Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l'identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Résumé

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Résumé

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

L' un des principaux défis de la santé au 21 ^e siècle , sont des maladies neurodégénératives telles que la maladie d' Alzheimer (MA). Tau est une protéine associée aux microtubules qui stimule microtubules (MT) la formation. Tau est également impliqué dans plusieurs maladies neurodégénératives, soi-disant tauopathies, dont le plus connu est AD. Dans ces troubles, Tau auto-agrégats en filaments hélicoïdaux appariés (PHF) et se trouve modifié sur de nombreux résidus de modifications post - traductionnelles (PTM) , tels que la phosphorylation ^1. La phosphorylation de la protéine Tau est impliquée à la fois dans la régulation de sa fonction physiologique de la stabilisation MT et la perte pathologique de la fonction qui caractérise les neurones AD.

En outre, la protéine Tau, lorsqu'ils sont intégrés dans les PHF dans des neurones malades, est invariablement hyperphosphorylée ^2. Contrairement à Tau normale qui contient 2-3 groupes phosphate, le Tau hyperphosphorylée en PHF contient 5 à 9 phosphatgroupes E ^3. Hyperphosphorylation de Tau correspond à la fois à une augmentation de la stoechiométrie à certains sites et de la phosphorylation des sites supplémentaires qui sont appelés des sites pathologiques de phosphorylation. Cependant, le chevauchement existe entre AD et modèles adultes normaux de phosphorylation, en dépit des différences quantitatives dans le niveau ^4. Quelle est la spécificité des événements de phosphorylation fonction d'influence et le dysfonctionnement de Tau reste largement inconnu. Notre objectif est de décrypter la réglementation Tau par PTM au niveau moléculaire.

Pour approfondir la compréhension des aspects moléculaires de Tau, nous devons relever les défis techniques. Tout d'abord, Tau est une protéine intrinsèquement désordonnés (IDP) lorsque isolé en solution. De telles protéines manquent structure tridimensionnelle bien définie dans des conditions physiologiques et nécessitent des méthodes particulières biophysiques pour étudier leur fonction (s) et les propriétés structurelles. Tau est un paradigme pour la classe croissante des personnes déplacées, souvent trouvé associé àpathologies telles que les maladies neurodégénératives, ce qui augmente l'intérêt de comprendre les paramètres moléculaires qui sous-tendent leurs fonctions. En second lieu, la caractérisation de la phosphorylation de tau est un défi analytique, avec des 80 sites potentiels de phosphorylation le long de la séquence la plus longue isoforme Tau 441 acides aminés. Un certain nombre d'anticorps ont été développés contre des épitopes de la protéine tau phosphorylée et sont utilisés pour la détection de tau dans les neurones pathologique ou le tissu cérébral. les événements de phosphorylation peuvent avoir lieu sur au moins 20 sites ciblés par les kinases de proline dirigée, la plupart d'entre eux dans la proximité de la région riche en proline. Le qualitative (quels sites?) Et quantitative (ce stoechiométrie?) La caractérisation est difficile , même par les plus récentes techniques MS ^5.

spectroscopie RMN peut être utilisée pour étudier des protéines qui sont hautement désordonnés des systèmes dynamiques constitués d'ensembles de conformères. spectroscopie RMN à haute résolution a été applied pour étudier la structure et la fonction de la protéine Tau. En outre, la complexité du profil de phosphorylation de Tau a conduit au développement d'outils moléculaires et de nouvelles méthodes d' analyse par RMN pour l'identification des sites de phosphorylation ^{6 - 8.} RMN comme méthode d'analyse permet d'identifier des sites de phosphorylation de tau de manière globale, la visualisation de toutes les modifications à site unique en une seule expérience, et la quantification de l'étendue de l'incorporation de phosphate. Ce point est essentiel, car bien que les études de phosphorylation sur Tau abondent dans la littérature, la plupart d'entre eux ont été réalisées avec des anticorps, laissant un grand degré d'incertitude sur le profil complet de phosphorylation et donc l'impact réel des événements de phosphorylation individuels. y compris les kinases PKA recombinants, glycogène synthase kinase 3β (GSK3), la kinase dépendante de la cycline 2 / cycline A (CDK2 / CycA), la kinase dépendant de la cycline 5 (CDK5) / p25 acteprotéine ivator, extracellulaire régulée par un signal kinase 2 (ERK2) et microtubules affinité régulation kinase (MARK), qui présentent une activité de phosphorylation vers Tau, peuvent être préparés sous une forme active. En outre, les mutants Tau qui permettent de générer des isoformes de protéines Tau spécifiques avec des motifs de phosphorylation bien caractérisés sont utilisés pour déchiffrer le code de phosphorylation de Tau. Spectroscopie RMN est ensuite utilisée pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés ^{6 - 8.} Bien que la phosphorylation in vitro de Tau est plus difficile que pseudo-phosphorylation , par exemple par mutation de Ser / Thr choisi en acide glutamique (Glu) des résidus, cette approche a ses mérites. En effet, ni les chocs, ni interaction paramètres structurels de phosphorylation peuvent toujours être imitées par les acides glutamique. Un exemple est le motif de tour observé autour phosphosérine 202 (pSer202) / 205 phosphothréonine (pThr205), qui ne sont pas reproduits avec des mutations Glu ^9.

Ici, la préparation du marquage isotopique des investigations RMN Tau sera décrit d'abord. La protéine tau phosphorylée par ERK2 est modifié sur de nombreux sites décrits comme des sites pathologiques de phosphorylation, et représente donc un modèle intéressant de Tau hyperphosphorylée. Un protocole détaillé de Tau dans la phosphorylation in vitro par ERK2 kinase recombinante est présentée. L' ERK2 est activé par la phosphorylation par la protéine kinase activée par mitogene / ERK kinase (MEK) ^10-12. En plus de la préparation de la modification, de la protéine Tau marqué isotopiquement, la stratégie utilisée pour l'identification RMN du PTM est décrite.

Protocole

1. Production de ¹⁵ N, ¹³ C-Tau (Figure 1)

1. Transformer pET15b-Tau recombinante plasmide d' expression de T7 ^13,14 dans BL21 (DE3) , les cellules bactériennes d' Escherichia coli compétentes ^15.
   REMARQUE: le codage de l' ADNc le plus long (441 résidus d'acides aminés) Tau isoforme est clone entre les sites de restriction Ncol et Xhol dans le plasmide pET15b.
   1. Mélanger doucement 50 ul de BL21 (DE3) compétentes cellules, formant 1-5 x 10 ⁷ colonies par pg d'ADN de plasmide, avec 100 ng d'ADN plasmidique dans un tube en plastique de 1,5 ml.
      NOTE: Codon-utilisation optimisée des souches bactériennes pour l'expression de l'ADNc eucaryote ne sont pas indispensables pour produire Tau humaine.
   2. Placez le mélange de cellules sur la glace pendant 30 min, puis le choc thermique pendant 10 secondes à 42 ° C. Placer le tube de retour sur la glace pendant 5 minutes et ajouter 1 ml de la température ambiante LB (Luria-Bertani). Incuber la suspension bactérienne à 37 ° C pendant 30 min sous douceagitation.
2. Se propager à l'aide d'une boucle d'inoculation de 100 ul de suspension cellulaire uniformément sur une plaque de gélose de milieu LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline antibiotique.
3. Incuber la plaque de sélection pendant 15 heures à 37 ° C.
4. Gardez la plaque de sélection à 4 ° C jusqu'à passer à l'étape de culture, pour un maximum de 2 semaines environ.
   REMARQUE: un stock de glycérol de culture bactérienne (50% de glycérol), stocké à -80 ° C, peut être préparé pour commencer la culture à un stade ultérieur.
5. Ajouter 1 ml de 1 M _MgSÛ4, 1 ml de 100 mM _CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamine complément, 1 ml 100 mg / ml d' ampicilline à 1 L de sels M9 autoclavées (6 g Na ₂ HPO _4, 3 g de KH ₂ PO ₄ , 0,5 g de NaCl).
   NOTE: Un précipité blanc se forme lors de l' addition de la solution de _CaCl2 aux sels M9 qui se dissipe rapidement.
6. Solubiliser 300 mg de ¹⁵ N, ¹³ moyen C-complète, 1 g de ¹⁵_NH4CI et 2 g de ₆ ^13C - glucose dans 10 ml de milieu M9. Filtre-stériliser la solution d'isotopes utilisant un filtre de 0,2 um, directement dans le milieu M9.
7. Suspendre l'aide d'une boucle inoculation une colonie de pET15b-Tau transformé les bactéries de la plaque de sélection dans 20 ml de milieu LB supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline.
8. Incuber le milieu inoculé à 37 ° C pendant environ 6 heures.
9. Mesurer la densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ sur 1 ml d'une dilution de dix fois de la culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique.
   REMARQUE: La turbidité de la culture bactérienne correspondant à une DO ₆₀₀ de 3,0 à 4,0 indique que la phase de croissance de saturation est atteint.
10. Ajouter 20 ml de la culture LB saturé à 1 L de milieu de culture M9 supplémenté avec de l'ampicilline (100 ug / ml de concentration finale) dans 2 L d'Erlenmeyer en matière plastique flacon de culture dérouté.
11. Placer le flacon de culture dans un incubateur programmable réglé à 10 °C et à 50 tours par minute. Programmer l'incubateur pour passer à 200 tours par minute et 37 ° C au début de la matinée du lendemain.
12. Mesurer la DO ₆₀₀ sur 1 ml de culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique. Ajouter 400 ul de 1 M d' IPTG (les β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle 1) de la solution mère (conservés à -20 ° C) lorsque _DO600 atteigne une valeur d'environ 1,0 à induire l'expression de la protéine recombinante Tau.
13. Continuer l'incubation à 37 ° C pendant encore 3 h. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 5000 xg pendant 20 min.
14. Congeler le culot bactérien à -20 ° C. Maintenir l'état congelé jusqu'à l'étape de purification, pendant une période prolongée si nécessaire.

2. La purification du ¹⁵ N, ¹³ C-Tau (Figure 2)

1. échangeuse de cations autoclave (CEX), des tampons de purification à 121 ° C sous 15 psi pendant 20 min. tampons Conserver à 4 ° C.
2. Décongeler le culot de cellules bactériennes et remettre en suspension dans 45 ml soigneusementd'extraction CEX un tampon (50 mM de tampon NaPi pH 6,5, EDTA 1 mM) fraîchement additionné de 1x inhibiteur de protéase de cocktail (1) et les tablettes ADNase I (2000 unités).
3. Perturber les cellules bactériennes en utilisant un homogénéisateur haute pression à 20 000 psi. 3-4 passes sont nécessaires. Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 40 min pour éliminer la matière insoluble.
4. Chauffer l'extrait de cellule bactérienne pendant 15 minutes à 75 ° C en utilisant un bain d'eau.
   REMARQUE: un précipité blanc est observé au bout de quelques minutes.
5. Centrifuger à 15000 xg pendant 20 minutes et de garder le surnageant contenant la protéine Tau stable à la chaleur.
6. Conserver à -20 ° C jusqu'à l'étape suivante de purification, si nécessaire.
7. Réaliser une chromatographie échangeuse de cations sur une résine de CEX forts en tant que colonne garnie de 5 ml de lit en utilisant une chromatographie liquide rapide des protéines système (FPLC) (figure 3 A).
   1. Régler le débit à 2,5 ml / min.
   2. Equilibrer la colonne dans CEX Un tampon
   3. Chargez le 60-70 ml heated-extrait contenant Tau en utilisant une pompe d'échantillonnage, ou encore la pompe A, en fonction du système. Recueillir l'écoulement pour l'analyse afin de vérifier que la protéine Tau est efficacement obligatoire à la résine (voir 2.8).
   4. Laver la résine avec CEX Un tampon jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est de retour à la valeur de référence.
   5. Tau éluer de la colonne en utilisant un triple gradient de NaCl obtenu par augmentation progressive de la CEX tampon B (tampon A CEX avec 1 M de NaCl). Programme FPLC comme suit: première étape du gradient de tampon de 25% CEX B dans 10 volumes de colonne (CV) pour atteindre 250 mM de NaCl, deuxième étape à un tampon de 50% CEX B 5 CV pour atteindre 500 mM de NaCl, et une troisième étape à 100% de tampon CEX B en 2 CV pour atteindre 1 M de NaCl. Recueillir des fractions de 1,5 ml pendant les étapes d'élution.
8. Analyser 10 ul des fractions recueillies au cours de l'étape d'élution par SDS-PAGE (gel de SDS-acrylamide à 12%) et de Coomassie (figure 3 A) ^16. Vérifiez l'étape de chargement sur la colonne et par analyzing 10 pl de l'écoulement.
9. Choisissez les fractions contenant Tau et mettre en commun ces fractions pour l'étape suivante.
10. Effectuer un échange de tampon sur les fractions Tau contenant regroupées (Figure 3 B).
    1. Equilibrer une colonne de dessalage de résine lit 53 ml de G25 emballé (26 x 10 cm) en mM de bicarbonate d'ammonium 50 (tampon volatile) en utilisant un système FPLC.
    2. débit de Set à 5 ml / min. Injecter l'échantillon Tau sur la colonne par l'intermédiaire d'une boucle d'injection de 5 ml. Recueillir les fractions correspondant au pic d'absorption à 280 nm.
    3. Répéter l'injection de 3-4 fois, en fonction du volume du bassin initial CEX.
11. Calculer la quantité de protéine tau purifiée en utilisant la zone de pic du chromatogramme à 280 nm (1 mg de Tau correspond à 140 mUA * ml).
    NOTE: Le coefficient de la protéine Tau d'extinction à 280 nm est 7,550 M ^-1 cm ^-1. Tau ne contient pas de résidus Trp.
12. Piscine toutes les fractions Tau.
13. aliquot l'échantillon dans des tubes contenant l'équivalent de 1 à 5 mg de Tau. Choisir ces tubes, de sorte que le volume de solution est faible par rapport au volume du tube (par exemple 5 ml d'une solution dans un tube de 50 ml).
14. Percez des trous dans les bouchons de tube à l'aide d'une aiguille. Congeler des échantillons Tau à -80 ° C.
15. échantillons Lyophiliser Tau. la protéine Tau lyophilisée peut être conservée à -20 ° C pendant de longues périodes de temps.

3. In Vitro Phosphorylation de ¹⁵ N-Tau

1. Dissoudre 5 mg de Tau lyophilisée dans 500 pi de tampon de phosphorylation (50 mM Hepes KOH pH 8,0, 12,5 mM de _MgCl2, 1 mM d' EDTA, 50 mM de NaCl).
2. Ajouter mM ATP 2,5 (25 pi de solution mM 100 conservés à -20 ° C), 1 mM de DTT (1 pi de 1 M solution mère maintenue à -20 ° C), 1 mM d'EGTA (2 pi d'un stock de 0,5 M solution), inhibiteur de la protéase 1x cocktail (25 pl d'un 40x disponible obtenue en dissolvant 1 comprimé dans 1 ml de tampon de phosphorylation) et 181; M activé His-ERK2 (250 ul dans un tampon de conservation Hepes 10 mM, pH 7,3, 1 mM de DTT, 5 mM de _MgCl2, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol, stocké à -80 ° C) dans un volume d'échantillon total de 1 ml.
   NOTE: L'activation His-ERK2 peut être préparé en interne ^5,8 par phosphorylation avec la kinase MEK.
3. Incuber 3 heures à 37 ° C.
4. Chauffer l'échantillon à 75 ° C pendant 15 minutes pour inactiver la kinase ERK.
5. Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 15 min. Recueillir et conserver le surnageant.
6. Dessaler l'échantillon de protéine dans 50 mM de bicarbonate d'ammonium en utilisant une colonne de résine lit 3,45 ml G25 emballé (1,3 x 2,6 cm), qui est adapté pour un échantillon de 1 ml.
7. Exécuter un SDS-PAGE à 12% ¹⁶ avec 2,5 pi de l'échantillon de protéine pour vérifier à la fois son intégrité et sa phosphorylation efficace (figure 4).
8. Lyophiliser l'échantillon Tau phosphorylée. Conserver la poudre à -20 ° C.

4. Acquisition de spectres RMN (Figurer 5)

1. Solubiliser 4 mg de lyophilisé ¹⁵ N, ¹³ C ERK phosphorylée-Tau dans 400 tampon de RMN ul (mM NaPi 50 ou 50 mM deutérés tris- de .cl, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM et DTT 1 mM).
2. Ajouter 5% de D ₂ O pour le champ de verrouillage du spectromètre RMN et 1 mM de TMSP (3- (triméthylsilyl) sel de sodium de l' acide propionique _{4-2,2,3,3-d))} en tant que référence interne RMN du signal. Ajouter 10 ul d'une solution 40x stock de complet cocktail d'inhibiteurs de la protéase.
3. Transférer l'échantillon dans un tube RMN de 5 mm à l'aide d'une seringue électronique avec une longue aiguille ou d'une pipette Pasteur. Fermer le tube RMN en utilisant le piston. Enlevez toute bulle d'air emprisonné entre le piston et le liquide par des mouvements de piston.
4. Placer le tube RMN dans un spinner. Ajuster sa position verticale dans le métier à filer avec le gabarit approprié pour la tête de la sonde de RMN utilisé, de telle sorte que la majeure partie de la solution d'échantillon sera à l'intérieur de la bobine RMN.
5. Démarrez le flux d'air: cliquez ascenseur in la fenêtre du système de contrôle d'aimant. Placez délicatement le spinner avec le tube dans le flux d'air dans la partie supérieure de l'alésage de l'aimant. Arrêter le flux d'air (cliquez ascenseur) et laisser le tube descendre en place à l' intérieur de la tête de sonde dans l'aimant.
6. Réglez la température à 25 ° C (298 K).
7. Effectuer le réglage semi-automatique et adaptation de la tête de sonde pour optimiser la transmission de puissance. Tapez ATMM sur la ligne de commande.
8. Verrouiller la fréquence du spectromètre à l' aide du signal D ₂ O de l'échantillon enregistré sur le canal de deuterium. Cliquez verrouillage dans la fenêtre du système de contrôle de l' aimant.
9. Démarrer la procédure de calage afin d'optimiser l'homogénéité du champ magnétique à la position de l'échantillon. Tapez topshim gui sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre de shim. Cliquez sur Démarrer dans la fenêtre de shim. Vérifiez la valeur résiduelle de variation norme B0 pour vérifier que les cales sont optimales (moins de 2 Hz est bonne).
10. Calibrer le paramètre p1 (longueur d'un protonimpulsion radiofréquence en microsecondes), ce qui est nécessaire pour obtenir une rotation des spins de protons de 90 °. Visez l'impulsion à 360 ° en utilisant un spectre 1D de protons de l' eau (figure 6).
11. Ajuster le décalage en réglant le paramètre o1 (en Hz) de la fréquence du proton de l' eau dans le spectre 1D (figure 6) la fréquence.
12. Commencer l' acquisition d'un spectre de proton 1D (séquence d'impulsions avec une séquence écluse pour la suppression du signal de l' eau, par exemple zggpw5) pour vérifier les signaux provenant de l'échantillon (figure 7). Adapter le nombre de balayages de la concentration relative des protéines. Tapez zg sur la ligne de commande pour démarrer l'acquisition.
13. Mettre en place des paramètres supplémentaires pour l'acquisition d'une 2D ^[1 H, ¹⁵ N] spectre HSQC (séquence d' impulsions hsqcetfpf3gpsi, figures 8-9).
    1. Pour un ¹⁵ N, ¹³ C marqué échantillon, découpler ¹³ C au cours de l'évolution indirecte ¹⁵ N.
    2. Définir le nombre de points et la largeur spectrale (ppm) dans le ¹ H (F2) et ¹⁵ N (F1) dimensions.
       REMARQUE: Adapter le nombre de points de données d'acquisition sur le terrain du spectromètre pour maintenir un nombre similaire de Hz par point et de limiter les temps de découplage: utiliser 3.072 points 900 MHz et 2048 points à 600 MHz, dans la ¹ H dimension.
    3. Optimiser les paramètres supplémentaires dans les séquences d'impulsions, ce qui correspond à des retards, des longueurs d'impulsion, le décalage des fréquences, des niveaux de puissance. Type de elon sur la ligne de commande pour afficher tous les paramètres pertinents pour l'expérience.
14. Définissez les paramètres pour l'acquisition d'une 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹³ C] spectre HNCACB (séquence d'impulsions de hncacbgpwg3d, figure 10A) à 600 MHz.
15. Définir les paramètres 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹⁵ N] expérience HNCANNH (séquence d' impulsions hncannhgpwg3d) à 600 MHz. Réglez le nombre de points à 2048 dans le ¹ H et 64et 128 points dans les deux ¹⁵ N dimensions. Définir les largeurs spectrales 14, 25, 25 parties par million (ppm) centré sur 4,7, 119, 119 ppm en ¹ H ¹⁵ N et ¹⁵ N dimensions. Durée d'acquisition avec 16 balayages est de 1 jour et 22 heures.

