Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Résumé

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Résumé

Des études sur les protéines membranaires intégrales in vitro sont souvent compliquées par la présence d'un domaine transmembranaire hydrophobe. Pour compliquer encore ces études, réincorporation des protéines membranaires détergent solubilisé dans des liposomes est un processus stochastique où la protéine topologie est impossible à appliquer. Cet article propose une méthode alternative à ces techniques difficiles qui utilise un échafaudage à base de liposomes. La solubilité des protéines est améliorée par deletion du domaine transmembranaire et les acides aminés sont remplacés par un fragment d'attache, telle qu'une étiquette His. Cette attache coopérant avec un groupe d' ancrage (Ni ²⁺ coordonné par l' acide nitrilotriacétique (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ pour les protéines à marquage His), qui applique une topologie de protéine homogène à la surface du liposome. Un exemple est présenté dans lequel l'interaction entre la protéine apparentée à Dynamin-1 (DRP1) avec une protéine membranaire intégrale, le facteur mitochondrial Fission (MFF) est investigated utilisant cette méthode échafaudage liposome. Dans ce travail, nous avons démontré la capacité de MFF de recruter efficacement DRP1 soluble à la surface des liposomes, ce qui a stimulé son activité GTPase. En outre, DRP1 a pu tubulé le modèle lipidique MFF-décoré en présence de lipides spécifiques. Cet exemple démontre l'efficacité des liposomes d'échafaudage en utilisant des analyses structurales et fonctionnelles et met en évidence le rôle de la CFP dans la régulation de l'activité DRP1.

Introduction

L' étude des interactions protéine-protéine membrane proximal est une entreprise difficile en raison de la difficulté à récapitulant l'environnement natif des protéines membranaires intégrales impliquées ^1. Ceci est dû à la nécessité de solubilisation avec un détergent et de l'orientation non uniforme des protéines dans des protéoliposomes. Afin d'éviter ces problèmes, nous avons utilisé une stratégie selon laquelle les domaines solubles de protéines membranaires intégrales sont exprimés sous forme de protéines de fusion His-tag, et ces fragments solubles sont ancrés à des liposomes de l' échafaudage par des interactions avec le NTA (Ni ²⁺⁾ , les groupes de tête au lipide surface. L'utilisation de ces échafauds, les interactions entre protéines lipides proximal peuvent être étudiés sur une gamme de compositions de lipides et de protéines.

Nous avons effectivement appliqué cette méthode pour étudier les interactions protéine-protéine critiques qui régissent l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et examiner les interactions lipidiques qui modulent cette processus ^2. Lors de la fission mitochondriale, une protéine de remodelage de la membrane conservée, appelée protéine apparentée Dynamin-1 (DRP1) ^3, est recruté à la surface de la mitochondriale externe membrane (OMM) en réponse à des signaux cellulaires qui régulent l' homéostasie énergétique, la signalisation apoptotique, et plusieurs autres processus mitochondriales intégrés. Cette grande GTPase cytosolique est recruté à la surface des mitochondries par des interactions avec les protéines intégrales OMM ^{4 - 8.} Le rôle d'une telle protéine, mitochondriale Fission Factor (MFF), a été difficile à élucider en raison d'une faible interaction apparente avec DRP1 in vitro. Néanmoins, les études génétiques ont clairement démontré que MFF est essentiel pour le succès de mitochondrial fission ^7,8. La méthode décrite dans ce manuscrit a été en mesure de remédier aux lacunes précédentes en introduisant des interactions lipidiques simultanées qui favorisent les interactions DRP1-MFF. Dans l'ensemble, ce nouveau test REVEAconduit les interactions fondamentales guidant l'assemblage du complexe de fission mitochondriale et a fourni une nouvelle étape pour les études structurales et fonctionnelles en cours de cette machine moléculaire essentielle.

À ce jour, l' examen des interactions entre DRP1 et MFF ont été compliquées par la flexibilité inhérente du MFF ^9, l'hétérogénéité des DRP1 Polymères ^2,10, et la difficulté de la purification et la reconstitution pleine longueur MFF avec un domaine transmembranaire intact ^11. Nous avons abordé ces défis en utilisant des liposomes NTA (Ni ²⁺⁾ d'échafaudage pour reconstituer His-tagged MFF dépourvu de son domaine transmembranaire (MffΔTM-His _6). Cette stratégie a été avantageuse car MffΔTM était extrêmement soluble lorsque surexprimé dans E. coli, et cette protéine isolée a été facilement reconstituées sur des liposomes d'échafaudage. Quand attaché à ces modèles de lipides, MFF suppose un traitement identique, l'orientation tournée vers l'extérieur sur la surface de la membrane.En plus de ces avantages, les lipides mitochondriales, tels que la cardiolipine, ont été ajoutés pour stabiliser MFF pliage et son association avec la membrane ^11. Cardiolipine interagit également avec le domaine variable de ^2,12 DRP1 qui peut stabiliser cette région désordonnée et faciliter l' assemblage du mécanisme de fission.

Cette méthode robuste est largement applicable pour les futures études visant à évaluer les interactions entre protéines membranaires-proximal. Grâce à l'utilisation des interactions tethering / d'affinité supplémentaires, la sophistication de ces études de reconstitution de la membrane peut être améliorée pour imiter la complexité supplémentaire trouvée à la surface des membranes dans les cellules. Dans le même temps, les compositions lipidiques peuvent être modifiées pour mimer plus précisément les environnements d'origine de ces complexes macromoléculaires. En résumé, cette méthode fournit un moyen d'examiner les contributions relatives des protéines et des lipides dans la formation de morphologies membranaires au cours de proc cellulaire critiqueesses.

Protocole

1. Préparation de liposomes Échafaudage

NOTE: Idéalement, les premières expériences devraient utiliser un échafaudage relativement simple et monotone (composé de DOPC (1,2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine ou PC) et DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ (1,2-dioléoyl - sn - glycéro-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique) succinyl]. (sel de nickel)) Construction hors de ces expériences, la charge des lipides, la flexibilité et la courbure peut être introduit en tant que facteurs individuels avec la possibilité de modifier les interactions membranaires proximale. Ces modifications peuvent être obtenues en ajoutant des quantités déterminées de constituants lipidiques spécifiques, y compris la phosphatidylsérine ou la cardiolipine (CL), la phosphatidyléthanolamine (DOPE ou PE) ou galactosyle (β) céramide.

1. Combinez les lipides dissous dans du chloroforme dans un tube à essai en verre propre. On évapore le solvant avec de l'azote gazeux sec, tout en faisant tourner le tube pour former un mince film de lipide. Retirer le solvant résiduel avec un centrifugal 'évaporateur pendant 1 h à 37 ° C.
   REMARQUE: Différentes formulations de liposomes sont utilisées dans les protocoles décrits ci - dessous: liposomes d'échafaudage (3,3% en moles DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 96,7% en moles DOPC), les liposomes d'échafaudage avec la cardiolipine (% DGS-NTA (Ni ²⁺ 3,3 mole) / 10 mol% cardiolipine / 86,7 mol% DOPC), des liposomes d'échafaudage flexibles avec cardiolipine (3,3% en mole DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), et échafaudage enrichi liposomes (10% en moles DGS-NTA (Ni ^2+)% / 15 mole cardiolipine / 35% en moles de DOPE / 40% en moles DOPC).
2. Ajouter un tampon A (25 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic), KCl 150, pH ajusté à 7,5 avec du KOH) préalablement chauffée à 37 ° C de telle sorte que la concentration finale en lipide est de 1 - 2 mm. Incuber 30 min à 37 ° C avec un tourbillonnement occasionnel pour remettre en suspension complètement le mélange lipidique (figure 1a).
3. Transférer dans un tube à essai en plastique, placer le tube dans de l'azote liquide jusqu'à ce que complètement gelé (roughly 30 s) et placer dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à ce que complètement dégelé (environ 1 - 2 min). Répétez l' opération pour un total de 4 cycles de gel-dégel (figure 1b).
4. Préparer une extrudeuse de lipide par trempage 4 supports de filtre et un filtre en polycarbonate dans un tampon et l'assemblage de l'extrudeuse, conformément aux instructions du fabricant. Extruder la solution lipidique à travers le filtre 21 fois. Utiliser doux, une pression constante pour assurer une distribution de taille homogène (figure 1c).
   NOTE: Pour toutes les expériences décrites dans ce protocole, un filtre de 1,0 um de polycarbonate a été utilisé pour l'extrusion. L' interaction avec les lipides anioniques DRP1 peut être observée avec une variété de diamètres de liposomes allant de 50 nm à 400 nm ou supérieure à ^{12 13.} Par conséquent, la taille du filtre de 1 pm a été choisie pour être idéal pour les activité GTPase et pour la microscopie électronique. Si d' autres diamètres de liposomes sont souhaités, la préparation des vésicules géantes unilamellaires ^14,15 (de GUVs) ou petite unilamellar vésicules ¹⁶ (VUS) peuvent être utilisés. Diffusion de la lumière dynamique peut être utilisé pour évaluer liposome hétérogénéité de taille ^13.
5. Rangez liposomes extrudés à 4 ° C et jeter après 3-5 d.

2. Utilisation de Échafaudages Liposomes pour Protein Analyse Binding

1. La préparation des échantillons
   1. Incuber marquée par His MffΔTM (5 uM final) avec des liposomes d'échafaudage (40% en moles PC / 35 mol% PE / 15% en moles CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni ^2+); 50 uM finale) pendant au moins 15 min à la température ambiante dans du tampon A + BME (25 mM HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH ajusté à 7,5 avec du KOH). Pour un contrôle MFF-libre, incuber les liposomes avec un tag his protéine de contrôle (comme la GFP) pour lier et bouclier exposé NTA (Ni ^2+).
      NOTE: MffΔTM a été exprimé et purifié comme décrit dans une étude précédente ^2. GFP a été purifié d'une manière similaire, mais l'étape d'échange d'ions a été omise. BME a été nécessaire pour ces experiments parce DRP1 est sensible à l'oxydation, ce qui peut modifier ses propriétés d'activité et d'assemblage.
   2. Ajouter DRP1 (2 uM final) et on incube pendant 1 h à température ambiante.
      NOTE: DRP1 a été exprimé et purifié comme décrit dans une étude précédente ^2. Après incubation avec DRP1, l'effet de la liaison de la déformation de la membrane nucléotidique peut être étudiée par incubation d' une heure supplémentaire avec 2 mM de _MgCl2 et soit 1 mM GTP, 1 mM de GMP-PCP ou du tampon A + BME.
2. Négatif Stain microscopie électronique à transmission (EM) Analyse
   1. Transfert 5 pi d'échantillon à une feuille de film de laboratoire, et jeter une grille recouverte de carbone Cu / Rh sur l'échantillon. Incuber la grille 1 min sur l'échantillon, épongez loin l'excès de liquide sur du papier filtre, et transfert à une baisse de 2% d'acétate d'uranyle. Incuber 1 min, éponger l'excès de colorant sur du papier filtre, et transférer à une boîte de grille. Magasin sous vide O / N pour assurer la pleine dessiccation.
   2. Des échantillons de cette image au moyen d'un Microsc électronique à transmission,ope à 18.500 - 30,000X grossissement pour observer les changements ultrastructuraux en protéines et liposomes morphologies ^17.
      Remarque: les modifications ultrastructurales peuvent être quantifiés en utilisant un logiciel d'analyse d'images, tels que ImageJ ¹³ (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein décoration peut être mesurée par rapport aux modèles lipidiques nus. En outre, les diamètres des segments tubulaires peuvent être mesurés à partir de la partie la plus externe des assemblages ^13. Une analyse plus détaillée peut être effectuée en utilisant cryo-microscopie électronique ^17. Cette méthode peut être utilisée pour des assemblages de protéines lipidiques natives d'image dans un solvant sans l'utilisation de taches de métaux lourds qui enrobent l'échantillon. De cette façon, les caractéristiques structurelles détaillées non apparentes dans la tache négative, y compris des changements dans la morphologie des lipides sous-jacente, peuvent être examinés et quantifiés.

3. Utilisation de Échafaudages Liposomes pour Enzymatic Assay

Note: Un colorimétrique test GTPase ¹⁸ a été utilisé pour mesurer la libération de phosphate par l' intermédiaire de l' hydrolyse du GTP. Essais de GTPase alternatifs sont disponibles ¹⁹ et peuvent être mises en œuvre au besoin.

1. Incuber marquée par His MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), ou GFP (5 uM finale pour tous) avec des liposomes d'échafaudage (150 uM final) pendant 15 min à température ambiante dans le tampon A + BME (volume = 30 pi). Ajouter DRP1 (500 nM final) et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à la température ambiante (volume = 80 pi).
   REMARQUE: Fis1 a été purifié d'une manière similaire à FFM ^2, mais l'étape de chromatographie échangeuse d' ions a été omise. Le but de His-tagged GFP est de protéger le NTA (Ni ²⁺⁾ et d' empêcher des groupes de tête des interactions de charges non spécifiques avec d' autres protéines. Si aucun effet est observé en l'absence de la GFP, alors ce contrôle peut ne pas être nécessaire. protéines alternatives de blocage (de taille comparable à la protéine d'intérêt) peuvent être utilisés aussi bien, mais GFP permet une visualisation directe des interactions avec SCAFpliez liposomes.
2. Les tubes de transfert à un thermocycleur réglé sur 37 ° C, et initient des réactions par addition de GTP et de _MgCl2 (1 mM et 2 mM finale, respectivement; volume = 120 ul).
3. Aux points temporels désirés ( par exemple T = 5, 10, 20, 40, 60 min), transférer 20 pi de réaction dans les puits d'une plaque de microtitrage contenant 5 pi de 0,5 M d' EDTA pour chélater Mg ²⁺ et arrêter la réaction.
4. Préparer un ensemble de normes de phosphate par dilution KH ₂ PO ₄ dans le tampon A + BME pour calibrer les résultats. Un ensemble utile de normes est de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 et 0 uM. Ajouter 20 pi de chaque puits contenant 5 pi de 0,5 M d'EDTA.
5. Ajouter 150 ul de réactif malachite verte (carbinol vert malachite 1 mM, 10 mM de molybdate d' ammonium tétrahydraté et du HCl 1 N) dans chaque puits et lire la DO ₆₅₀ 5 minutes après l' addition.
   REMARQUE: GTP est labile en milieu acide, et l'hydrolyse en présence d'un réactif de vert malachite. Veiller à ce que til le temps entre l'ajout de réactif malachite et de la lecture est constante pour obtenir des résultats reproductibles.
6. Générer une courbe d' étalonnage en traçant _DO650 des normes en fonction de la concentration en phosphate. Utiliser une régression linéaire pour déterminer la relation entre la _DO650 et la concentration en phosphate dans un échantillon.
7. En utilisant la régression linéaire, la conversion de la _DO650 des échantillons de réaction de la protéine de phosphate uM. Déterminer le taux de génération de phosphate pour chaque mélange de réaction en traçant la concentration de phosphate en tant que fonction du temps, et à convertir _kcat en divisant le débit par la concentration DRP1 (0,5 uM).
   NOTE: Seul le taux linéaire initial doit être utilisé pour déterminer le taux de production de phosphate, et un minimum de 3 points de données doit être utilisé. Si la vitesse de réaction est suffisamment rapide pour que les trois premiers points de données ne sont pas linéaires ( par exemple r ² de l'ajustement linéaire est inférieur à 0,9) , un signeificantly plus court en fonction du temps avec au moins 3 points de temps doit être effectué.

Résultats

Alors que l'interaction entre DRP1 et MFF a été démontrée comme étant important pour la fission mitochondriale, cette interaction a été difficile à récapituler in vitro. Notre objectif était de mieux émuler l'environnement cellulaire dans lequel DRP1 et MFF interagissent. A cet effet, des liposomes contenant des concentrations de limitation de NTA (Ni ²⁺⁾ , les groupes de tête ont été préparées en réhydratant un film lipidique tel que décrit ...

Discussion

Ce protocole offre une méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine impliquant des protéines membranaires intégrales. En utilisant un liposome échafaudage modulaire, les chercheurs sont capables d'évaluer l'activité d'une ou plusieurs protéines dans un environnement lipidique proximale. Des études antérieures ont démontré un procédé similaire pour les enzymes des récepteurs de la membrane plasmatique ^24-26. Nous avons élargi cette méthode pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices