utilisant un transducteur 400 MS (fréquence centrale: 30 MHz) avec un taux de 230-400 images / sec de cadre.

5. histopathologie

NOTE: Récolte et tacher le navire avec trichrome coloration de Masson pour l' analyse morphométrique ^15.

1. Fixer le navire récolté dans 4% de paraformaldehyde pendant la nuit et le déshydrater à des concentrations croissantes d'éthanol. Incluez l'échantillon dans de la paraffine et le couper en 5 um tranches épaisses à l'aide d'un microtome.
   NOTE: Le paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec un soin particulier.
2. Déparaffiner les lames avant de les colorer avec trichrome solution de coloration. Déshydrater les lames colorées, les effacer avec du xylène, et les monter dans un milieu de montage. Après séchage, les diapositives, afficher les échantillons avec un microscope.

6. bioluminescence Imaging (BLI)

NOTE: La greffe post - opératoire a été suivi au fil du temps in vivo en mesurant le signal bioluminescent ¹6.

1. Dissoudre 1 g de D-luciférine sel de potassium dans 22 ml de PBS et de l'injecter par voie intraperitoneale dans les rats (375 mg / kg de poids corporel). Attendre 15 min pour la luciférine de circuler dans l'animal.
2. Placer le rat dans un système de dosage par bioluminescence en temps réel et d'accéder au signal de bioluminescence.

Résultats

Le modèle d'interposition de la veine de rat est adapté pour étudier le développement de l'hyperplasie myointima et échec de la greffe de veine. Les animaux se rétablissent bien de la chirurgie et présentent une excellente post-opération de condition physique. La figure 1 montre les étapes clés chirurgicales. Après l'incision de la peau le long des inguinalis linea, la veine superficielle épigastrique et l' artère fémorale sont identifiés (figure 1A). La r...

Discussion

Cette vidéo montre une veine modèle d'interposition de rat pour étudier la veine perte du greffon et de permettre l'exploration des processus pathologiques sous-jacents et les tests de nouveaux médicaments ou des options thérapeutiques.

L'anesthésie est un aspect crucial des procédures chirurgicales. Un système d'anesthésie par inhalation continue est recommandée, car cela est une méthode sûre et facile, surtout au cours des opérations prolongées. Ceci peut êtr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment