La puissance de la simplicité: Sea Urchin Embryons comme<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèles de développement pour l&#39;étude de la cellule cellule-à-Complex de signalisation réseau Interactions

Résumé

Cet article vidéo détaille un simple dans la méthode in vivo qui peut être utilisé pour caractériser systématiquement et efficacement les composants de voies de signalisation complexes et les réseaux de régulation dans de nombreux embryons d' invertébrés.

Résumé

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

réseaux de gènes de régulation (GRNS) et voies de signalisation établissent l'expression spatiale et temporelle des gènes au cours du développement embryonnaire qui sont utilisés pour construire le plan corporel de l'animal adulte. Cell-à-cellule des voies de transduction du signal sont des composants essentiels de ces réseaux de régulation, en fournissant les moyens par lesquels les cellules communiquent. Ces interactions cellulaires établir et affiner l'expression des gènes de régulation et de différenciation dans et entre les différents territoires pendant l' embryogenèse ^{1, 2.} Les interactions entre les modulateurs sécrétées extracellulaires (ligands, des antagonistes), des récepteurs et co-récepteurs contrôlent les activités des voies de transduction du signal. Un assortiment de molécules intracellulaires transduction ces entrées résultant de l'expression altérée du gène, la division et / ou la forme d'une cellule. Bien que plusieurs des molécules clés utilisés aux niveaux extracellulaires et intracellulaires dans les principales voies sontconnu, il est une connaissance incomplète due en grande partie à la complexité des voies de signalisation individuelles. En outre, les différentes voies de signalisation interagissent souvent entre eux de façon positive ou négative au extracellulaire, intracellulaire, et les niveaux de transcription ^{3, 4, 5, 6.} Fait important, les composants de base de voies de signalisation sont hautement conservées dans toutes les espèces de métazoaires, et, fait remarquable, la plupart des grandes voies de signalisation exercent souvent des fonctions de développement similaires dans de nombreuses espèces lorsque l'on compare les organismes de phyla étroitement liés , en particulier ^{7, 8, 9, 10, 11.}

L'étude de la signalisation au cours du développement est une tâche ardue dans tout organisme, et il yPlusieurs défis importants pour l' étude des voies de signalisation dans la plupart des modèles deutérostomes (vertébrés, chordés invertébrés, hémichordés et échinodermes): 1) Chez les vertébrés , il y a un grand nombre de possibles ligand et les interactions récepteur / co-modulateurs, des molécules de transduction intracellulaire, ainsi que les interactions possibles entre les différentes voies de signalisation en raison de la complexité du génome ^{12, 13, 14;} 2) La morphologie complexe et mouvements morphogénétiques chez les vertébrés font qu'il est souvent plus difficile d'interpréter les interactions fonctionnelles et entre les voies de transduction du signal; 3) Les analyses de la plupart des espèces modèles invertébré deutérostomien non échinodermes sont limitées par de courtes fenêtres de gravidity à l'exception de certaines espèces de tuniciers ^{15, 16.}

leoursin embryon a quelques - unes des limitations mentionnées ci-dessus et offre de nombreuses qualités uniques pour effectuer une analyse détaillée des voies de transduction du signal in vivo. Ceux - ci sont les suivantes: 1) La relative simplicité du génome de l' oursin réduit de manière significative le nombre de possible ligand, un récepteur / co-récepteur et la molécule de transduction intracellulaire interactions ^17; 2) Les GRNS contrôlant la spécification et la structuration des couches germinales et les grands axes embryonnaires sont bien établis dans les embryons d'oursins, d' aider à la compréhension du contexte réglementaire de la cellule / territoire recevant les signaux ^{18, 19;} 3) De nombreuses voies de transduction du signal peuvent être étudiés entre les étapes de clivage et gastrula lorsque les embryons sont constitués d'un seul épithélium stratifié dont la morphologie est plus facile à analyser; 4) Les molécules comportentd dans les voies dans les oursins sont facilement manipulables de signalisation; 5) De nombreux oursins sont gravides pendant 10 à 11 mois par an (par exemple Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus).

Ici, nous présentons une méthode pour caractériser systématiquement et efficacement les composants des voies de signalisation qui précisent et territoires de modèle dans les embryons d'oursins pour illustrer les avantages que plusieurs systèmes de modèles d'invertébrés offrent dans l'étude des mécanismes moléculaires complexes.

Protocole

1. Stratégie de conception morpholino Throughput haut

1. Identifier un gène (s) d'intérêt (par exemple , l' approche de gène candidat, l' analyse des cis-régulatrices, et RNA-seq ou écrans différentiels / protéomique).
2. Utilisez génomique, transcriptomique, et des données d'expression génique disponibles sur les sites Web fréquemment mis à jour (par exemple SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ et S. purpuratus Genome Recherche http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) pour déterminer que le profil d'expression spatiotemporelle chevauche avec le mécanisme de développement en question. Si aucune donnée d'expression est disponible, puis générer des amorces qPCR et / ou un antisens sonde in situ pour évaluer le profil d'expression génique.
3. Après avoir déterminé le modèle spatial et temporel d'expression, d'obtenir la séquence d'ADN à partir des sites web génomiques.
   1. Pour générer des oligonucléotides morpholino traduction-bloquant, d'obtenir la séquence of la «région non traduite (5 '5 UTR) directement en amont du codon d'initiation de la balise de séquence exprimée (EST) des bases de données disponibles sur SpBase ou S. purpuratus Genome recherche des sites Web. Si cette information est indisponible pour le gène d'intérêt, puis effectuer 5 'RACE.
   2. Pour concevoir un morpholino d'épissure de blocage, la recherche de la séquence génomique comprenant les exons et les introns en utilisant l'outil échafaudage blastn dans SpBase ou S. purpuratus Genome outil de recherche.
4. Utilisez le site Web oligonucléotide conception http://oligodesign.gene-tools.com afin de concevoir la séquence paire morpholino 25 de base désirée.
   1. Pour une translation morpholino-blocage, en utilisant la séquence d'ARNm de 5 'à 3' comme source de la séquence cible de la traduction. Inclure la séquence 5 'UTR (environ 70 nucléotides en amont du site de début de transcription) plus de 25 bases de la région (en aval du site de départ) de codage avec le codon de départ wi marquéème parenthèse (ATG).
   2. Pour un morpholino d'épissure de blocage, sélectionnez intron-exon ou d'une séquence de frontière exon-intron et comprennent 50 bases (25 bases de séquence exon et 25 bases de séquence d'introns) autour des régions limitrophes. Scanner le génome avec la séquence morpholino pour vérifier que la séquence soit unique.

2. La micro-injection de morpholino oligonucleotides

1. Préparer 3 mM solutions des oligonucléotides morpholino en ajoutant 100 pi d'eau sans nucléase dans le 300 nmol morpholino flacon.
   NOTE: Ne pas utiliser l'eau traitée DEPC pour la remise en suspension, car le pyrocarbonate de diéthyle peut endommager le morpholino.
2. Pour la première rotation de reconstitution sur le flacon contenant la solution mère d'oligonucléotide pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex brièvement, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 à 10 min, vortex brièvement, et de garder le morpholino stock à la chambre température pendant au moins 1 h. Morpholino solution stock s sont stockés de -20 ° C à +4 ° C.
3. Préparer une solution injectable contenant oligonucleotides morpholino, à la concentration souhaitée. Cette solution contient habituellement 20% de glycérol ou de KCl 125 en tant que support et 15% FITC-Dextran (isothiocyanate de fluorescéine dextrane 10.000 MW 2,5 mg / uL solution mère). FITC-Dextran et d'autres conjugués dextrane fluorescents sont utilisés en routine pour identifier les embryons injectés par microscopie à épifluorescence. Magasin solutions d'injection à -20 ° C.
4. Chauffer la solution morpholino à 65 ° C dans un bloc chauffant ou un bain d'eau pendant au moins 2 - 5 min.
5. En bref tourner la solution morpholino pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex pendant 1 min et centrifuger à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg) pendant au moins 10 min.
6. Charger les aiguilles d'injection avec la solution morpholino. Pour un protocole de microinjection détaillée s'il vous plaît voir Stepicheva et Song 2014 ²¹ et Acclamations et Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixation et In Situ Protocole à 24 h post-fécondation (HPF) dans S. purpuratus Embryons

NOTE: Ce protocole est modifié de Arenas-Mena et al. 2000 ²³ et Sethi et al. 2014 ^24.

1. Fixation
   1. Ajouter quelques gouttes de fixateur (voir ci-dessous) à des puits contenant des embryons, mélanger doucement par pipetage, et leur permettre de se déposer. Retirer la solution de fixateur, puis mélanger les embryons avec deux lavages supplémentaires 180 uL de fixateur.
      NOTE: Il est important de bien mélanger les embryons pendant les lavages par pipetage doux monter et descendre plusieurs fois. Ne pas le faire peut réduire le rapport signal sur bruit.
   2. Laissez les embryons à fixer dans le second lavage de fixateur pendant 50 min à 1 h à température ambiante (RT) dans 4% de paraformaldehyde de qualité en microscopie électronique consistant en mM MOPS 10 pH 7,0, 0,1% de Tween-20, et artificielle seawater (ASW). Faire de cette solution fraîche chaque fois pour de meilleurs résultats. En outre, pour la facilité et l'aspect pratique des embryons sont fixés dans des plaques à 96 puits.
      1. Pour 20 ml de fixatif utiliser 5 ml 16% de paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi de 1 M de MOPS à pH 7,0, et 20 pi de Tween-20.
   3. Laver 5 fois à température ambiante avec 180 pi de tampon MOPS lavage consistant en 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl et 0,1% de Tween-20 pendant au moins 5 minutes, ou jusqu'à ce que des embryons tomber au fond du puits. Encore une fois, il est important de bien mélanger les embryons dans le tampon de lavage par pipetage doucement monter et descendre plusieurs fois. tampon de lavage MOPS peut être utilisé pendant 2 jours si elle est conservée à 4 ° C.
      1. 40 ml de MOPS tampon de lavage utilisé 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml dH ₂ O, et 40 pi de Tween-20.
      2. Embryons fixes peuvent être conservés à 4 ^° C pendant 2 jours.
         NOTE: Si le stockage des embryons fixes plus, puis ajouter de l'azoture de sodium à 0,2% en MOPS tampon de lavage pour empêcher la croissance bactérienne.
2. Préhybridation
   1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et ajouter 180 ul d'un rapport de 2: 1 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution par pipetage doux à plusieurs reprises, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante. un tampon d'hybridation est constitué de 70% de formamide, 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl, 1 mg / ml de BSA et 0,1% de Tween-20.
      1. Pour 40 mL utilisation du tampon d'hybridation 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml dH ₂ O, 0,04 g de BSA, et 40 pi de Tween-20. Bien mélanger par tourbillonnement, ajouter 28 ml de formamide, et le vortex à nouveau.
   2. Retirez le rapport 2: 1 de MOPS laver et les tampons d'hybridation et ajouter 180 ul d'un rapport 1: 2 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante.
   3. Avant hybridation de sonde mélanger délicatement les embryons dans 100 - 150 pi de tampon d'hybridation. Incuber les embryons à 50 ° C pendant au moins 1h.
      NOTE: L'incubation des embryons nuit est acceptable. Avant l'incubation, sceller les puits avec une feuille adhésive afin d'éviter l'évaporation.
3. Hybridation
   1. Dans un tube séparé ajouter 0,1 à 0,3 ng / pl de sonde et 500 pg / ml d'ARNt de levure dans un tampon d'hybridation, puis doucement vortex pour créer une solution de sonde. ARNt de levure est ajoutée à la solution de la sonde pour réduire la liaison non spécifique de la sonde anti-sens. Préchauffer cette solution à 50 ° C et le tampon d'hybridation aspirat.
   2. Mélanger les embryons pré-hybridés dans 100 ul de la solution de sonde, sceller avec une feuille adhésive, et hybrident à 50 ° C pendant 2 à 7 jours en fonction de la sonde (la sonde foxq2 peut être mis à incuber pendant 2 jours).
      NOTE: Les temps d'incubation peuvent varier en fonction de la sonde. Certains gènes exprimés à des niveaux faibles nécessitent jusqu'à une incubation de 7 jours. plaques à 96 puits peuvent être placés dans une boîte d'humidité comme une assurance contre l'évaporation si les ADHESfeuille ive ne parvient pas à sceller correctement.
   3. Laver 5 fois à 50 ° C avec 180 pi de MOPS fraîchement préparé le tampon de lavage pour un total de 3 h. Ensuite, laver 3 fois (15 min) avec 180 pi de MOPS tampon de lavage à température ambiante. Rappelez-vous de mélanger les embryons dans le tampon de lavage à chaque fois par un léger pipetage plusieurs fois.
4. Anticorps incubation
   1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et mélanger embryons dans 180 pi de tampon de blocage constitué de 10% sérum normal de mouton et 5 mg / ml de BSA dans MOPS tampon de lavage et incuber pendant au moins 45 min à température ambiante ou à 4 ° C pendant la nuit.
   2. Retirer le tampon de blocage, puis mélanger les embryons dans un tampon de blocage contenant une dilution à 1: 1500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline diluée dans un tampon de blocage. Incuber une nuit à température ambiante dans une plaque scellée pour éviter l'évaporation. NOTE: Ne laissez pas l'anticorps sur plus d'un jour.
   3. Laver les embryons 6 fois (5 min ou jusqu'à ce que les embryons tombent) dans MOPS tampon de lavage à température ambiante. embryons peutêtre stocké pendant une nuit à 4 ° C.
5. Dans le développement in situ
   1. Laver les embryons 3 fois (10 min) à température ambiante avec fraîchement préparée , pH 9,5 tampon constitué de Tris 0,1 M pH 9,5, 100 mM de NaCl, 50 mM de _MgCl2, 1 mM de lévamisole, et du Tween-20 à 0,1%.
      1. Pour 20 ml de tampon pH 9,5 utiliser 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 ml de 1 M de _MgCl2, 20 pi de Tween-20, 16,6 ml dH ₂ O et 0,0048 g lévamisole.
   2. Incuber les embryons à 37 ° C dans un tampon de coloration à l'abri de la lumière. un tampon de coloration est constitué de 10% de dimethyl formamide, 4,5 ul / ml de 4-nitro tétrazolium (NBT) et 3,5 ul / ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) dans fraîchement préparé le tampon à pH 9,5 .
      1. Pour 1 ml de tampon de coloration en utilisant 100 ul dimethylformamide, 4,5 ul de NBT et 3,5 ul BCIP.
   3. Arrêter la réaction de la phosphatase alcaline par lavage 3 à 5 fois dans MOPS tampon de lavage. La réaction wie la sonde foxq2 prend généralement 30 min à 1 h. Certaines sondes peuvent avoir besoin d'une nuit d'incubation soit à la température ambiante ou à 4 ° C.
   4. Mélanger les embryons dans une solution de 70% de lavage MOPS et 30% de glycérol. Le glycérol fournit un indice de réfraction nécessaire pour la microscopie. Les embryons peuvent être conservés dans cette solution pendant plusieurs semaines. Sceller les plaques avec de la paraffine en plastique pour éviter l'évaporation.
6. Préparation de diapositives et de capture d' image
   1. Préparer une diapositive en organisant trois petites bandes de ruban adhésif double face dans un triangle avec de petits écarts entre les bandes sur une lame.
   2. Transférer les embryons dans le lavage de MOPS 70% et une solution de glycérol à 30% au centre du triangle et couvrir avec une lamelle.
   3. Sceller la lamelle en appliquant une couche de vernis à ongles sur les bords de la lamelle.
   4. Capture d'images à l'aide d'un microscope optique composé avec un objectif 20X et une caméra attachée.

Résultats

Dans l'embryon d'oursin , nous avons montré que 3 différents de signalisation Wnt branches (Wnt / β-caténine, Wnt / JNK et Wnt / PKC) ^{4, 25} interagissent pour former un réseau de signalisation Wnt qui régit antéro-postérieur (AP) patterning. Une des conséquences les plus importantes de ces événements de signalisation est que la large exprimé neurectoderme antérieure (ANE) GRN initial devient restreint à un p...

Discussion

La méthodologie présentée ici est un exemple qui illustre le pouvoir d'utiliser des embryons avec une complexité moins génomique et morphologique que les vertébrés à comprendre les voies de signalisation de la transduction et GRNS régissant les mécanismes de développement fondamentaux .. De nombreux laboratoires utilisent des tests similaires au début du développement de l'oursin à disséquer le voies impliquées dans d' autres événements de spécification du destin cellulaire de signalisatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G