Dissection et observation de Honey Bee Dorsale Navire d'études de la fonction cardiaque

Résumé

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Résumé

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est de permettre à l'enquêteur d'observer et de quantifier l'effet qu'un agent pharmacologique a sur le taux d'abeilles cardiaque rapidement et facilement. Les abeilles, comme d'autres insectes, ont un système circulatoire ouvert qui dissémine hémolymphe, l'équivalent d'insectes de sang, à travers la cavité du corps, connu sous le nom hémocèle. La circulation de l' hémolymphe est essentiel pour le transport des nutriments, les facteurs immunitaires, des déchets, ainsi neurohormones et d' autres molécules de signalisation ^1. La circulation est facilitée par le vaisseau dorsal, qui se prolonge le long de la ligne médiane dorsale de l'insecte, ainsi que les organes pulsatiles accessoires. Le vaisseau dorsal est divisé en deux sections fonctionnellement distinctes, désigné le cœur dans l'abdomen et l'aorte dans le thorax et la tête. contractions propagés dans l'hémolymphe de la pompe cardiaque vers le thorax et la tête, tandis que les organes pulsatiles accessoires assurent l'écoulement de l'hémolymphe aux extrémités.

fonction Insect cardiaque peut être observée en utilisant une variété de méthodes, en fonction de la taille, le stade de la physiologie ou de la vie de l'insecte. Une approche commune pour l' observation de la fréquence cardiaque chez les larves ou petits insectes est l'utilisation de l' imagerie intravitale ^2. Cette méthode est moins utile pour les abeilles adultes, cependant, car il peut être difficile de voir clairement le vaisseau dorsal à travers la paroi abdominale. Une approche établie pour enregistrer le rythme cardiaque dans une variété d'insectes, y compris les abeilles, est l'utilisation de contacts thermographie, qui utilise des thermistances appliqués à l'extérieur de l'insecte pour détecter les pulsations cardiaques ^3,4. La fréquence cardiaque chez les abeilles adultes a également été enregistrée en utilisant une technique électrophysiologique pour mesurer un signal d'impédance électrique ^4,5. Cette technique nécessite l'insertion d'électrodes dans l'animal à côté du coeur et l'utilisation d'un convertisseur d'impédance pour enregistrer les battements de coeur ^4. De même, des électrocardiogrammes ont été utilisés pour DeTect signaux électriques produits par le coeur et combiné avec l' enregistrement vidéo de l'abeille pour observer les changements dans l' activité cardiaque ^6. Un net avantage à ces approches est que la fréquence cardiaque est évaluée, une abeille vivante intacte, plutôt que dans un échantillon disséqué, ce qui contribue à assurer la disponibilité de la gamme complète des réponses physiologiques à ce sujet. Les défis de ces approches comprennent la comptabilité pour l'immobilisation ou anesthetization du sujet, la nécessité de limiter les variables et les stimuli extérieurs qui pourraient altérer la fréquence cardiaque, ainsi que la détermination d'une méthode de livraison appropriée lors de l'essai des agents pharmacologiques.

Une autre approche qui a été utilisée pour étudier l' activité cardiaque d'abeille est de disséquer partiellement l'insecte afin d'exposer le cœur, puis mesurer les contractions des vaisseaux dorsales en utilisant un déplacement transducteur de force ^7. Dans ce protocole, le cœur est constamment baigné avec du sérum physiologique en cours d'exécution et co testmpounds peuvent être dissous dans cette solution pour l' application à l'objet ^7. Une différence significative entre cette méthode et ceux décrits précédemment est que le cordon nerveux ventral est éliminé, ce qui élimine le rôle que le système nerveux central a été montré à jouer dans la modulation de fréquence cardiaque ^5. Le résultat est que le rythme cardiaque de référence, ce qui est généralement très irrégulier, se stabilise à une fréquence beaucoup plus faible que l' amplitude et est typiquement observée chez un insecte vivant ^5,7. Ce que toutes ces méthodes ont en commun est qu'elles nécessitent un équipement hautement spécialisé et souvent coûteux, en plus d'un certain niveau d'expertise, afin d'être menée. Peut-être le plus grand inconvénient est que aucune de ces approches sont particulièrement bien adaptés à des expériences qui impliquent de test d'un grand nombre de sujets, tels que le criblage d'une banque de composés potentiellement cardiomodulatory.

La plus grande force de l'approche décrite iciest sa simplicité. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l'installation nécessite peu d'espace, et seule une contribution financière minimale est nécessaire. La méthode nécessite peu plus que quelques abeilles, quelques instruments chirurgicaux, une solution isotonique, et soit un microscope numérique ou un microscope traditionnel avec un appareil photo numérique. Les abeilles sont disséqués pour visualiser le vaisseau dorsal et des vidéos numériques sont utilisés pour enregistrer le rythme cardiaque avant et après traitement avec des agents pharmacologiques. Bien que l' enregistrement vidéo est pas réellement nécessaire d'observer les changements de la fréquence cardiaque, il va grandement augmenter le débit (ie, le nombre de sujets qui peuvent être traités dans un laps de temps donné). L'enquêteur peut maximiser l'efficacité en enregistrant un grand nombre de vidéos à la fois, puis plus tard en marquant ces vidéos à un moment plus opportun. Un autre avantage de cette approche est que les vidéos permettent à l'enquêteur de recommencer, si le processus de notation est interrompu, et la rendre plus facile pour le vViewer aveugler au traitement afin de réduire le biais.

Protocole

1. Collecte et préparation des sujets d'essai

1. Recueillir le nombre approprié d'abeilles de la colonie.
   REMARQUE: Le nombre nécessaire dépend non seulement de la taille et la portée de l'expérience, mais aussi la compétence de l'enquêteur. Par exemple, s'il y a 2 groupes de traitement avec une taille d'échantillon souhaitée de 10 abeilles par groupe, un enquêteur raisonnablement qualifiée pourrait recueillir au moins 30 abeilles pour tenir compte des dissections infructueuses et se retrouver avec 20 vidéos utiles pour marquer.
2. Réduire la quantité de temps qui passe entre la collecte et la dissection.
   NOTE: Bien que les abeilles peuvent être logés dans le laboratoire pendant plusieurs jours avant la dissection, le taux de dissections de réussite (ie, la probabilité de maintenir un rythme cardiaque stable dans un vaisseau dorsal disséqué) a été observée pour diminuer par rapport à la quantité de temps que les abeilles sont logés loin de la colonie.
   1. Fournir des abeilles avec une source d'eau et de nourriture tout logé dans le laboratoire. Pour example, au minimum, donner accès à 50% (p / v) de saccharose dans de l'eau (ce qui est suffisant pour une durée de moins de 6 heures). Pour des périodes plus longues, fournissent abeilles accès au miel.
   2. abeilles Maison dans la nuit de laboratoire à une température d'environ 32 ° C et 60-80% d'humidité relative pour réduire le stress et éviter la déshydratation.
3. Avant la dissection, anesthésier les abeilles brièvement pour faciliter la manipulation.
   NOTE: Cela peut diminuer le taux de dissections de succès et de réduire le débit.
   1. Refroidir les abeilles soit en les plaçant sur la glace ou dans un réfrigérateur pour juste assez longtemps pour réduire le mouvement afin de faciliter la manipulation.
   2. Vous pouvez également exposer brièvement les abeilles à CO ₂ afin de faciliter la manipulation.
      NOTE: Une exposition prolongée au froid peut réduire le taux de dissections de succès. Extended ou une exposition répétée à CO ₂ peut également réduire le taux de dissections de succès.

2. DissectionDorsale de la paroi abdominale

NOTE: Les abeilles doivent être vivants au moment de la dissection.

1. En utilisant des pinces et / ou des ciseaux de microdissection, enlever les jambes et les ailes pour faciliter la dissection de l'abdomen. Gardez un petit bécher ou un récipient similaire rempli d'eau distillée à proximité dans le but de rinçage des instruments entre les dissections.
2. Alors que retenir l'abeille avec une pince, utiliser les ciseaux de microdissection pour couper latéralement le long de la paroi abdominale dorsale entre les première et deuxième tergites (voir Figure 1).

Figure 1: Vue dorsale d' une abeille abdomen. L'incision initiale doit être faite entre les première et deuxième tergites, comme indiqué par la ligne rouge. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquez sur sone pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Tout en saisissant légèrement le bord postérieur de la seconde Tergite avec la pince, couper longitudinalement le long de chaque côté de l'abeille de l'incision initiale à l'élinde flottante (voir la figure 2). Faites preuve de prudence lors de la coupe pour éviter la perforation du tractus gastro-intestinal.

Figure 2: Vue latérale de l' abeille abdomen. Les deuxième et troisième incisions doivent être faites le long de chaque côté de l'abdomen, comme indiqué par la ligne rouge. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Echanger les ciseaux pour une deuxième série de pinces fines et les utiliser pour séparer soigneusement la paroi abdominale dorsale du reste of l'abdomen. Retirez délicatement le dard et toute partie du tractus gastro-intestinal qui reste attaché à la paroi abdominale dorsale. Éviter la rupture de l'intestin, car le contenu peut recouvrir la paroi abdominale et d'empêcher la visualisation du vaisseau dorsal.

Figure 3: Vue du vaisseau dorsal. Une fois que l'intestin et le stinger ont été enlevés, le vaisseau dorsal est visible le long de la ligne médiane de la paroi abdominale dorsale disséqué. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. Réorganiser la paroi abdominale dorsale dans l'orientation souhaitée sous la caméra de sorte que le vaisseau dorsal est visible (voir Figure 3). Utiliser les ciseaux de microdissection pour couper tout excès abdominale paroi qui empêche la visualisation du vaisseau dorsal. La forme de la paroi abdominale dorsale devrait ressembler à une coupe peu profonde ou un bol lorsqu'ils sont situés correctement.
   1. Étant donné que le vaisseau dorsal ne se prolonge pas dans le segment abdominal percoir de l'abeille, retirez le tergite final afin d'améliorer la visualisation du vaisseau dorsal.
6. Utilisant une micropipette de volume réglable, couvrir le vaisseau dorsal avec 10 pi d'une solution isotonique pour maintenir des conditions physiologiques et faciliter un rythme cardiaque régulier.
   REMARQUE: La solution préconisée est une solution de Ringer de la force du quart (0,120 g / L de chlorure de calcium, 0,105 g / L de chlorure de potassium, 0,050 g / L de bicarbonate de sodium et 2,250 g / l de chlorure de sodium), qui a été trouvée pour faciliter une étable, rythme cardiaque en continu.

3. Observation et modulation de fréquence cardiaque

1. Laisser le vaisseau dorsal reposer tranquillement jusqu'à ce qu'un stable, le rythme cardiaque en continu est atteint(Généralement dans les 300 secondes).
   REMARQUE: battement de coeur est visualisé sous la forme de contractions rythmiques du vaisseau dorsal. Dans un premier temps, il peut sembler être plus de pouls, surtout si l'abeille a été anesthésiée, mais le cœur sera généralement reprendre battre après le repos dans une solution isotonique pendant plusieurs minutes et peut continuer de battre pendant des heures, à condition qu'il reste baigné dans une solution.
2. Mesurer la fréquence cardiaque en termes de nombre de battements par minute (BPM).
   1. Notez le nombre de contractions observées au cours d'une période de 60 sec. Utilisez un compteur à main et une minuterie pour faciliter ce processus.
3. Mesurer le changement de la fréquence cardiaque en enregistrant le BPM observé avant et après traitement avec un composé cardiomodulatory.
   NOTE: Bien que le temps nécessaire pour observer un effet sur la fréquence cardiaque peut varier en fonction du composé à l'essai, les variations de la fréquence cardiaque peuvent généralement être observées en quelques minutes.
   1. Déterminer la fréquence cardiaque de base précédant immédiatementl'ajout d'un composé d'essai.
      REMARQUE: la fréquence cardiaque post-traitement peut généralement être déterminée après 90 et 120 sec.
   2. Préparer cardiomodulators potentiels (par exemple, octopamine) en dissolvant le composé dans la même solution isotonique utilisée pour baigner le vaisseau dorsal.
   3. Ajouter les composés d'essai à la solution entourant le vaisseau dorsal en utilisant une micropipette.
4. Pour une plus grande précision et un débit plus élevé, faire un enregistrement vidéo de chaque objet de test, puis utiliser les vidéos pour marquer le rythme cardiaque à un moment ultérieur.
   NOTE: Cela permet à un seul enquêteur de décaler dissections afin de faciliter la production presque continue de vidéos. Lors de l'enregistrement de vidéos, la longueur minimale recommandée est d'environ 240 secondes avec un composé de test étant ajouté à la marque de 60 sec. Cela garantit que l'enquêteur dispose d'une fenêtre de 60 secondes pour marquer le rythme cardiaque de base, puis une autre fenêtre de 60 secondes pour marquer la fréquence cardiaque post-traitement 120 secaprès le traitement.

Résultats

Comme bon nombre des composés pharmacologiquement actifs qui pourraient être testés en utilisant ce protocole ne sont pas solubles dans l'eau, il est nécessaire d'avoir un solvant fiable qui permettra des composés d'essai à être livrés via la solution isotonique utilisée pour baigner le vaisseau dorsal. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est un solvant qui est couramment utilisée comme véhicule pour délivrer des médicaments et d' autres composés expérimentaux sur...

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments