Un protocole pour l'utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

Résumé

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Résumé

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduction

Sensible à la force, des capteurs de FRET codés génétiquement ont récemment émergé comme un outil important pour mesurer des forces de traction à base de cellules vivantes, donnant un aperçu de la manière dont les forces mécaniques sont appliquées sur les protéines ^{1, 2, 3, 4.} Avec ces outils, les chercheurs peuvent acquérir des images non effractive forces intracellulaires dans les cellules vivantes en utilisant des microscopes fluorescents classiques. Ces capteurs sont constitués d'une paire FRET (donneur et accepteur protéines fluorescentes, le plus souvent un donneur et accepteur bleu jaune) séparées par un peptide élastique ^3. Contrairement à C- ou le marquage N-terminal, ce capteur est inséré dans un site interne d'une protéine pour mesurer la force mécanique transmise à travers la protéine, se comportant comme une jauge de contrainte moléculaire. Augmentation de la tension mécanique sur les résultats de détection à une distance accrue entre le FRET-pair, entraînant une diminution de FRET ^3. En conséquence, le FRET est inversement proportionnelle à la force de traction.

Ces capteurs à base de fluorescence ont été développés pour des protéines d'adhésion focale (de vinculine ³ et Talin ^4), les protéines du cytosquelette (α-actinine ^5), et des protéines de jonction cellule-cellule (E-cadhérine ^{6, 7,} VE-cadhérine ^8, et PECAM ^8). Le segment de liaison élastique le plus fréquemment utilisé et bien caractérisés dans ces biocapteurs est connu comme TSmod et se compose d'une séquence répétitive de 40 acides aminés, (GPGGA) _8, qui a été dérivée de la protéine de soie d'araignée flagelliforme. TSmod a été montré pour se comporter comme un ressort élastique nano-linéaire, avec une réactivité de FRET à 1 à 5 pN de la force de traction ^3. Différentes longueurs de flagelliformes peuvent être utilisés pour modifier la dynamique range de la sensibilité de la force de FRET TSmod ^9. En plus de flagelliformes, spectrine répète ⁵ et villine peptide de tête (connu sous le nom HP35) ⁴ ont été utilisés comme peptides élastiques entre les paires de FRET dans des biocapteurs de force similaire ^4. Enfin, un récent rapport a montré que TSmod peut également être utilisé pour détecter les forces de compression ^10.

Nous avons récemment développé un capteur de force pour la liaison de la nucléo-cytosquelette (CLIC) complexe de protéines en utilisant Nesprin2G TSmod inséré dans une protéine tronquée Nesprin2G développé précédemment connu sous le mini-Nesprin2G (figure 2C), qui se comporte de manière similaire à endogène Nesprin-2G ^11. Le complexe CLIC contient plusieurs protéines qui mènent de l'extérieur vers l'intérieur du noyau, reliant le cytosquelette cytoplasmique de la lamina nucléaire. Nesprin-2G est une protéine structurale lie à la fois à lacytosquelette d'actine dans le cytoplasme et aux protéines SUN dans l'espace périnucléaire. En utilisant notre biocapteur, nous avons pu montrer que Nesprin-2G est soumis à une tension dépendant de actomyosine dans les fibroblastes NIH3T3 ^2. Ce fut la première fois que la force a été mesurée directement sur une protéine dans le complexe nucléaire LINC, et il est susceptible de devenir un outil important pour comprendre le rôle de la force sur le noyau en mécanobiologie.

Le protocole ci-dessous fournit une méthodologie détaillée de la façon d'utiliser le capteur de force Nesprin-2G, y compris l'expression du capteur de tension Nesprin (Nesprin-TS) dans des cellules de mammifères, ainsi que l'acquisition et l'analyse des images de FRET de cellules exprimant Nesprin- TS. En utilisant un microscope confocal inversé équipé d'un détecteur spectral, une description de la façon de mesurer l'émission sensibilisée FRET utilisant déconvolution spectrale et l'imagerie ratiométrique de FRET est fourni. Les images de sortie ratiométrique peuvent être utilisés pour faire en tant que parentComparaisons des forces ntitative. Bien que ce protocole se concentre sur l'expression de Nesprin-TS dans des fibroblastes, il est facilement adaptable à d'autres cellules de mammifères, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires. En outre, ce protocole en ce qui concerne l'acquisition et l'analyse FRET image peut être facilement adaptée à d'autres biocapteurs de force sur la base de FRET qui ont été développés pour d'autres protéines.

