Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Résumé

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Résumé

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) sont les plus importantes cellules présentant des antigènes les spécialisés de notre système immunitaire. Immature PED (iDC) réside dans la peau ou dans les tissus des muqueuses et sont donc parmi les premières cellules immunitaires d'interagir avec les agents pathogènes envahisseurs. PED représentent le pont entre l'inné et le système immunitaire adaptatif ^1, car ils peuvent activer des réponses T et des cellules B suite à la détection d'agents pathogènes. En outre, elles contribuent à la réponse immunitaire pro-inflammatoires en raison de la sécrétion de grandes quantités de cytokines, comme l'IL-1β, IL-6 et IL-12. DC activer également les cellules NK et d'attirer d'autres cellules immunitaires vers le site de l'infection par le chimiotactisme.

Les CD peuvent être divisés en cellules dendritiques immatures (iDC) et des cellules dendritiques matures (MDC) ² en fonction de leur morphologie et de la fonction. Après la reconnaissance d'antigènes étrangers par l' un des nombreux récepteurs de reconnaissance des formes (par exemple, des récepteurs de type Toll, du type Cdes lectines, des récepteurs ou complément) abondamment exprimé sur la surface cellulaire, iDC subissent des changements importants et commencent à arriver à maturité. Au cours de ce processus de maturation, des récepteurs pour l' antigène de capture sont régulés à la baisse, tandis que les molécules essentielles à la présentation de l' antigène sont régulés à la hausse ^3. Les DC matures réguler à la hausse les complexes majeurs d'histocompatibilité I et II (CMH I et II), les molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86, qui sont essentiels pour la présentation des antigènes et l'activation des lymphocytes T. En outre, l'expression de CCR7 des récepteurs de chimiokines sur la surface cellulaire est induite, ce qui permet la migration des CD à partir des tissus périphériques vers les ganglions lymphatiques. La migration est favorisée par le "rolling" des DC le long d' un ligand de chimiokine 19 (CCL19 / MIP-3b) et un ligand de chimiokine 21 (CCL21 / SLC) Gradient aux ganglions lymphatiques ^4-6.

Après la migration, mDCs présentent l'antigène traité pour naïfs cellules CD4 ⁺ et CD8 ⁺ T, ainsi ininégo- une réponse immunitaire adaptative contre l'envahisseur pathogène ^7. Cette interaction avec des cellules dans les ganglions lymphatiques T est également associé à la propagation du virus ^8. D' autres études in vitro ont révélé que les PED efficacement la capture et le transfert du VIH aux lymphocytes T et que cette transmission se traduit par une infection vigoureuse ^9-12. Ces expériences mettent en évidence que in vivo du VIH exploite les PED comme des navettes de la périphérie vers les ganglions lymphatiques. Lors de la présentation de l'antigène, les CD sécrètent des interleukines clés qui façonnent la différenciation des cellules T auxiliaires effectrices, et par conséquent, les résultats de l'ensemble de la réponse immunitaire contre le microbe est déterminé à cette interaction très. En plus de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2) effectrices des cellules T, d' autres sous - ensembles de cellules CD4 ⁺ T auxiliaires (par exemple, le type 17 (Th17) et le type 22 (cellules TH22) T) ont été décrits, et leur induction et fonction ont été étudiés à fond. DC sont en outre impliqués dansla génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) ^13,14. Ces cellules sont immunosuppresseur et peuvent arrêter ou réguler négativement l'induction ou la prolifération des cellules T effectrices et sont donc essentiels pour le développement de l'immunité et la tolérance.

DC classiques humaines (CDCS) comprennent plusieurs sous - ensembles de cellules ayant une origine myéloïde (ie, les cellules de Langerhans (LCS) et cutanée et DC interstitiels) ou une origine lymphoïde (ie, les DC plasmacytoïdes (pDC)). Pour les expériences in vitro ou des stratégies de vaccination DC, les DC dérivées de monocytes sont couramment utilisés comme modèle pour les PED dermiques. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction de cellules dendritiques myéloïdes classiques. Elles sont produites par l'addition d'interleukine 4 (IL-4) et granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , les monocytes isolés à partir de donneurs sains ^12,15-18. Les cellules dendritiques peuvent également être directement isolés à partir de biopsies cutanées ou des muqueuses, ou peut même be développé à partir de cellules CD34 ⁺ progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d' échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero. Ici, nous montrons comment les monocytes sont isolés et stimulés du sang humain anticoagulé après que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) enrichissement par centrifugation en gradient de densité. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains dans des conditions spécifiques sont différenciées en iDC et sont prêts pour les procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

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Protocole

déclaration éthique: le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants donneurs de sang par l'Institut central de transfusion sanguine et Département Immunological, Innsbruck, Autriche. L'utilisation d'échantillons de restes anonymes à des fins scientifiques a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale d'Innsbruck.

1. Enrichissement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP)

1. La concentration des PBMC par centrifugation.
   1. Ouvrez la poche de sang et le sang fendu dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles selon la quantité de sang reçu.
   2. Si nécessaire, ajuster le volume à 50 ml pour chaque tube avec tampon phosphate salin stérile de Dulbecco (D-PBS).
   3. Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les à 400 xg pendant 15 min à température ambiante (RT) sans frein.
   4. Soutirer la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant le boundarcouche y undisturbed.
      NOTE: Si le plasma autologue au lieu de FCS est utilisé pour compléter le milieu de culture, le plasma doit être recueilli et inactivé par la chaleur dans cette étape.
   5. Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) de deux tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans un tube stérile de 50 ml en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
   6. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube en utilisant stérile D-PBS.
   7. Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les 400 g pendant 15 min à température ambiante sans frein.
   8. Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche limite non perturbée.
   9. Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) des tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans deux tubes de 50 ml de collecte stériles en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
   10. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS.
2. Séparationdes PBMC par centrifugation à gradient de densité (figure 1).
   1. Préparer quatre tubes de 50 ml et la pipette 15 ml de milieu de gradient de densité dans chaque tube.
   2. Prélever 25 ml de cellules / sang commun du tube de collecte (étape 1.1.10) et recouvrir soigneusement le milieu de gradient de densité.
   3. Placer les tubes dans une centrifugeuse et de spin eux à 700 xg pendant 30 min à température ambiante sans frein.
3. Collecte et purification de CMSP.
   1. Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche PBMC intacte.
   2. Collecter l'interphase PBMC de tous les tubes et mettre en commun les cellules dans deux stériles tubes de 50 ml en utilisant une pipette de 25 ml sérologique stérile.
   3. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 400 g eux pendant 15 min à 4 ° C avec le frein.
   4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans du PBS stérile D. Réunir les cellules des deux tubes et ajuster le volume à 50 ml avec stérile D-PBS.
   5. Placer les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
   6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du D-PBS stérile. Ajuster le volume à 50 ml avec du PBS stérile et D-pipette 50 ul d'un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS.
   7. Vortex du tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre Neubauer ou tout autre instrument de comptage cellulaire.
   8. Placer les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.

2. Isolement des monocytes par particules magnétiques CD14 anti-humain

1. Étiquetage des CMSP avec des particules magnétiques.
   1. Ajuster la concentration des PBMC à 8 x 10 ⁷ cellules / ml en utilisant un tampon d'isolement.
   2. Vortex les particules magnétiques CD14 anti-humain thoroughly et ajouter 50 ul de particules pour chaque 1 x 10 ⁷ PBMC.
   3. Mélanger la suspension cellulaire de particules à fond et incuber à température ambiante pendant 30 min.
2. Séparation des fractions positives et négatives.
   1. Réglez le volume jusqu'à 12 ml en utilisant un tampon d'isolement.
   2. Préparer six tubes à fond rond stériles et pipette 2 ml de la suspension cellulaire particules dans chaque tube.
   3. Placer immédiatement les tubes sur l'aimant. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
   4. Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
   5. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement.
   6. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
   7. Placer les tubes de retour sur l'aimant. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
   8. Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
   9. Retirer les tubes de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement à chaque tube. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
   10. Transférer la fraction positive à un tube stérile de 50 ml et ajuster le volume à 50 ml en utilisant stérile D-PBS.

3. La stimulation des monocytes isolés avec l'IL-4 et GM-CSF

1. Placer le tube dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ml de D-PBS.
3. Introduire à la pipette 50 ul dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. Vortexer le tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre de Neubauer ou d'un autre instrument de comptage de cellules.
4. Placer le tube de 50 ml dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
   NOTE: Si la fraction négative, contenant des lymphocytes du sang périphérique (PBL), est également nécessaire, effectuer le lavage et le comptage des étapes similaires à ttuyau de la fraction positive (étapes 3.1-3.5).
5. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 ⁶ / ml avec un milieu de culture préchauffé (milieu RPMI 1640 complété avec une solution à 10% de L-Glutamine inactivé à la chaleur et SBF à 1%) et de la pipette 3 ml / puits dans des plaques à 6 puits.
   NOTE: Si vous utilisez du plasma autologue inactivé à la chaleur, remplacer le FCS avec 1-5% de plasma autologue à 10%, selon le montage expérimental.
6. Stimuler les monocytes avec IL-4 humaine recombinante (250 U / ml) et GM-CSF humain recombinant (1000 U / ml) par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. Incuber à 37 ° C et 5% de CO _2.
7. Re-stimuler les cellules avec l'IL-4 (250 U / ml) et GM-CSF (1000 U / ml) après 48 heures par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture.
   NOTE: S'il y a des signes d'acidification indiqués par l'indicateur de pH dans le milieu, remplacer la moitié du milieu avec un milieu de culture préchauffé.
8. Récolte des cellules dendritiques immatures au jour 5 pouren aval des expériences de pipetage des cellules cultivées sur la plaque de 6 puits et dans un tube centrifuge de 50 ml après pipetage le milieu de culture et à quelques reprises.
9. Compter les cellules et colorer un échantillon de monocytes isolés avec des anticorps anti-CD11b humain contre, CD11c et DC-SIGN / CD209, conjointement avec un colorant de viabilité cellulaire. Afin d'éviter une liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration de surface, l'utilisation du récepteur Fc de réactifs de blocage ou d'albumine de sérum bovin (BSA) tampons est fortement recommandée.
10. Analyser l'échantillon en utilisant le colorant de viabilité des cellules, selon le protocole du fabricant, en effectuant une cytométrie de flux pour évaluer la pureté et la viabilité des iDC générés.

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Résultats

Après centrifugation du sang anticoagulé à l' aide d' un coussin de saccharose, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) sont enrichis en une interphase au - dessus du milieu de gradient de densité (figure 1). Une fois que les PBMC sont soutirés, l' analyse FACS est effectuée pour caractériser les différentes populations de cellules dans les PBMC en utilisant des marqueurs de la lignée (par exemple, CD3 pour les lymphocytes...

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Discussion

Ce protocole décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes (MDDC) l'isolement des monocytes humains du sang anticoagulé à l'aide d'un dosage à base de nanoparticules magnétiques. Dans ce protocole, les étapes de centrifugation sont effectuées en amont de la procédure d'isolement des cellules, ce qui conduit à un enrichissement de la fraction des CMSP. Bien que les cellules sont perdues au cours de la centrifugation, pour recouvrir le contenu de tout un paquet de sang su...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020