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Résumé

Ce rapport décrit une méthode de bio-ingénierie pour concevoir et construire de nouveaux Facteurs d'épissage artificiel (ASF) qui modulent spécifiquement l'épissage des gènes cibles dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut être élargie pour englober divers facteurs artificiels pour manipuler d'autres aspects du métabolisme de l'ARN.

Résumé

Le traitement de la plupart des ARN eucaryotes est médié par des protéines de liaison à l'ARN (RBP) avec des configurations modulaires, y compris un module de reconnaissance d'ARN, qui lie spécifiquement la cible pré-ARNm et un domaine effecteur. Auparavant, nous avons profité du mode unique de liaison de l'ARN du domaine PUF dans le Pumilio humain 1 pour générer un échafaudage de liaison d'ARN programmable, qui a été utilisé pour concevoir divers RBP artificiels pour manipuler le métabolisme de l'ARN. Ici, un protocole détaillé est décrit pour construire Engineered Splicing Factors (ESF) qui sont spécifiquement conçus pour moduler l'épissage alternatif des gènes cibles. Le protocole comprend la façon de concevoir et de construire un échafaudage PUF personnalisé pour une cible d'ARN spécifique, comment construire un plasmide d'expression ESF en fusionnant un domaine PUF concepteur et un domaine effecteur, et comment utiliser les ESF pour manipuler l'épissage des gènes cibles. Dans les résultats représentatifs de cette méthode, nous avons également décrit les tests communsDes activités du FSE en utilisant les journalistes d'épissage, l'application du FSE dans les cellules humaines cultivées et l'effet subséquent des changements d'épissage. En suivant les protocoles détaillés dans ce rapport, il est possible de concevoir et de générer des ESF pour la régulation de différents types d'épissage alternatif (AS), en fournissant une nouvelle stratégie pour étudier la régulation de l'épissage et la fonction des différentes isoformes d'épissage. De plus, en fusionnant différents domaines fonctionnels avec un domaine PUF conçu, les chercheurs peuvent concevoir des facteurs artificiels qui ciblent des ARN spécifiques pour manipuler diverses étapes du traitement de l'ARN.

Introduction

La plupart des gènes humains subissent Alternative Splicing (AS) pour produire des isoformes multiples avec des activités distinctes, ce qui a considérablement augmenté la complexité du codage du génome 1, 2. AS fournit un mécanisme important pour réguler la fonction des gènes, et il est étroitement régulée par des voies différentes à différents stades cellulaires et de développement 3, 4. Parce que l' épissage misregulation est une cause fréquente de la maladie humaine 5, 6, 7, 8, ciblage régulation de l' épissage devient une voie thérapeutique intéressante.

Selon un modèle simplifié de la régulation de l' épissage, comme cela est principalement contrôlée par épissage cis Regulatory -elements (SRE) dans le pré-ARNm qui fonctionnent comme activateurs d'épissage d'exons ou des silencieux de remplacement. thSRE ese recruter spécifiquement divers facteurs protéiques trans -acting ( à savoir les facteurs d'épissage) qui favorisent ou inhibent la réaction d'épissage 3, 9. La plupart des facteurs d'épissage trans -acting ont des domaines de liaison d'ARN spécifiques de séquence distincts pour reconnaître leurs cibles et domaines effecteurs pour contrôler l' épissage. Les exemples sont les membres de la sérine / riche en arginine (SR) de la famille de protéines qui contiennent de l' ARN N-terminaux de reconnaissance motifs (RRMS), qui se lient activateurs d'épissage d' exons, et des domaines RS C-terminaux, qui favorisent l' inclusion de l' exon 10 les plus connus . A l' inverse, hnRNP A1 se lie à des silencieux d'épissage d' exons dans les domaines RRM et inhibe l' inclusion de l' exon à travers un domaine riche en glycine C-terminal 11. L'utilisation de ces configurations modulaires, les chercheurs devraient être en mesure de concevoir des facteurs d'épissage artificiels en combinant un domaine ARN liaison spécifique (RBD) avec différents effecdomaines tor qui activent ou inhibent l'épissage.

La clé d'une telle conception consiste à utiliser un RBD qui reconnaît les cibles donné avec une spécificité de liaison d'ARN programmable, qui est analogue au mode de liaison à l'ADN du domaine CONTE. Cependant, la plupart des domaines contiennent des facteurs d'épissage RRM ou K Homologie (KH) natifs, qui reconnaissent des éléments d'ARN courts avec une faible affinité , et donc un manque de reconnaissance prédictive d'ARN-protéine « code » 12. Le RBD des protéines de répétition MPU ( à savoir le domaine PUF) dispose d' un mode de reconnaissance de l' ARN unique, permettant pour la refonte des domaines PUF de reconnaître spécifiquement l' ARN cibles différentes 13, 14. Le domaine PUF canonique contient huit répétitions de trois hélices a, en reconnaissant chacun une base unique dans une cible d'ARN de 8 nt. Les chaînes latérales des acides aminés à certaines positions des secondes liaisons hydrogène spécifiques forment α-hélice avec le bord de Watson-Crick de tLa base d'ARN, qui détermine la spécificité de liaison de l'ARN de chaque répétition ( figure 1A ). Le code pour la reconnaissance par ARN de la répétition PUF est étonnamment simple ( Figure 1A ), permettant la génération de domaines PUF qui reconnaissent toute combinaison possible de 8 bases (examinée par Wei et Wang 15 ).

Ce principe de conception modulaire permet la génération d'un Factor d'épissage Engineered (ESF) qui consiste en un domaine PUF personnalisé et un domaine de modulation d'épissage ( c'est-à-dire un domaine SR ou un domaine riche en Gly). Ces ESF peuvent fonctionner comme activateurs d'épissage ou comme inhibiteurs pour contrôler différents types d'événements d'épissage, et ils se sont révélés utiles comme outils pour manipuler l'épissage des gènes endogènes liés à la maladie humaine 16,17 . Par exemple, nous avons construit des ESF de type PUF-Gly pour modifier spécifiquement l'épissage du gène Bcl-x, La conversion de l'isoforme longue anti-apoptotique (Bcl-xL) en isoforme courante pro-apoptotique (Bcl-xS). Le changement du rapport de l'isoforme Bcl-x était suffisant pour sensibiliser plusieurs cellules cancéreuses à de multiples médicaments contre la chimiothérapie anticancéreux 16 , ce qui suggère que ces facteurs artificiels peuvent être utiles en tant que réactifs thérapeutiques potentiels.

En plus de contrôler l'épissage avec des domaines effecteurs d'épissage connus ( par exemple, un domaine RS ou Gly), les facteurs PUF modifiés peuvent également être utilisés pour examiner les activités de nouveaux facteurs d'épissage. Par exemple, en utilisant cette approche, nous avons démontré que le domaine C-terminal de plusieurs protéines SR peut activer ou inhiber l'épissage lors de la liaison à différentes régions pré-ARNm 18 , que le motif riche en alanine de RBM4 peut inhiber l'épissage 19 et Le motif riche en proline de DAZAP1 peut améliorer l'épissage 20 , 21 </ Sup>. Ces nouveaux domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour construire des types supplémentaires de facteurs artificiels pour affiner l'épissage.

Protocole

1. Construction d'un échafaudage PUF avec spécificité de liaison à l'ARN personnalisée par PCR en chevauchement

  1. Concevoir une série d'amorces de PCR contenant les séquences PUF qui reconnaissent spécifiquement différents nucléotides d'ARN dans chaque position 12 (voir Tableau 1 pour les séquences d'amorces et voir la Figure 1 A pour le code de reconnaissance ARN: PUF). Pour chaque répétition PUF, concevez quatre amorces différentes pour reconnaître une base différente sur chaque position.
    NOTE: Ces amorces seront utilisées dans une série de quatre cycles de réactions PCR pour générer des fragments PUF qui sont réunis ensemble ( figure 1 B ).
  2. Sélectionnez le site de reconnaissance du gène cible à proximité du site d'épissage alternatif.
    REMARQUE: Ce site peut être décidé par l'utilisateur, et il est habituellement choisi dans les 10 à 50 nt des sites d'épissures alternatives.
  3. Round 1: génère des séquences de codagepour 4 répétitions PUF, des fragments de pont universels, et des fragments de chapeau.
    1. Utilisez le site cible pour définir le code de reconnaissance pour chaque répétition de la mesure PUF. Sélectionner le jeu d'amorces de PCR pour PUF répète 1 - 8. Conduite quatre cycles consécutifs de PCR pour produire un domaine PUF personnalisé, comme décrit ci - dessous (Figure 1 B).
    2. Dans le premier cycle de PCR, mis en place des mélanges réactionnels de PCR standard (contenant 2,5 ul de tampon 10 x, 0,5 ul de 10 mM de dNTP, 0,5 ul de 10 uM amorces directe et inverse, 50 ng de la matrice d'ADN (vecteur ADNc humain ou expression de WT domaine PUF), et de l'ADN polymerase de haute fidélité 0,5 U dans un volume final de 25 uL).
      REMARQUE: Ces réactions produisent des séquences d'ADN correspondant à chaque répétition PUF, aux fragments de pont universelles, et deux fragments de chapeau avec des sites de restriction différents (figure 1 B). Une brève liste des modèles, des amorces, Et les produits de PCR générés utilisés à cette étape sont présentés dans le tableau 2 .
    3. Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 15 s à 72 ° C; Et 5 minutes d'incubation à 72 ° C. Utiliser une ADN polymérase haute fidélité pour minimiser les mutations ponctuelles pendant la PCR.
  4. Ronde 2: Générer des séquences de codage pour R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) et R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Séparer les produits de PCR obtenus à l'étape 1.3.3 en utilisant une électrophorèse avec un gel d'agarose à 1,5% (25 min à une tension constante de 120 V). Gel-purifier tous les produits de la taille attendue en utilisant un kit de purification de gel. Utilisez un mélange différent de ces produits comme modèle dans les cycles suivants de PCR.
      REMARQUE: mélanger les trois produits de PCR dans un rapport d'environ 1: 1: 1. Ils n'ont habituellement pas besoin d'être quantifiés, tant que l'intensité de chaque produit semble similaire dans le gel.
    2. Mélanger environ 5% des produits de PCR purifiés en tant queplaque dans le prochain cycle de PCR. En variante, quantifier les produits de PCR purifiés en utilisant un spectrophotomètre UV-Vis et en utilisant 15 ng de chaque produit de PCR dans le mélange de matrice.
    3. Utilisation des produits de PCR purifiés R1 / R2, R3 / R4 et Pont de 2/3 en tant que templates mixtes et R1-R4 et F-R comme amorces. Mettre en place la réaction PCR comme décrit à l'étape 1.3 pour obtenir le produit de PCR de chevauchement R1 - 4.
    4. Utilisation des produits de PCR purifiés R5 / R6, R7 / R8 et Pont de 6-7 en tant que modèles mixtes et R5 et R8-F-R comme amorces pour obtenir un produit de PCR se chevauchant R5-8 (Figure 1 B). Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 30 s à 72 ° C; et 5 min à 72 ° C. Gel-purifier R1-4 et R5-8.
  5. Cycle 3: générer des séquences de codage pour R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 sans bouchons).
    1. Au troisième tour de PCR, en utilisant la R1-4 purifiée, R5-8 et Pont de 4/5 en tant que modèles mixtes et R1-F etR8-R comme amorces, mettre en place la réaction de PCR comme décrit à l'étape 1.3 pour obtenir le produit de PCR R1-8 sans capsules.
    2. Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 55 s à 72 ° C; Et 5 min à 72 ° C. Gel-purifiez le R1-8 sans capsules.
  6. Ronde 4: génère des séquences de codage pour les domaines PUF complets.
    1. Dans le dernier cycle de PCR, en utilisant le R1-8 purifié sans capsules et les extrémités 5 'et les extrémités 3' comme modèles mélangés et Cap-F et Cap-R comme amorces, mettre en place la réaction PCR comme décrit à l'étape 1.3 Pour obtenir les derniers domaines PUF mutés.
    2. Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 1 minute à 72 ° C; Et 5 min à 72 ° C.
    3. Gel-purifiez les produits PCR des derniers domaines PUF reprogrammés. Utilisez ces produits pour la construction du plasmide d'expression ESF dans les étapes suivantes. Sequrence la construction finale pour vérifier les séquences reprogrammées de domaines MPU.
      REMARQUE: Cap-F code pour NLS (PPKKKRKV) entre BamH I et les sites Xba I et Cap-R code pour un codon d'arrêt et le site Sal I (sites de restriction ont été conçues pour la construction de vecteurs d'expression de SESF Figure 1 C).

2. Construction d'un module fonctionnel de sociétés d'ingénierie

  1. Deux stratégies sont couramment utilisées pour cloner des modules fonctionnels de ESF (domaines RS ou domaines Gly-riches): pour amplifier ces domaines par PCR en utilisant l'ADNc humain total comme matrice (étape 2.2) ou de synthétiser directement les fragments d'ADN qui codent pour différentes RS ou domaines Gly-riches (étape 2.3).
  2. Utilisation de PCR pour cloner les domaines RS à partir des résidus 123 - 238 de 9G8 (NP001026854), les résidus 180-272 de SRP40 (NP008856), ou des résidus 117 - 221 de SC35 (NP003007). Cloner les domaines Gly-riches à partir des résidus 195-320 de hnRNP A1 (NP_002127), résidus 203-353 de hnRNP A2 (NP112533), ou des résidus 211 - 378 de hnRNP A3 (NP919223).
    1. Utiliser l'outil de conception d'amorce NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ou Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) pour concevoir des amorces pour le clonage de domaines ou de domaines RS Gly-riche (module fonctionnel de SESF).
      NOTE: L'amorce avant contient une balise FLAG N-terminal après le site Nhel. L'amorce inverse contient un site BamH I pour le clonage dans des vecteurs d'expression (Figure 1 C).
    2. Mettre en place la réaction PCR standard, comme décrit à l'étape 1.3, pour amplifier la RS ou les domaines Gly riches. Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 30 s à 72 ° C; et 5 min à 72 ° C.
  3. Clone domaines RS ou domaines Gly-riches par synthèse directe de l'ADN. Au lieu de générer des produits de PCR qui codent pour les domaines effecteurs à l'étape 2.2, syntheTaille un oligonucléotide qui code pour un domaine RS à fragment court (RSRSRSRSRSRS) ou un domaine riche en Gly (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) en utilisant une source commerciale d'oligonucléotides d'ADN.

3. Construction de plasmides d'expression ESF

  1. Construire des plasmides d'expression ESF en utilisant n'importe quel vecteur d'expression.
    NOTE: Une construction d'expression pGL-Gly-MS2 (un cadeau du Dr R. Breathnach de l'Institut de Biologie-CHR 11 ) a été utilisée à l'origine, qui code du N au C-terminal, un épitope FLAG, un Gly Domaine riche en hnRNP A1 et protéine de couche de MS2. Par conséquent, cette construction d'expression est utilisée comme exemple dans l'étape suivante.
    REMARQUE: D'autres vecteurs d'expression avec plusieurs sites de clonage peuvent également être utilisés, et les étapes de clonage standard seront appliquées pour joindre les fragments ensemble.
  2. Digérer 1,5 μg des plasmides d'expression (pGL-Gly-MS2) mentionnés à l'étape 3.1 pour éliminer le fragment de protéine de l'enveloppe MS2. Utilisez la restrictiontion endonucléases BamH I et Sal I pendant 1 heure à 37 ° C. Digérer le module de reconnaissance de ESF (codant pour une SLN et reprogrammé domaines PUF, générés à l' étape 1.5) avec BamH I et Sal I dans le même état.
  3. Ajouter le colorant 5x de chargement à la digestion de restriction et des réactions lentement l'électrophorèse du volume total d'un gel d'agarose à 1,5% contenant un colorant de gel d'ADN pendant 40 min à 120 V. Gel-purifier les produits de digestion.
  4. Préparer 10 ul des réactions de ligature avec un module de reconnaissance d'inserts purifiés du FSE et expression d'ADN de vecteur dans un rapport de 3: 1, 1 ul de ligase d'ADN, et 1 ul de 10 x tampon de ligature. Incuber les réactions de ligature durant la nuit à 4 ° C; La construction résultante exprime un FSE de type Gly-PUF (PGL-Gly-PUF) sous le contrôle d'un promoteur du CMV (figure 1 C).
  5. Retirez le fragment codant pour le FLAG / domaine Gly riche avec Nhe I et BamH digestion pendant 1 h à 37 ° C. Remplacez-le par un fragment qui encode le domaine RS (généré à l'étape 2.2, également digéré par Nhe I et BamH I); La construction résultante exprime un ESF RS-PUF ( Figure 1 C ).

4. Construction du Reporter d'épissage

  1. Synthétiser des oligonucleotides contenant les séquences candidates ( c.-à-d. Des séquences cibles de domaines PUF) flanqués par des sites Xho I et Apa I ou des sites Xho I et EcoR I. Recueillir les oligonucléotides pendant 5 min à 55 ° C pour obtenir des inserts bicaténaires contenant les sites de reconnaissance des domaines PUF flanqués par les extrémités cohésives des sites Xho I et Apa I ou Xho I et EcoR I.
  2. Commencez par un éditeur d'épissage modulaire 22 décrit précédemment, pGZ3, qui contient deux exons GFP séparés par un exon de test (exon 12 de l'IGF2BP1 humain, Ensembl ID ENSG00000159217) et ses introns flanquant.
    NOTE: L'exon d'essai a été conçu avec des sites Xho I et Apa I, qui peuvent être utilisés pour insérer des oligonucléotides synthétisés contenant les séquences candidates (séquences cibles de domaines PUF). Ce journaliste de raccordement modulaire (pGZ3) est assurée par le dépôt de plasmide Add-gène.
  3. Digérer le reporter de base pGZ3 (préparé à l' étape 4.2) avec la restriction Xho I et Apa I endonucléases pendant 1 h à 37 ° C.
  4. Gel-purifier les produits de digestion tel que décrit dans l'étape 3.3.
  5. Préparer 10 ul de réactions de ligature avec les inserts à double brin générées à l'étape 4.1 et le vecteur pGZ3 digéré généré à l'étape 4.4 dans un rapport de 3: 1 molaire, 1 ul de ligase d'ADN, et 1 ul de 10 x tampon de ligature. Incuber les réactions de ligature durant la nuit à 4 ° C pour obtenir le vecteur rapporteur épissage CONSTRUCTION pGZ3.
  6. Insérer les inserts à double brin générées à l'étape 4.1 dans le déjàLes reporters publiés, pEZ-1B (utilisant les sites Xho I et EcoR I) et pEZ-2F (utilisant les sites Xho I et Apa I) 23 , pour obtenir le journaliste 5 'ss concurrent et le journaliste 3' ss concurrent, comme décrit par les étapes 4.3-4.5.
    REMARQUE: Les deux types de journalistes d'épissage seront disponibles via Add-gene.

5. Construction de vecteurs d'expression lentiviraux pour ESF

  1. Mettre en place la réaction de PCR standard comme décrit à l'étape 1.3 pour amplifier les ESF à pleine longueur à partir des vecteurs d'expression originaux (pGL-Gly-PUF ou pGL-RS-PUF) avec des amorces contenant des sites Mlu I / Spe I. Réglez le programme de PCR comme suit: 5 min à 95 ° C; 28 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C et 1,5 min à 72 ° C; Et 5 min à 72 ° C.
  2. Grâce à une réaction de digestion, une purification du gel et une réaction de ligature, intégrer les ESF dans le vecteur d'expression lentiviral, pWPXLd, entre les Mlu I / sites Spe I, tel que décrit dans les étapes 3.2-3.4.
  3. Utiliser la méthode standard de précipitation au phosphate de calcium, comme indiqué précédemment 24, pour générer les lentivirus par cotransfection des cellules HEK293T en conditionnant les vecteurs, psPAX2 et pMD2.G, soit avec pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF ( en poids) (en tant que témoin de spécificité), ou pWPXLd-GFP (mock).
    1. Graine 5x10 6 cellules HEK293T dans 10 cm vaisselle et faire croître les cellules pendant une nuit dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Fetal Bovine Serum (FBS) par boîte dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 . Effectuer la transfection lorsque les cellules sont 70-90% confluentes.
    2. Préparer le mélange de plasmide en ajoutant les trois plasmides (7,5 pg du vecteur d'emballage, psPAX2; 2,5 ug de pMD2.G, et 10 ug de chaque pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (en poids) ou pWPXLd-GFP) dans un tube de 2 ml.
    3. Ajouter 560 ul de 0,25 M CaCl2 et 560 μL de solution 2x BBS au tube de 2 ml. Mélanger doucement plusieurs fois et l'incuber pendant 15 minutes à la température ambiante pour préparer le mélange de transfection.
    4. Ajouter tous les mélanges de transfection aux plats de 10 cm. Faire tourner doucement la vaisselle et les incuber pendant une nuit à 3% de CO 2 et à 37 ° C.
    5. Retirer le milieu, ajouter 10 mL de DMEM frais avec 2% de FBS à chaque plat et les incuber à 10% de CO 2 et 37 ° CO / N.
    6. Retirer le premier surnageant de la vaisselle. Ajouter 10 mL de DMEM frais avec 2% de FBS dans chaque plat. Incuber les plats O / N à 10% de CO 2 et 37 ° C. Conserver le surnageant à 4 ° C.
    7. Recueillir le deuxième surnageant de la vaisselle. Reposez le surnageant des première et deuxième récoltes. Effacez le surnageant des débris cellulaires en le filtrant à travers un filtre de 0,4 μm. Utilisez directement le surnageant nettoyé ou rangez-le à -80 ° C.
  4. Déterminer le titre du lentivirus en infectant HEK2Cellules 93T avec des dilutions successives de la préparation du virus, comme indiqué précédemment 25.

6. Plus précisément modulante Exon l'inclusion et l'utilisation alternative des sites Splice avec ESF

  1. Graine 2 x10 5 cellules HEK293T dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. Cultiver les cellules pendant une nuit dans 500 pi de DMEM supplémenté avec 10% de FBS dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Mélanger le réactif de transfection liposomale en retournant doucement les flacons avant utilisation. Diluer 2 uL de réactif de transfection liposomale dans 50 ul de milieu de sérum réduit. Mélanger doucement et les incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
  3. Diluer 0,04 pg de vecteurs d'expression PGL-Gly-PUF et 0,2 pg de plasmides rapporteurs pGZ3 dans 50 ul de milieu sérique réduit dans un tube stérile. Diluer 0,4 pg de vecteurs PGL-RS-PUF expression et 0,2 pg de plasmides rapporteurs pGZ3 dans 50 ul de milieu sérique réduit dans un tube stérile. réIlle 0,4 μg de vecteurs d'expression pGL-RS-PUF et 0,2 μg de plasmides rapporteurs pEZ-1B ou pEZ-2F dans 50 μL de milieu sérique réduit dans un tube stérile.
  4. Après 5 min d'incubation à la température ambiante, mélanger doucement le réactif de transfection liposomique dilué préparé à l'étape 6.2 avec les plasmides dilués préparés à l'étape 6.3. Incuber le mélange pendant 20 min à la température ambiante.
  5. Ajouter l'ensemble des mélanges de transfection contenant les vecteurs d'expression et le réactif de transfection préparés à l'étape 6.4 dans chaque puits et incuber pendant au moins 12 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 .
  6. Après 12 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 , jeter le milieu de chaque puits et les laver avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) / puits.
  7. Jeter le PBS et ajouter 200 μL de trypsine à chaque puits. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 min. Ajouter 1 ml du milieu pour arrêter le digestion et le transfert des cellules à un tube stérile de 1,5 ml.
  8. Centrifuger les tubes pendant 3 min à 5000 xg et jeter le support. Ajouter 0,5 ml de tampon d'extraction d'ARN par tube à lyser les cellules par pipetage répétitif. Incuber les échantillons homogénéisés pendant 5 min.
  9. Pour chaque échantillon traité de tampon d'extraction d'ARN, ajouter 0,1 ml de chloroforme par 0,5 ml de tampon d'extraction d'ARN. Inverser les tubes pendant 15 s et de les laisser incuber pendant 3 minutes à température ambiante.
  10. Centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 12 000 x g et 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un tube frais. Ajouter 0,25 ml d'isopropanol par 0,5 ml de tampon d'extraction d'ARN utilisés pour l'homogénéisation initiale.
  11. Mélanger par tourbillonnement et de les incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger les tubes à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Après centrifugation, le précipité d'ARN est généralement visible sur le fond du tube.
  12. Jeter le surnageant et laver le culot d'ARN avec 0,5 ml d'éthanol à 75% par 0,5 ml de tampon d'extraction d'ARN.
  13. Vortex vigoureusement et centrifuger à 7500 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher le culot d'ARN. Dissoudre l'ARN dans 50 ul d'eau exempte de RNases.
  14. Ajouter 2 ul de 5 U / pl de DNase I, 7 pi de tampon 10 x, et 11 ul de H 2 O pour chaque solution d' ARN de 50 uL. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 1 h. les chauffer à 70 ° C pendant 15 minutes pour inactiver la DNase.
  15. Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants dans un tube exempt de nuclease 0,2 mL: 1 ul de 50 uM d'oligo dT, 5 ul de 400 ng / ul d'ARN (2 ug), 1 pl de dNTP 10 mM et 3 pl de H 2 O. Effectuer la PCR inverse.
    1. Chauffer le mélange à 65 ° C pendant 5 minutes et laisser incuber sur de la glace pendant au moins 2 min pour empêcher la reformation de la structure secondaire. Ajouter les éléments suivants dans le même tube: H 2 de 4 pi de 5x tampon premier brin, 1 ul de DTT 0,1 M, 1 ul de 200 U / ul de transcriptase inverse, et 4 ul </ Sub> O. Mélanger en pipetant doucement vers le haut et vers le bas et incuber à 50 ° C pendant 60 minutes. Arrêtez la réaction en la chauffant à 70 ° C pendant 15 min.
  16. Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de PCR pour compléter la PCR marquée par le corps: 2,5 μl de 10x de tampon de PCR, 0,5 μL de mélange de dNTP 10 mM, 1 μL d'amorce directe de 10 μM, 1 μL de 10 μM Amorce inverse, 0,25 μl d'ADN polymerase Taq 5 U / μL, 0,5 μL de Cy5-dCTP 25 nM et 2 μl de l'ADNc préparé à l'étape 6.15.
    1. Chauffer la réaction à 94 ° C pendant 2 min pour dénaturer les molécules, effectuer 25 cycles de PCR (94 ° C pendant 30 s, 60 ° C 30 s et 72 ° C 30 s), maintenir la réaction à 72 ° C pour 7 min, puis laissez-le à une prise de 4 ° C.
  17. Résoudre les produits PCR par électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide à 10% avec un tampon 1x Tris, un acide borique et un tampon EDTA (TBE). Effectuez une analyse à l'aide d'un scanner à fluorescence. Mesurer lle montant de chaque isoforme d'épissage à l'aide d'un logiciel d'densitométrie.

7. Utilisez FSE Moduler Endogène Splicing Bcl-x et mesurer ses effets sur Apoptose

  1. Planche 2 x 10 5 cellules HeLa à chaque puits d'une plaque à 24 puits. Cultiver les cellules pendant une nuit dans 500 pi de DMEM supplémenté avec 10% de FBS dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Après 12 h, transfecter les cellules avec 2 pg de PGL-Gly-PUF (WT) ou 0,2 pg, 1 pg et 2 pg de PGL-Gly-PUF (531) (un domaine PUF reprogrammée qui reconnaît Bcl-x pré- ARNm avec une affinité élevée, voir la figure 2 A).
  3. 24 h plus tard, récolter les cellules. 1/3 des cellules sont pour l'isolement de l'ARN et l'analyse par PCR (étapes 06.08 à 06.17) et 2/3 sont pour l'isolement de la protéine.
  4. Pour l'analyse par transfert de Western, faire bouillir les culots cellulaires totales dans 2X dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) du tampon de charge pendant 10 minEt ensuite résoudre les protéines dans un gel 12% SDS-PAGE. Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose.
  5. Bloquer la membrane avec du lait à 5% pendant 1 h à température ambiante et laisser incuber la membrane O / N avec Caspase-3 (1: 1000), la PARP (1: 1000) ou la bêta-actine (1: 5000) d'anticorps primaire (dilué dans 5% de lait) à 4 ° C.
  6. Laver la membrane avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20 (PBS-T) pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur 3x bascule. Incuber la membrane avec des anticorps liés à la HRP (1: 5000, dilué dans 5% de lait) pendant 1 h à température ambiante.
  7. Laver la membrane avec du PBS-T 3x à la température ambiante, puis développer la membrane en utilisant des réactifs de détection buvard Western ECL.
  8. Ajouter 250 ul de poly-L-lysine (PLL) sur des lamelles, les incuber pendant 15 min à température ambiante, et siphonner le liquide. Laver les lamelles de verre revêtues PLL avec du PBS 3 x pendant 5 minutes chacune. Pour le test d'immunofluorescence mesure de l' apoptose, la graine 5 x 10 5 cellules HeLa sur des lamelles de verre revêtues de poly-lysine dans une plaque à 6 puits. p transfecterGL-Gly-PUF (WT) ou PGL-Gly-PUF (531) les plasmides dans des cellules HeLa en utilisant un réactif de transfection liposomale (voir les étapes 6.1 - 6.5).
  9. 24 h après la transfection, fixer les cellules sur les lamelles avec 1 ml de paraformaldehyde à 4% (PFA) dans 1 x PBS pendant 20 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique; le manipuler avec soin dans une hotte.
  10. Lavez délicatement les cellules sur les lamelles en ajoutant 2 ml de PBS 1x. les Incuber pendant 5 min. Retirez le PBS avec pipettes. Répétez le lavage 3x.
  11. Perméabiliser les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X pendant 10 min, puis les laver 3 fois avec PBS 1x.
  12. Bloquer les cellules avec 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS 1x pendant 10 min et les laver 3 fois avec PBS 1x.
  13. Diluer l'anticorps FLAG 1: 1000 dans BSA à 3% / PBS et on pipette 30 ul de l'anticorps FLAG dilué sur une feuille de parafilm.
  14. Retirez la lamelle avec les cellules, séchez soigneusement le tampon en excès avec des lingettes de laboratoire, et le mettre à l'envers (côté de la cellule vers le bas) sur les 30 pi anti-FLAG solution. Incuber pendant 1 h à TA.
  15. Ajouter environ 500 ul de PBS 1x sur le côté de la lamelle couvre-incubées avec l'anticorps primaire jusqu'à ce que la lamelle couvre-objet flotte au-dessus de la solution. Retour à la plaque à 6 puits avec 1 x PBS dans les puits.
  16. Le laver 3 fois avec 1 x PBS pendant 5 minutes chacune.
  17. Diluer l'anticorps secondaire anti-souris (1: 500) dans 3% de BSA / PBS; à nouveau, utiliser 30 pi pour chaque lamelle. Mettre la tête en bas de la lamelle couvre-objet sur la solution d'anticorps secondaire et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  18. Enlever les lamelles du parafilm, comme décrit à l'étape 7.15. Remettez-le dans la plaque de 6 puits et laver avec du PBS 1x 3x pendant 5 minutes chacun.
  19. Monter les lamelles avec un milieu de montage (avec DAPI), éliminer le milieu en excès, et sceller le bord de vernis à ongles.
  20. Visualisez les cellules en utilisant un microscope à fluorescence (à un grossissement 100X) et les photographier à l'aide d'un appareil photo numérique.
    NOTE: L'expression du FSE est visualisée par la fluorescence labeled anticorps secondaire contre l'étiquette FLAG, et la fragmentation nucléaire est visualisés à l'aide DAPI.

8. Mesurer l'apoptose des différentes cellules cancéreuses exprimant ESF

  1. Diviser 2 x 10 6 cellules HeLa, des cellules MDA-MB-231 et les cellules A549 dans des boîtes de 60 mm avec 4 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pour détecter l' apoptose avec propidium Iodide (PI) coloration.
  2. 24 h plus tard, actualisez le moyen et préparer le lentivirus, comme précédemment rapporté 24.
  3. Diluer 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), ou des stocks pWPXld-GFP dans 4 ml de milieu frais pour faire le rapport du virus au nombre de cellules égal à 5.
  4. Changer le milieu dans les plaques à 4 ml de milieu contenant le virus préparé à l' étape 8.3 et incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. 12 h après l'infection, changer le milieu.
  5. Après 24 h d'infection, de recueillir et colorer les cellules pendant 5 min dans une solution de PBS contenant une concentration finale de 2 ug / ml PI.
  6. Analyser les cellules colorées PI avec un cytomètre de flux, comme décrit précédemment 16.

Résultats

Ce rapport décrit le protocole complet pour la conception et la construction de journalistes et de sociétés d'ingénierie épissage. Il présente également la nouvelle application de SESF manipuler l'AS de gènes endogènes 16. Pour illustrer les résultats typiques des changements d'épissage FSE médiation, nous utilisons les données de nos travaux antérieurs à titre d'exemple. SESF avec différents domaines fonctionnels peuvent être util...

Discussion

Ce rapport fournit une description détaillée de la conception et la construction de facteurs d'épissage artificiels qui peuvent manipuler spécifiquement l'épissage alternatif d'un gène cible. Ce procédé met à profit le mode de liaison unique de l'ARN de PUF répète pour produire un échafaudage de liaison à l'ARN avec une spécificité personnalisée. Il peut être utilisé pour activer ou réprimer épissage.

L'étape critique dans ce protocole est la gén...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par subvention du NIH R01-CA158283 et NSFC accorde à 31.400.726 ZWYW est financé par le programme Jeunes Talents Mille et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 31471235 et 81422038). XY est financé par la fondation scientifique post-doctorale de la Chine (2015M571612).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR bufferNew England BiolabsM0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase)New England BiolabsM0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)Invitrogen11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM)Gibco31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)ambion15596018TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x)Life Technologies10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)Invitrogen18080044
Caspase-3 antibodyCell Signaling Technology9668
PARP antibodyCell Signaling Technology9542
Bcl-x antibodyBD Bioscience610211
beta-actin antibodySigma-AldrichA5441
alpha-tubulin antibodySigma-AldrichT5168
FLAG antibodySigma-AldrichF4042
Nitrocellulose membraneAmersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting detection reagentsInvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS)BD BioscienceFACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)GE HealthcareSH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen26140079
Propidium iodide (PI)SigmaP4170
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
Poly-L-Lysine SigmaP-4832Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLdAddgene12258
Vector pMD2.GAddgene12259
Vector psPAX2Addgene12260
DNase I (RNase-free)New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 PrimerThermo ScientificSO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)Cell Signaling Technology7076S

Références

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