Protocole

1. Obtenir Nesprin-2G ADN capteur et autres ADN plasmidique

1. Obtenir Nesprin-2G TS (capteur de tension), le contrôle Nesprin-2G HL (sans tête), mTFP1, venus, et TSmod à partir d'une source commerciale. Propager les plasmides d'ADN et les purifier en utilisant des souches standards de E. coli, tels que DH5-α, comme décrit précédemment ^{12, 13.}

2. Les cellules transfecter avec Nesprin-2G et autres ADN plasmidique

1. Cultiver des cellules de fibroblastes NIH 3T3 à confluence 70-90% dans une boîte de culture cellulaire à 6 puits dans un incubateur de culture cellulaire standard avec la température (37 ° C) et de régulation de CO ₂ (5%). Pour le milieu de croissance cellulaire, utiliser Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau foetal.
2. Dans une hotte de culture cellulaire, éliminer le milieu et rincer chaque puits avec environ 1 ml d'un milieu de cellules à teneur réduite en sérum. Ajouter 800 pi de milieu cellulaire sérum réduit à chaque puitset mettre la chambre à 6 puits dans l'incubateur.
3. Pipeter 700 ul de milieu de sérum réduit cellulaire dans un tube de 1,5 ml avec 35 ul de solution de véhicule lipidique pour former le « lipomix ». Mélanger par pipetage. Etiqueter le tube avec un « L. »
4. Recueillir six tubes de 1,5 ml et les étiqueter 1 à 6. Pipeter 100 ul de milieu de sérum réduit de cellule dans chaque tube.
   1. Utilisation de la concentration d'ADN plasmidique provenant de l'étape 1, la pipette 2 pg de Nesprin 2G-TS dans des tubes 1 et 2. Pipeter 2 pg de Nesprin-HL dans des tubes 3 et 4. Pipeter 1 ug de MTFP dans le tube 5. Pipeter 1 ug de mVenus dans le tube 6. ne pas réutiliser les embouts de pipette lors du pipetage différents types d'ADN.
5. Pipeter 100 ul de la lipomix du tube en « L » dans chaque tube marqué (1-6) et mélanger par pipetage répété. Utiliser une pipette propre pour chaque tube. Incuber pendant 10-20 min.
6. Ajouter 200 ul de chaque tube marqué à un puits dans la chambre 6 puits avec 70-90% de confluencecellules. Etiqueter le haut de chaque puits avec l'ADN correspondant ajouté. Placer la chambre à 6 puits dans un incubateur pendant 4-6 h.
7. Aspirer le moyen et ajouter 1-2 ml de milieu cellulaire sérum réduit à rincer. Aspirer le milieu des cellules à teneur réduite en sérum, ajouter 2 ml de trypsine à chaque puits, et placer le plat à 6 puits dans l'incubateur (5-15 min).
8. Bien que les cellules se détachent dans l'incubateur, le manteau 6 plats de visualisation à fond de verre avec une couche de fibronectine à une concentration de 20 ug / mL dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser la vaisselle à revêtir la surface dans la hotte de culture cellulaire (environ 20 min).
9. Neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de DMEM une fois que les cellules sont détachées.
10. Transférer le contenu de chaque puits à un tube de centrifugation marqué 15 ml et centrifuger à 90 xg pendant 5 min dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1 000 pi de DMEM par mélange de pipette.
11. Aspirer le mélange de fibronectine à partir duplats à base de verre et de pipette de 1000 ul de chaque suspension cellulaire sur la vaisselle en verre.
12. Après que les cellules se déposent au fond des plats en verre (~ 15 min), ajouter un autre 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep à chaque puits et dans l'incubateur de cellules. Permettre aux cellules de se fixer et d'un capteur pour exprimer au moins 18 à 24 h.
    NOTE: Les cellules sont transfectées en utilisant des réactifs de transfection des lipides cationiques commerciaux (voir la table des matières). En variante, les lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés à l'aide d' un plasmide avec un gène conférant une résistance à une toxine (les plasmides pcDNA pour Nesprin-TS et -HL sont disponibles sur un site de dépôt de l' ADN (voir le tableau des matériaux) fournir des cellules exprimant la résistance à la généticine ). En outre, des procédés d'infection virale (lentivirus, retrovirus, ou adenovirus) peuvent être utilisés pour exprimer le capteur dans des cellules qui sont difficiles à transfecter.
13. En plus de Nesprin-TS, transfecter des cellules supplémentaires avec le Nesprin HL-zérole contrôle de conformité, tel que décrit dans les étapes 2.1-2.12; TSmod peut également être utilisé comme un contrôle zéro force et doit présenter FRET similaire à Nesprin-HL.
14. transfecter des cellules avec mTFP1 et venus de générer des empreintes digitales spectrales (voir l'étape 4).
    REMARQUE: mTFP1 et expriment généralement vénus à des niveaux plus élevés que Nesprin-TS, et en tant que tels, des quantités plus faibles d'ADN devront peut-être transfectées pour atteindre des niveaux d'expression similaires.