5. Identification des sites Phosphorylation

1. Les spectres de processus utilisant l'acquisition et la RMN de traitement logiciel.
   1. Effectuer une transformation de Fourier des données (figure 7). Type de pieds pour un spectre 1D, xfb pour un spectre 2D ou ft3d pour un spectre 3D, sur la ligne de commande.
   2. Phase et référence tous les spectres (figure 7C) en utilisant les fenêtres interactives.
2. Identifier les résonances d'intérêt dans la 2D HSQC potentiellement correspondant aux résidus Ser et Thr phosphorylée (figure 9, boîte rouge).
3. Plans d'extrait (c. -à- 2D ¹ H- ¹³ C spectres) à partir dele spectre 3D ¹ H- ¹⁵ N ¹³ C ¹⁵ N en utilisant les déplacements chimiques des résonances d'intérêt pour le 2D. Utiliser le curseur de dimension 2 (w2) pour sélectionner la fréquence ¹⁵ N correspondant au plan (W1-W3) à visualiser (figure 10B).
4. Choisissez les fréquences de résonance de 'CA' et ¹³ C noyaux «CB» de la «i» et les résidus 'i-1' (ensemble plus faible des signaux par rapport à celles du résidu i) pour chaque ^[1 H, ¹⁵ N] résonance d'intérêt dans le spectre HNCACB 3D en cliquant sur la résonance, dans le menu du mode de pointeur trouver / ajouter de pointe, pour ajouter la valeur de décalage chimique dans un fichier de liste de pointe.
   1. Identifier le type de résidu i, pSer ou pthr, en comparant les changements chimiques dans la liste des pics à des valeurs connues de CA et CB changements chimiques de pSer et pthr ^17.
   2. Identifier la présence d'un résidu Pro à la i + 1 position par une caractéristique supplémentaire +2 ppm changement of la valeur de décalage CA chimique ^18.
   3. Comparer les valeurs de déplacement chimique des CA et CB résonnances correspondant au résidu i-1 à une table des déplacements chimiques prévus pour Tau résidus d'acides aminés ¹⁹ d'identifier la nature du résidu à la position i-1.
5. Choisissez les fréquences de résonance de ¹⁵ N noyaux de la 'i' et 'i-1' résidus pour chaque résonance ^[1 H, ¹⁵ N] d'intérêt dans le spectre de HNCANNH.
6. Comparer les valeurs ¹⁵ N de déplacement chimique à l'affectation de déplacement chimique de la protéine Tau ^{20 - 23.}
7. Comparer les dipeptides identifiées avec la séquence de Tau pour définir la mission spécifique de séquence.

Résultats

La figure 3A montre un pic majeur d'absorption à 280 nm observée au cours du gradient d'élution. Ce pic correspond à une protéine Tau purifiée comme on le voit sur le gel d'acrylamide au-dessus du chromatogramme. La figure 3B montre un pic d'absorption bien séparés à 280 nm et un pic de conductivité, en veillant à ce que le dessalage de la protéine est efficace. La figure 4 montre un gel de protéine de décalage observée par analyse SDS-PAGE ¹⁶ carac...

Discussion

Nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés. L'expression recombinante et purification décrit ici pour la pleine longueur de la protéine Tau humaine peuvent de même être utilisés pour produire des mutants Tau Tau ou domaines. Isotopiquement enrichi de protéines est nécessaire pour la spectroscopie RMN, ce qui nécessite l'expression recombinante. Identification des sites de phosphorylation nécessite l' affectation de résonance et une pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software