3. Vérifier l'efficacité Transfection

1. Environ 18 à 24 h après la fin de la transfection, en utilisant un microscope à fluorescence inversée pour examiner l'efficacité de la transfection en comparant le nombre de cellules fluorescentes et le nombre total de cellules en vue (généralement 5-30%).
   1. Utiliser un microscope à fluorescence équipé d'une fréquence d'excitation proche de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Venus), et un filtre d'émission centrée à proximité de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (VENUS).
      REMARQUE: Sinon, jeux de filtres GFP capturera une combinaison de mTFP1 et veles émissions Nus et permettront la confirmation de l'efficacité de la transfection.
2. cellules vivantes de l'image dans les 48 h après la transfection.
   1. En variante, fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS (avec du calcium et de magnésium) pendant 5 min, de stocker dans du PBS, et la vue après 48 h ^8.
      NOTE: Au-delà de 48 h, la qualité et la puissance du signal désintègre. La fixation des cellules préserve leur état, y compris le FRET étant exprimé ^8; Cependant, les cellules ne devraient être imagés dans du PBS, en tant que moyen de montage peut affecter ¹⁴ FRET. Les cellules fixées ne peuvent être comparées à d'autres cellules fixes, comme il peut y avoir un changement dans l'expression.
      Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle (EPI).

4. capture spectrale de Fingerprints mTFP1 et Vénus fluorophores pour Déconvolution spectrale

1. Dans une hotte de culture cellulaire, remplacer le milieu cellulaire avec l'imagerie medium (tampon HEPES) complété avec 10% de sérum bovin foetal.
2. Placer les plats de visualisation à une température contrôlée (37 ° C) platine du microscope confocal.
3. Placer le plat de visualisation en verre avec des cellules transfectées mTFP1 plus de l'objectif de l'huile à un grossissement de 60X avec une ouverture numérique de 1,4.
   NOTE: L'huile est utilisée sur un microscope à balayage laser sur l'objectif 60X pour ressembler étroitement l'indice de réfraction du substrat de verre. L'huile est placé sur le dessus de l'objectif et est en contact direct avec la lamelle de verre.
4. Localiser mTFP1 cellules exprimant avec une source d'excitation de 458 nm et un filtre passe-bande d'émission centrée à 500 nm.
5. Avec une cellule fluorescente dans le champ de vision, sélectionner le mode de détection spectrale ( « Mode Lambda » dans le logiciel utilisé ici) et de capturer l'image spectrale (Figure 3-1); inclure toutes les fréquences au - delà de 458 nm en utilisant des incréments de 10 nm (Figure 3-3). Sélectionnez un Déess lumineuxrégion ent (ROI) sur la cellule (rayon de 20 pixels).
   NOTE: La forme spectrale du ROI mTFP1 exprimant doit rester dans la cellule relativement constante. Si la forme varie considérablement, réajustez le laser et obtenir les paramètres pour améliorer le rapport signal-bruit.
6. Ajouter le retour sur investissement fluorescent moyenne, l'intensité normalisée à la base de données spectrale en cliquant sur « enregistrer des spectres à la base de données. »
7. Optimiser la puissance du laser et gagner de telle sorte qu'un bon rapport signal-bruit est atteint. Les réglages varient pour différents équipements. Utilisation de cellules non fluorescentes, non transfectées en tant que référence d'arrière-plan, augmenter le gain et la puissance jusqu'à ce que les cellules sont lumineuses, mais pas au-delà de la plage dynamique du détecteur (point de saturation). les cellules d'arrière-plan ne devraient pas avoir une fluorescence détectable après une moyenne.
8. Répétez le processus pour les cellules transfectées avec vénus les exceptions suivantes:
   1. Assurez-vous que la fréquence d'excitation est à 515 nm et que le filtre passe-bande est thisntered près de 530 nm lors de la localisation des cellules exprimant vénus.
   2. En "mode spectral," utiliser une fréquence d'excitation de 515 nm au lieu de 458 nm.

5. Images capture Unmixed

1. Changez le mode de capture à « Déconvolution spectrale. »
2. Ajouter les empreintes digitales spectrales des clovisses et mTFP1 dans les canaux de démixage (Figure 3, Sous-2).
3. Réglez le laser d'excitation à une source d'argon 458 nm.
4. Placez le plat de visualisation Nesprin-TS au-dessus de l'objectif de l'huile 60X.
5. Après mise au point sur une cellule fluorescente avec une expression suffisamment lumineux, ajuster la puissance de gain et laser pour optimiser le rapport signal-sur-bruit.
   REMARQUE: Étant donné que l'efficacité de FRET de Nesprin-TS est près de 20%, l'image doit être vénus sans mélange sensiblement plus faible que l'image mTFP1 sans mélange. Une fois un réglage de puissance et le gain acceptable ont été déterminées itérativement, ces paramètres doivent rester constant pour toutes les images captured.
6. Capturer un minimum de 15-20 images de cellules Nesprin-TS avec une luminosité relativement similaire et d'éviter la saturation du pixel excessive (tous les pixels saturés sont éliminés au cours du traitement de l'image).
7. Répéter le processus de capture d'image avec des cellules HL-Nesprin en utilisant des paramètres de formation d'image identiques.

6. Traitement de l'image et analyse des ratios d'image

1. En utilisant un logiciel open-source ImageJ (FIDJI) (http://fiji.sc/), ouvrez les images au format natif en utilisant BioFormats Reader.
2. Pré-traiter les images et calculer les images de rapport en utilisant des protocoles établis précédemment ^15.

Résultats

En suivant le protocole ci - dessus, l' ADN plasmidique a été acquis à partir du dépôt de l' ADN et transformé dans des cellules E. coli. E. coli exprimant l'ADN de la sonde ont été sélectionnés à partir des plaques de LB / ampicilline et amplifiés dans un bouillon LB liquide. Suite à l'amplification des vecteurs, des plasmides d'ADN ont été purifiés dans du tampon TRIS-EDTA en utilisant un étalon, le kit d'isolement d'ADN di...

Discussion

Un procédé et la démonstration d'imagerie des cellules vivantes de la tension mécanique dans Nesprin-2G, une protéine dans le complexe nucléaire CLIC, a été décrit ci-dessus. Avant ces travaux, diverses techniques, telles que l' aspiration par micropipette, cytométrie magnétique bourrelet, et l' ablation au laser au microscope, ont été utilisés pour appliquer de pression sur le noyau de la cellule et à mesurer les propriétés des matériaux en vrac ^16,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658